单克隆抗体制备- 免疫荧光技术
免疫荧光技术可用于多种抗原的杂交瘤抗体检测，如细胞性抗原（包括细菌和动物细胞）、感染细胞中的病毒抗原和膜抗原等。其操作简单、敏感性高，可直接观察抗原定位等优点，在McAb的筛选与鉴定上具有重要的应用价值。
A、器材和试剂
a. 供检测抗体用的抗原制备—固定细胞片或板，活细胞悬液。b. PBS（PH7.2，0.01mol/L）c. 待检的McAb样品。d. 冷丙酮 e. FITC（异硫氰酸荧光素）或TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明荧光素）标记的抗鼠Ig抗体等 f. 荧光显微镜，磁力搅拌器，离心机，水浴箱等。
B、间接免疫荧光法
a. 固定细胞片的制备：生长在盖片上的细胞（接种或未接种病毒），可直接收获盖片，在PBS中洗涤，用4℃丙酮固定10分钟，空气干燥，置密封容器于-20℃保存备用；单细胞悬液可在盖片上制成涂片，固定方法同上。细胞涂片的制备：将10ul细菌悬液（1×108个/ml）涂抹7×21mm盖片上，自然干燥后，用-20℃丙酮固定10-15分钟，于-20℃保存备用。
b. 盖片在去离子水中湿润后置架上滴加10-20ul杂交瘤上清或其他待检样品；设立阳性、阴性对照；置37℃水浴孵育0.5-1小时。
c. 取出盖片置PBS中用磁力搅拌器洗涤15分钟。
d.盖片置架上，滴加工作浓度的抗鼠Ig的荧光抗体10-20ul，37℃孵育0.5-1小时。
e.同法洗涤15分钟；取出盖片，用延缓荧光碎灭的封载剂（如缓冲甘油，9份甘油加1份PBS）封于干净载玻片上。
f.光显微镜上观察，阳性结果可见特异性荧光（FITC为黄绿色荧光，TRITC为桔红色荧光）。
g. 细胞固定片的制备，也可改在培养板孔中进行，其余步骤同上，在观察结果时，将培养板翻转置于荧光显微镜下，判断标准不变。
C、 细胞的膜荧光染色
完整的活细胞的细胞膜，抗体不能透过。如果细胞在4℃操作，则荧光染色仅限于细胞膜。必须注意死细胞常以非特异性方式吸附大量荧光抗体，因此试验过程中要保证细胞的高活力。活细胞的膜荧光染色大致步骤如下：
a. 制备活性较好的细胞悬液，调节浓度至107个/ml。
b. 在小试管（5×50mm）中加入100ul细胞悬液，再加入100ul待检McAb的样品，混匀，4℃作用30-90分钟。
c. 用洗涤液（PBS 900ml，小牛血清50ml，4%NaN3 50ml）洗二次，每次加洗涤液1-5ml，1000r/min离心5分钟，弃上清。加入100ul荧光抗体，4℃作用30-90分钟。
d. 同法洗涤，将细胞重新悬于20-30ul含10%甘油和10-100ug苯二胺/ml的溶液中；滴加于载玻片上，加盖片封载。
e. 立即在荧光显微镜上检查。
f. 细胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理盐水固定，立即检查，或至少在4℃可保存一周。
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