人诱导多能干细胞（iPSC）技术的最新进展表明，iPSC在再生医学中的应用已成为现实。众多挑战阻止了iPSC在众多组织的发展以及各种疾病的治疗中的应用。治疗应用中的一个关键问题是要移植到患者体内的细胞产品的安全性。在这里，我们提出了新的方法来检测所有三个胚系的定向分化的细胞之间的残留未分化的iPSC。从单细胞RNA序列数据中选择在未分化的iPSC中特异性表达并高度表达的标记基因，以对分化的细胞产物中残留的未分化细胞进行强大而灵敏的检测。ESRG（与胚胎干细胞有关），CNMD（软骨调节蛋白）和SFRP2（分泌卷曲的相关蛋白2）与残留未分化细胞的实际含量具有良好的相关性，可用于通过qPCR高度灵敏地检测残留细胞。另外，这样的标记物可用于检测来自各种分化细胞的残留未分化细胞，包括用于内胚层谱系的肝细胞和胰腺细胞，用于中胚层谱系的内皮细胞和间充质细胞以及用于外胚层谱系的神经细胞。我们的方法有助于可靠的验证，并且可以通过排除未分化的iPSC来增强细胞产品的安全性。
诱导多能干细胞（IPSC）技术可以铺平，为患者获得再生医学和疗法的好处的方式1，2，3。从理论上讲，iPSC有可能分化为我们体内的任何类型的细胞，并且已经开发出了将iPSC分化为特定细胞类型的方案，包括神经细胞，心肌细胞，软骨细胞，视网膜色素上皮细胞，胰岛细胞和肝细胞4。除了标准的2D培养外，还探索了几种方法用于直接细胞分化。有机样技术已经成为一种工具，可以模仿干细胞中的微型器官，并使用iPSC技术将它们培养成芽5，6，7，8，9，10，11，12。我们还先前开发了用于生成多细胞三维小型化肝原基从多能干细胞组织体的方法 13，14，15。
为了将此类iPSC技术应用于再生医学并为患者提供潜在的益处，研究人员正在努力确保移植后iPSC衍生细胞的功能性和安全性。例如，iPSC集的安全性已经通过各种方法，如L-Myc的应用，而不是c-Myc的蛋白，使用非基因组整合的方法，和未分化细胞的验证增强16，17。然而，它是必不可少的，以确保未分化的细胞是从分化的细胞，这可能在移植活动中使用排除在外，因为表现出多能性细胞具有产生畸胎瘤的能力18，19，20。
若干报告已经探索排除和/或在分化的细胞检测未分化细胞的策略21，22，23。一种方法在保持iPSC状态的同时在分化细胞中培养未分化的细胞，并且可以有效地检测分化细胞中的未分化细胞22。此外，可以修改生长培养基，以从心肌细胞24中排除残留的未分化细胞。据报道，使用细胞表面标志物进行细胞分选可以纯化用于衍生多巴胺能神经元的中间细胞谱系25，而LIN28A（Lin-28同系物A）可用于检测iPSC衍生的视网膜色素上皮细胞（RPE）21中已残留的未分化细胞，该细胞已应用于患者。此类方法通常针对特定的分化方案进行了优化，并不总是适用于其他谱系。因此，开发更通用的方法以促进检测分化细胞中残留的未分化细胞至关重要。在这里，我们报告了一种方法，用于在所有三个胚层中检测iPSC衍生细胞中未分化的细胞。
LIN28A（以前称为LIN28）先前已被报道是iPSC衍生的RPE 3中残余未分化iPSC的标记。检查LIN28A的表达以验证LIN28A在检测iPSC向肝谱系细胞分化过程中残留的未分化细胞中的潜在应用。尽管LIN28A在肝内胚层（HE）中高表达，但在未成熟肝细胞（IH）阶段仍保持不变（图 1a和S1）。我们考虑了两种可能的解释。一个是LIN28A在肝谱系细胞中表达；因此，不适用于检测肝谱系细胞中未分化的iPSC。另一个可能的解释是LIN28A实际上是未分化的iPSC标记，在本研究中，分化细胞中存在未分化的iPSC。为了探讨上述情况的可能性，我们评估了发育中的小鼠肝脏中的基因表达，并观察到肝细胞在肝脏发育过程中表达了一定量的小鼠Lin28a（图 1b）。该结果表明Lin28a在肝细胞分化过程中表达，可能不适合检测已分化但未成熟的肝祖细胞中的未分化细胞。
LIN28A不适合在肝分化过程中检测未分化的iPSC。（a）从iPSC肝分化过程中人LIN28A的表达。DE，定形内胚层；HE，肝内胚层；IH，未成熟的肝细胞；MH，成熟的肝细胞。相对表达水平通过每个样品中18S rRNA的量进行标准化。（b）在肝脏发育过程中小鼠Lin28a在肝细胞中的表达。对于从胚胎第9.5天（E9.5）到出生后第3天（P3）的样品，从非造血（CD45-TER119-）细胞中分离了总RNA。对于8周（8w）的旧样品，通过离心分离肝细胞级分。
随后，我们评估了本研究中分化细胞中是否存在未分化的iPSC。我们使用了“重新播种方法”，通过这种方法，我们重新播种了分化的细胞，并在iPSC维持状态下将其培养了约1周，以衍生未分化的细胞集落，以便于直接观察培养物中未分化细胞的污染22。
为了验证这种重新接种方法，我们将未分化的iPSC掺入（混合）到分化的细胞中，并在我们的条件下检测到至少0.0025％的掺入的未分化细胞（数据未显示）。值得注意的是，该方法是可靠的，并且培养中接种的细胞越多，检测限可以降低的越多，尽管它需要至少1周才能生长未分化的细胞集落。在三个独立的实验中，当分别以8×10 4细胞/ cm 2和1.6×10 5细胞的密度接种细胞时，从HE细胞中未检测到未分化的细胞集落。结果表明LIN28A不适合检测肝分化中未分化的iPSC（图 1和下文）。
我们以前曾报道过使用单细胞RNA测序（scRNAseq）从二维培养14下的多能性重建肝细胞样谱系发育。我们探索了scRNAseq数据，并选择了符合以下标准的基因：（1）在iPSC阶段进行特异性表达，以排除在定向肝分化过程中表达的基因；（2）在iPSC中进行高表达，从而即使在高水平的条件下也能进行高水平且灵敏的检测低水平的未分化iPSC污染，以及（3）iPSC与靶细胞（即肝内胚层（HE）细胞）之间的表达水平存在明显差异。
如图2a所示，选择了十二个基因， 它们在iPSC中表达高，特异性强。使用定量逆转录聚合酶链反应（qPCR）和ESRG（与胚胎干细胞相关），SFRP2（与卷曲卷曲相关蛋白2），CNMD（软骨调节蛋白，也称为LECT1 ），SOX2（SRY-框2） ，THY1（THY-1细胞表面抗原），USP44（泛素特异性肽酶44） ，VSNL1（Visinin像1） ，和SPP1（分泌磷蛋白1）被选择用于进一步的分析（图 2b中）。还使用几种iPSC品系检查了标记基因，以排除克隆特异性变异。我们证实，在其他几条iPSC系中刺激分化后，这些基因被显着下调（图 S2）。我们通过液滴数字PCR估算了一个未分化iPSC中这些标记的实际RNA计数（图 S3）。这些结果表明，不仅未分化的iPSC中的表达水平是关键的，而且分化细胞中的下调也是重要的。
鉴定候选基因以检测肝分化过程中未分化的iPSC。（一）单细胞RNA序列分析确定了新的候选基因。上面的插图和彩色列表示从未分化的iPSC到成熟肝细胞（MH）的分化谱系。DE：定形内胚层，HE：肝内胚层，IH：未成熟肝细胞。（b）肝分化过程中标记基因候选物的qPCR分析。肝分化过程中基因表达的下调。相对表达水平通过每个样品中18S rRNA的量进行标准化。
结果表明该基因符合上述标准，作为检测分化细胞中残余未分化细胞的候选标记基因。
我们探讨了候选基因的表达水平是否与残留的未分化iPSC相关。为了获得实际的剩余未分化iPSC而不是掺入未分化iPSC，我们评估了各种iPSC衍生的细胞，发现如果我们使用传代数超过35的iPSC，则倍增时间变得快于20.5 hr，这证明与增加剩余的未分化iPSC数。我们将这种超传代细胞用作分化后实际残留未分化iPSC的模型（图 S4）。
评价各种样品的基因表达，并同时在iPSC维持状态下培养。ESRG，CNMD，SFRP2，SOX2，和NANOG被公相关26，27（R≥0.6）与剩余的未分化iPSC的数目，而OCT4和LIN28A未用的剩余的iPSC（图公相关 3A）。进行了掺入实验以确定掺入的iPSC的低数量与基因表达之间的相关性。ESRG，CNMD，SFRP2与未分化iPSC 的加标数量有很好的相关性（r≥0.9），而SOX2，OCT4和LIN28A与iPSC的加标数量没有很好的相关性（图 3b）。
标记基因表达与实际残留未分化细胞的相关性。（a）HE中基因表达与残余未分化iPSC之间的相关性。X轴代表qPCR的相对基因表达，Y轴代表当HE细胞以8×10 4细胞/ cm 2的密度重新接种时，每cm 2的实际残留菌落数。（b）掺入的iPSC与新型标记基因的基因表达之间的相关性。X轴代表qPCR的相对基因表达，Y轴代表未分化iPSC百分比的加标。（c）残留未分化iPSC对新标记和众所周知的iPSC标记基因的检测限。* p值<0.05。所有相对表达水平通过每个样品中18S rRNA的量进行标准化。
通过评估是否可以将某些掺入细胞与HE样品中的未掺入细胞区分开来计算检测限。ESRG，CNMD和SFRP2的检出限分别为0.005％，0.025％和0.025％（图 3c），而SOX2，NANOG和OCT4的检出限分别为1％，5％和2.5％。LIN28A不能区分来自HE细胞的加标样品中未分化的iPSC的5％。因此，ESRG和CNMD被认为适合灵敏检测残留未分化的细胞。
我们想知道标记基因是否可用于检测来自其他细菌层的iPSC衍生谱系中残留的未分化iPSC。肝细胞属于内胚层细胞谱系。我们还检查了胰腺细胞，作为内胚层谱系细胞。分化后标志物基因表达显着下调，并且通过培养未检测到残留的未分化细胞（数据未显示）。随后，我们评估了iPSC衍生的中隔横隔间充质（STM）/间充质细胞（MC）和内皮细胞（EC）作为中胚层衍生的血统15。标记基因在STM / MC和EC中被下调（图 4a）。通过培养方法未检测到残留的未分化iPSC。结果表明标记物也可用于中胚层评估。
新型标记适用于检测来自三个细菌谱系的残留细胞。（a）基于基因表达成功分化了中胚层和外胚层谱系细胞。分化细胞的代表性图像和每个谱系的标记基因表达。酒吧：500 um。（b）在每个谱系的分化过程中，标记基因均被下调；（c）在每个谱系中，残留的iPSC 均被下调。相对表达水平通过每个样品中18S rRNA的量进行标准化。（d）通过流式细胞术通过ESRG基因表达smFISH检测未分化细胞。阳性级分特别包括染色的ESRG阳性细胞。酒吧：10 um。
神经元细胞谱系也被评估为外胚层衍生谱系。在神经c细胞和神经干细胞中，标记基因ESRG和CNMD而不是SFRP2被下调（图 4a–c），而在培养期内的分化过程中LIN28A未被下调。使用培养方法未检测到残留的未分化iPSC。结果表明标记基因也适用于外胚层来源的谱系。为了巩固上述观察结果，我们采用了另一种方法，使用市售的分化试剂盒来衍生三个胚层衍生的细胞（图 S5）。衍生出三个生殖系细胞，并进行qPCR分析和培养评估。根据结果，ESRG和CNMD是高度敏感和强大的标记物，用于检测分化为三种生殖细胞谱系的人iPSC衍生的细胞产物中的残留未分化细胞。我们还探索了另一种检测ESRG表达的方法，以扩大可应用的标志物范围。我们应用了单分子FISH（smFISH）方法，然后进行了流式细胞仪分析。根据结果，smFISH也可用于检测分化细胞中的ESRG +细胞（图 4d）。
人iPSC在再生医学中的应用可以使患有多种疾病的患者受益匪浅。研究人员和医生正在尝试尽快提供新颖疗法，同时仔细评估此类新颖疗法的安全性。在这里，我们描述了一种新的方法来验证分化细胞中残留的未分化iPSC。我们评估了LIN28A作为残余未分化细胞的标志物，发现除了在神经元分化的早期阶段，它不适合检测肝细胞分化中的残余细胞。
我们确定了几种适合肝细胞分化的标记基因，包括ESRG，CNMD和SFRP2。这些标记基因满足了一些要求，作为残留未分化iPSC的标记。这些基因在iPSC阶段高度特异性地表达。它们在分化后立即下调，并且iPSC与靶细胞（即HE）之间的表达水平存在相当大的差异。这些特性即使在低水平的未分化iPSC污染下也可以进行高水平和灵敏的检测。此外，ESRG和CNMD适用于源自其他细菌层的其他细胞。因此，该方法对于检测来自三个胚层的细胞中残留的未分化iPSC是快速而可靠的。在本研究中鉴定的标记包括众所周知的iPSC基因，例如ESRG；但是，并非所有的“ iPSC基因”都适合检测残留的未分化细胞。实际上，尽管SOX2或NANOG是仅在iPSC中表达的众所周知的iPSC基因，但与本研究中鉴定的基因相比，这两个基因对残留iPSC的检测限相对较高。LIN28A已有报道称其为残留细胞标记，但是我们观察到与基因表达和实际残留细胞数量的关系较低。还报道了其他几种检测和消除未分化iPSC的方法，包括利用microRNA-302，细胞毒性病毒载体，rBC2LCN凝集素，药物，抗体或蛋氨酸去除。这些方法可能是的检出限的目标产物，并且还，上正在进行的研究可能需要产品的附加的评价，并建立分化方案的优化这些方法的的适配之间不同23，24，28，29，30。然而，重要的是要验证所采用的检测方法是否适合其细胞产物。
当前，大量研究正在探索iPSC技术在再生医学中的潜在应用，以便可以在不久的将来见证其实际应用。尽管没有确保技术安全的完全可靠的策略，但评估细胞疗法中采用的技术和产品仍然至关重要。当评估大量细胞时，用于检测未分化iPSC污染的任何方法中至少有两个瓶颈。如果在检测限内分析了大量细胞，则剩余iPSC信号将被其他分化细胞的信号抑制。此外，在验证测定中可以输入的产物数量（例如可以进行qPCR的cDNA数量）存在一些限制。为了在某种程度上克服这种局限性，应将要评估的细胞分为多个孔，并在数十个孔中运行qPCR。开发一种比qPCR更为灵敏的方法来解决此类局限性也至关重要。但是，我们的方法提供了一种简单，高度灵敏且可靠的方法来进行验证，进而通过促进排除未分化的iPSC等污染物来提高细胞产品的安全性。我们以前已经开发了一种从多潜能干细胞生成多细胞3D微型化肝原基器官的方法（iPSC-肝脏芽：iPSC-LB）我们的方法提供了一种简单，高度灵敏且可靠的方法来进行验证，进而通过促进排除未分化的iPSC等污染物来提高细胞产品的安全性。我们以前已经开发了一种从多潜能干细胞生成多细胞3D微型化肝原基器官的方法（iPSC-肝脏芽：iPSC-LB）我们的方法提供了一种简单，高度灵敏且可靠的方法来进行验证，进而通过促进排除未分化的iPSC等污染物来提高细胞产品的安全性。我们以前已经开发了一种从多潜能干细胞生成多细胞3D微型化肝原基器官的方法（iPSC-肝脏芽：iPSC-LB）13，14。此外，我们最近报告了完全由iPSC（所有iPSC-LB） 15生成的iPSC肝芽，包括iPSC-HE，iPSC-EC和iPSC-STM / MC。本文介绍的方法可用于临床环境中所有iPSC LB的安全性验证。
人iPSC系TkDA3-4由东京大学（江户晃司博士和中内博光博士）提供，1231A3、1383D2、1383D6，Ff-I01和Ff-I01s04由京都大学提供（信谷博士）。山中，冲田圭辅博士和中川雅人博士）。将所有iPSC系保持在AK02N（Ajinomoto Co.，Inc。）上的层粘连蛋白511-E8片段（iMatrix-511 TM，由Nippi，Inc。提供）上。先前已经描述了分化肝细胞的详细程序15。简而言之，将细胞在补充有2％B27、50 ng / ml Wnt-3a和100 ng / ml激活素A的RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific）中孵育6天，以得到DE。使用补充有20％KnockOut血清替代品（Thermo Fisher Scientific），1％DMSO，0.1 mM 2-ME，0.5％L-谷氨酰胺和1％NEAA的KnockOut DMEM培养基（Thermo Fisher Scientific）来获得HE和IH。HBM（Lonza Bioscience）补充了不含EGF 的Single Quotes TM试剂盒（不含EGF的HCM），5％胎牛血清（FBS），地塞米松和OSM来获得MH。
横滨市立大学和东京大学伦理委员会批准了对人类iPSC的使用。
为了检测和量化分化细胞中残留的未分化细胞，我们采用了Tano 等人描述的方法。22。简而言之，在存在岩石抑制剂Y-27632的情况下，将细胞与胰蛋白酶-EDTA分离，并用StemFitAK02培养基接种在lamin511-E8包被的培养皿上，密度为8×10 4细胞/ cm 2。每天更换不含Rock抑制剂的StemFitAK02培养基。培养7天后，将细胞用SOX2抗体免疫染色并计数SOX2 +集落。认为一个集落来自一个残留的未分化细胞。
细胞用4％多聚甲醛固定15分钟，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次。细胞膜用PBS（PBST）中的0.1％TritonX-100渗透10分钟，并用PBST中的5％FBS封闭。应用抗SOX2和TRA-1-60的一抗（Cell Signaling Technologies），然后用二抗染色。
使用荧光显微镜（BZ-X710，基恩士，大阪，日本）获得SOX2和Tra-1-60免疫染色后的全孔图像。手动计数菌落，并以每平方厘米的数量描述。
如图所示，未分化的iPSC掺入，即以0.0025％至5％的比例混合到HE细胞中。
内皮细胞和间充质细胞如先前所述15获得。iPSC-NSC如先前所述31导出。使用qPCR和流式细胞术评估基因表达。以下抗体用于流式细胞仪分析：PE偶联的小鼠抗人CD140b（PDGFRB; 558821，BD Biosciences）; 与APC结合的抗人CD166（ALCAM; 130-119-809，Miltenyi Biotec）; 抗人CD105，人CD73和人CD90（MSC表型试剂盒； 130-095-198，Miltenyi Biotec）；FITC偶联的小鼠抗人CD31（557508，BD Biosciences）; PE偶联的小鼠抗人CD144（561714，BD Biosciences）。
使用市售试剂盒STEMdiff Trilineage分化试剂盒（Stem Cell Technologies），可分化出三胚层衍生的细胞。根据制造商的说明衍生细胞。使用qPCR评估基因表达。使用FOXA2（07-633，Millipore）和SOX17（AF1924，R＆D）进行内膜免疫，T（AF2085，R＆D）和NCAM（362502，BioLegend）用于中胚层，PAX6（ab5790，abcam）和外胚层的NESTIN（MAB5326，Millipore）。
对于发展小鼠肝细胞的基因表达分析，重新分析了已发表的微阵列数据（GSE46631）13。使用R studio（https://www.rstudio.com/）14重新分析已发布的单细胞RNA序列数据（GSE81252和GSE96981）。使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）和Universal ProbeLibrary（Roche）根据标准程序进行qRT-PCR分析。如先前所述，使用分支的DNA探针执行smFISH程序32。
如上所述制备cDNA。ddPCR反应混合物的组成如下：1×ddPCR探针超级混合物（No dUTP）（Bio-Rad），1μM正向和反向引物，250 nM UPL探针（Roche）和12.5 ng cDNA。使用QX200液滴发生器（Bio-Rad）产生液滴，并根据制造商的说明进行PCR反应。热循环条件如下：在95°C的条件下为10分钟，在90°C的条件下进行40次热分析，包括在95°C的条件下为15 s，在60°C的条件下为60 s，然后在98°C的条件下保持10 min，并保持在15°C的温度下。PCR之后，使用QX200 Droplet Reader（Bio-Rad）和QuantaSoft（Bio-Rad）分析样品。通过比较阴性对照（蒸馏水）的信号分布，手动确定每个基因的荧光幅度阈值。33）计算为浓度（cps / 20μL）/（12.5 ng / 20μL）/ 1000×10。
数据表示为独立实验的平均值±SD。使用Student's t检验评估基因表达的统计学显着性，使用非参数Mann-Whitney U检验评估白蛋白产生量差异的统计学显着性。＜0.05的两尾p值被认为是显着的。
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