OX40-OX40L途径为CD4 T细胞应答提供了至关重要的共刺激信号，但是，对于体内和当发生OX40L时至关重要的精确细胞相互作用尚不清楚。在这里，我们证明树突状细胞（DC）提供OX40L，而不是T细胞，B细胞或第3组先天性淋巴样细胞（ILC3s）提供OX40L，对于特效单核细胞增生性李斯特菌（Lm ）。DC的OX40L表达受与NK细胞的串扰调节，IFNγ信号传导至DC以增强OX40L，其机制在小鼠和人类DC中均保持。令人惊讶的是，OX40L的DC表达在慢性肠道Th1反应中是多余的，而ILC3s的表达是必需的。
除了通过肽：主要组织相容性复合物（MHC）复合物的T细胞受体（TCR）参与传递的信号外，生产性T细胞反应还需要共刺激分子之间的相互作用。肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族（TNFRSF）的成员中通过维持增殖，提高存活和引导细胞分化成形的T细胞应答中发挥关键作用1，2，3，4，5。CD4 T细胞的反应特别依赖于OX40 6，对于OX40 -/-和OX40L -/-小鼠，以及OX40 -/-TCR转基因T细胞，在效应记忆应答所有牵连OX40信号7，8，9。此外，缺乏功能性OX40表达的人类患者在攻击10后无法产生快速的效应细胞因子，这与在OX40 -/-小鼠中观察到的CD4 T细胞缺陷完全一致。因此，OX40信号被认为在产生效应CD4 T细胞应答和随后建立CD4 T细胞记忆中都是至关重要的。由于OX40股信令与其同伴TNFRSF成员CD30，其也诱导在T细胞活化途径，也有在这两种分子的作用的潜在冗余2，11，12，13。
尽管在分子水平上对OX40：OX40L的重要性有一些了解，但尚不清楚支持这种共刺激信号的细胞相互作用。1型辅助T细胞（Th1）和Th2应答都是思想是OX40依赖性14，15，16，17，18，而Th17细胞的产生可通过OX40被抑制信号19。在不同的专门的抗原（Ag）的呈递细胞已被描述OX40L的表达20，21沿着T细胞22，先天淋巴样细胞23以及非造血群体24，25; 因此，许多不同的细胞相互作用可能支持在OX40和OX40L缺陷小鼠中观察到的表型。
幼稚T细胞的次级淋巴组织中的激活是通过T细胞的相互作用与T区域内承载的Ag的树突状细胞（DC）开始26，27，28。因此，DC显然是激活T细胞共刺激信号的潜在提供者。然而，在与DC的初始相互作用之后，活化的CD4 T细胞迁移至B区和T区与小泡间空间之间的边界，这表明某些共刺激配体可能是由在不同组织微环境中发生的进一步的细胞相互作用所提供的29。发现从次级淋巴组织中分离的，表达水平最高的OX40L细胞是淋巴组织诱导细胞（现在被认为是第3组先天性淋巴样细胞（ILC3）类型）23和分别位于具体内淋巴结（LNS）和脾的功能上类似于桥接通道的滤泡空间 30，31。鉴于这些ILC3s也发现表达高水平的CD30L的 23，32，他们可能是活化的T细胞通过滤泡的空间内移动的共刺激信号的主要供应商。这种相互作用将与ILC3s支持脾CD4 T细胞反应的证据一致 33。替代地或另外，活化的T细胞可能会受到B细胞 14或其他T细胞 22的 OX40L表达。DC初始引发后是否需要特定的细胞相互作用仍然是一个重要的机械细节，回答这一问题将有助于在体内操纵CD4 T细胞反应的努力。
在这里，我们使用内源性Ag特异性CD4 T细胞对效应细胞因子的报告来仔细解剖体内OX40L的提供。我们的数据显示OX40：OX40L相互作用对于急性系统性单核细胞增生性李斯特菌（Lm）的反应对于功能性Th1效应细胞的产生至关重要）感染，并使用条件性OX40L敲除小鼠，我们证明需要DC而不是T细胞，B细胞或ILC3来表达OX40L。DC表达OX40L取决于与自然杀伤（NK）细胞的串扰，导致早期干扰素-γ（IFNγ）产生，直接向DC发出信号，从而上调OX40L表达。相反，在慢性肠道Th1反应中，DC OX40L表达是多余的，并且需要OX40L的ILC3表达。在一起，这些研究定义了体内OX40L的不同细胞提供者，揭示了取决于应答性质和微环境的这些信号的区分开发生，以引发最佳的CD4效应T细胞应答。
在人类中的研究10和鼠标8，34，35表示效应CD4 T细胞应答是高度依赖OX40。为了更好地了解体内CD4效应细胞功能的共刺激要求，将同时缺失CD30和OX40（CD30 -/- ×OX40 -/-）的小鼠与Great×Smart17A双IFNγ和白介素（IL）-17A报告基因（GS ）小鼠36。这种方法无需体外操作即可报告细胞因子的表达。此外，当结合使用MHCII四聚体评估内源性CD4 T细胞反应时，可以仔细分析CD4 T细胞功能与对Ag特异性CD4 T细胞数量的影响。感染减毒Lm的表达2W1S肽（Lm的 -2W1S）菌株被用作细胞内可与2W1S特异性四聚体MHCII被跟踪细菌感染的急性模型37，38。这个功能齐全的模型提供了一种强大的方法，可以在体内仔细分析强大的Th1反应。评估CD30和OX40缺乏对效应CD4 T细胞反应的影响，GS和GS CD30 -/- ×OX40- / -小鼠在第7天感染后（dpi）的与评估Lm的 -2W1S，露出了大量CD44 喜在两种小鼠品系2W1S-specifc CD4 T细胞群，与不存在的CD30和OX40导致的近似2倍减少总的Ag特异性CD4 T细胞（图 1a，b）。IFNγ的表达，揭示了通过增强的黄色荧光蛋白（EYFP）的表达，仅限于CXCR5 - 2W1S特异性T细胞38，和特别是，EYFP表达CXCR5几乎完全不存在-从GS CD30分离特定2W1S-T细胞- / - ×OX40 -/-小鼠（图 1c，d）。相比之下，CXCR5的数量+滤泡2W1S特异性细胞未发生明显变化（图 1e），与先前的数据一致，即对这种减毒Lm菌株的滤泡T细胞反应不是OX40依赖性的34。Th1相关转录因子T-bet的表达用于鉴定可能无法产生效应细胞因子的效应细胞（图 1f）。中T-bet的号码+ CXCR5 -在不存在CD30和OX40（图的2W1S特异性T细胞减少大约2-3倍 1克，H）。这与eYFP + CXCR5 的十倍损失相比较-2W1S特异性T细胞表明，反应中最严重的缺陷是细胞产生效应细胞因子的能力。为了确定在7 dpi时缺乏产生IFNγ的Th1细胞（响应的峰值）是否反映了这些细胞在初始引发后无法存活，因此在4 dpi评估响应。同样，在反应高峰时观察到，在没有CD30和OX40的情况下，eYFP + 2W1S特异性CD4 T细胞而不是CXCR5 + 2W1S特异性T细胞显着减少（图 1i-1），这表明尚未产生效应子Th1细胞。综合起来，这些数据表明，在原代CD4 T细胞对Lm的反应中-2W1S感染后，在没有CD30和OX40的情况下，Th1效应CD4 T细胞的数量减少了，这反映了产生细胞因子的Th1效应细胞的早期丧失。
为了确定在没有离体操作的情况下CD30和OX40对CD4 T细胞效应子功能的需求，对CD30和OX40（GS CD30 -/-）足够或不足的双IFNγ（eYFP）和IL-17A报告小鼠（Great×Smart17A，GS） ×OX40 -/-）用Lm -2W1S 静脉感染，并在7（a – h）和4（i – l）dpi 分析脾脏反应。一种门控策略，显示了在GS和GS CD30 -/- ×OX40 -/-小鼠中2W1S特异性CD44 hi CD4 T细胞的鉴定以及CXCR5和eYFP的表达。门控CD3 + CD4 + B220-细胞CD11b - CD11c的-细胞; 用于建立eYFP门控的WT细胞（缺少任何eYFP）。数据代表11只小鼠。b枚举2W1S特异性CD4 T细胞。c枚举eYFP + 2W1S特异的CD4 T细胞。d表达eYFP的2W1S特异性CD4 T细胞的百分比。e枚举CXCR5 + 2W1S特异的CD4 T细胞。f 2W1S特异性CD4 T细胞表达T-bet与CXCR5的关系。g T-bet + 2W1S特异性CD4 T细胞的计数。H表达T-bet的2W1S特异性CD4 T细胞的百分比。数据来自3个独立实验（ 每组n = 11只小鼠）。我枚举2W1S特异性CD4 T细胞。j枚举eYFP + 2W1S特异的CD4 T细胞。k表达eYFP的2W1S特异性CD4 T细胞的百分比。l列举CXCR5 + 2W1S特异的CD4 T细胞。数据来自2个独立实验（ 每组n = 7只小鼠）。流式细胞仪图上的值代表百分比；散点图上的条形表示中位数。使用不成对，非参数的Mann-Whitney两尾T检验了统计学显着性试验：* p ≤0.05，*** p ≤0.001，**** p ≤0.0001。
为了确定CD30和OX40对效应T细胞反应的个体贡献，比较了OX40 -/-和CD30 -/- ×OX40 -/-小鼠在7 dpi时的2W1S反应（图 2a）。枚举总计2W1S特异性CD4 T细胞（图 2b），2W1S特异性Th1效应子（图 2c，d）和2W1S特异性CXCR5 +滤泡细胞（图 2e）表明，OX40信号的缺失是造成缺陷的原因。在CD30中观察到-/- ×OX40 -/-老鼠。因此，对于响应峰处的Ag特异性T细胞数量，OX40表达是关键。为了确定CD30是否在Th1效应子群体的功能能力中发挥作用，分别只复制了CD30或OX40的GS小鼠（GS OX40 -/- CD30- / +和GS OX40- / + CD30 -/-）。也产生了。在没有CD30的情况下，单拷贝OX40足以产生正常的IFNγ（eYFP）（图 2f，g）和形成T-bet +效应CD4 T细胞群（图 2h，i）），表明响应的这些方面都不依赖CD30。综合起来，这些实验表明，通过OX40而不是通过CD30的信号对于Lm -2W1S感染诱导的主要Th1反应至关重要。虽然OX40L是OX40的唯一报道配体，但我们通过将OX40L f / f小鼠39与PGK cre小鼠（普遍表达cre重组酶）杂交，从而证实了OX40 -/-小鼠与缺乏OX40L的小鼠一致。OX40L缺陷型小鼠模型。如预期的那样，总OX40 -/-或PGK cre ×OX40L f / f小鼠显示出类似的效应子Th1反应破坏（图 2j-1）。
在感染Lm -2W1S 后7天的应答中确定了OX40：OX40L相互作用在Th1效应CD4 T细胞生成中的特定贡献。在OX40 -/-相对于CD30 -/- ×OX40 -/-小鼠中评估了2W1S效应T细胞反应。一个由2W1S特异性CD44中T-bet与CXCR5的表达。在 CD4 + T细胞在WT，OX40 / - -和CD30 - / - ×OX40 - / -小鼠。b枚举2W1S特异性CD4 T细胞。c枚举T-bet + 2W1S特异的CD4 T细胞。d表达T-bet的2W1S特异性CD4 T细胞的百分比。e枚举CXCR5 + 2W1S特异的CD4 T细胞。为了剖析效应CD4 T细胞产生IFNγ时CD30与OX40的个体需求，将Great×Smart17A×CD30 -/- ×OX40 -/-（GS CD30 -/- ×OX40 -/-）小鼠与CD30杂交-/-或OX40 -/-小鼠，以产生仅具有单一功能拷贝的OX40（GS CD30 -/- ×OX40 +/-）或CD30（GS CD30 +/- ×OX40 -/-）的Great×Smart17A小鼠）。然后评估这些小鼠感染后7天与对照组的2W1S特异性CD4 T细胞反应。f。选通策略，显示了2W1S特异性CD44 hi CD4 T细胞的鉴定及其CXCR5和eYFP的表达；用于建立eYFP门控的WT（没有任何eYFP）。g表达eYFP的2W1S特异性CD4 T细胞的百分比。h T-bet + 2W1S特异性CD4 T细胞的计数。i表达T-bet的2W1S特异性CD4 T细胞的百分比。数据来自3个独立实验（ 每组n = 8只小鼠）。为了确认OX40L缺乏的小鼠表型与OX40缺乏的小鼠表型相关，通过2W1S特异性CD44表达T-bet与CXCR5喜 CD4T细胞在PGK CRE，PGK CRE ×OX40L F / F与OX40 - / -小鼠中进行了评估。j列举2W1S特异性CD4 T细胞。k T-bet + 2W1S特异性CD4 T细胞的枚举。l表达T-bet的2W1S特异性CD4 T细胞的百分比。数据来自2个独立实验（n = 6 PGK Cre小鼠，n = 6 PGK Cre ×OX40L f / f小鼠，n = 9 OX40 -/-老鼠）。流式细胞仪图上的值代表百分比；散点图上的条形表示中位数。统计显着性使用未配对，非参数，秩和检验单因素方差分析与事后邓恩检验测试：* p ≤0.05，** p ≤0.01，*** p ≤0.001，**** p ≤ 0.0001。
继发性淋巴组织内OX40L信号的特定细胞提供者尚待阐明，其中专业的Ag呈递细胞，T细胞和ILC群体都是体内所有可能的来源。我们假设在对Lm -2W1S 的反应中，存在一个重要的OX40L信号的细胞提供者，该信号提供了CD4效应T细胞反应的基础。为了测试这一点，将OX40L f / f小鼠与多种细胞特异性cre菌株杂交，以靶向DC，ILC3，T细胞和B细胞，因为据报道所有这些均表达OX40L 5。通过离体分析脾细胞和cre表达的命运映射，确认了适当群体上OX40L表达的特异性缺失（补充图 1）。）。鉴于其OX40L的表达23，32，在淋巴组织定位31和脾CD4 T细胞应答的支撑33，我们首先假设，被要求用于功能Th1应答OX40L的表达ILC3。为了测试这一点，用Lm -2W1S 感染了Rorc cre与Rorc cre ×OX40L f / f小鼠，并与OX40 -/-对照一起以7 dpi进行了评估。令人惊讶的是，当ILC3缺乏OX40L时，在2W1S特异性应答中未观察到任何缺陷（图 3a–c），表明在脾脏中产生效应子Th1反应不需要ILC3提供OX40L。考虑到Th1效应子反应的缺陷是通过4 dpi建立的，我们假设DC是体内OX40L信号的关键来源。为了首先确认对Lm -2W1S 的2W1S特异性应答取决于与DC的相互作用，使用CD11c cre ×H2Ab-1 f / f小鼠删除了DC的MHCII表达。不出所料，在CD11c +细胞上不存在MHCII表达的情况下，完全废除了2W1S特异性应答（图 3d，e）。然后为了测试正常Th1效应子T细胞反应是否需要DC提供OX40L，CD11c cre ×OX40Lf / f小鼠与CD11c cre和CD30 -/- ×OX40 -/-对照一起感染了Lm -2W1S 。用表面CD11c相比CRE控制，CD11c的CRE ×OX40L F / F小鼠具有2W1S特异性CD4 T细胞的数量显著减少在7 dpi的（图 3F，克）由于中T-bet的大量损失+ CXCR5 -子集（图。 3H-J ）。令人 惊讶的是，CD11c cre ×OX40L f / f小鼠中的缺陷与CD30 -/- ×OX40 -/-中观察到的缺陷相当作为对照，证明DCs表达OX40L绝对是Th1效应子反应所必需的，并且可以解释在完全不存在CD30和OX40信号的情况下观察到的Th1效应子反应受损。尽管这些数据清楚地确定了DCs表达OX40L的重要性，但我们试图进一步证实，在初次应答过程中，也许不是在与DCs相互作用后，对淋巴细胞提供OX40L的绝对要求。因此，B细胞特异性（Mb1 cre）和T细胞特异性（CD4 cre）条件性OX40L缺陷小鼠感染了Lm分析了-2W1S和2W1S特异性CD4 T细胞反应。在任一菌株中，与仅使用cre的对照相比均未观察到显着差异，这证实了对于Lm -2W1S 的正常应答，体内不需要B或T细胞提供OX40L （补充图 2）。总之，这些数据表明，在对Lm -2W1S 的主要应答中，Th1效应T细胞应答需要通过单个细胞源CD11c + DC 提供OX40L 。
为了研究产生Th1效应T细胞的关键细胞相互作用，生成了靶向ILC3s（Rorc cre）或DC（CD11c cre）的条件性OX40L缺陷小鼠。一个 T-赌注与CXCR5的表达通过2W1S特异性CD44 喜在RORC CD4T细胞CRE和RORC CRE ×OX40L F / F小鼠。b枚举Rorc cre，Rorc cre ×OX40L f / f和OX40 -/-对照小鼠中的CD44 hi 2W1S特异性CD4 T细胞。c枚举T-bet + 2W1S特有的CD44 hiRorc cre，Rorc cre ×OX40L f / f和OX40 -/-对照小鼠中的CD4 T细胞。数据来自3个独立实验（n = 11个Rorc cre小鼠，n = 17个Rorc cre ×OX40L f / f小鼠，n = 14个OX40 -/-小鼠）。d代表性的流式细胞仪图显示了感染后7天，CD11c cre和CD11c cre ×H2-Ab1 f / f小鼠脾脏中的CD44 hi 2W1S特异性CD4 T细胞。e CD44枚举hi2W1S特异性CD4 T细胞。数据代表2个独立实验， 每组n = 5只小鼠。f 2W1S特异性CD44 hi CD4 T细胞在CD11c cre，CD11c cre ×OX40L f / f和CD30 -/- ×OX40 -/-小鼠中T-bet与CXCR5的表达。g列举2W1S特异性CD44 hi CD4 T细胞。h T-bet + 2W1S特异性CD44 hi CD4 T细胞的计数。i表达T-bet的2W1S特异性CD4 T细胞的百分比。j CXCR5的枚举+2W1S特异性CD44 hi CD4 T细胞。数据来自3个独立实验（n = 9个CD11c cre小鼠，n = 10个CD11c cre ×OX40L f / f小鼠，n = 15个CD30 -/- ×OX40 -/-小鼠）。流式细胞仪图上的值代表百分比；散点图上的条形表示中位数。通过使用不成对的，非参数的Mann-Whitney两尾T检验在e中检验统计学显着性，在b，c，h – j中检验统计学显着性通过秩和检验单因素方差分析与事后邓恩检验：* p ≤0.05，** p ≤0.01，*** p ≤0.001。
定义提供OX40L所需的细胞相互作用使得能够研究如何在体内调节这一关键共刺激途径的表达。通过用Lm -2W1S 感染小鼠，然后在感染后的不同时间点分析OX40L的脾脏DC表达来评估OX40L DC表达的动力学。尽管脾脏DC明显表达了OX40L的基础表达水平，但Lm -2W1S感染导致OX40L的表达在24小时内迅速上调，然后在感染后72小时再次降至基础水平（图 4a，b）。然后评估同一脾组织中OX40表达相对于OX40L表达的动力学，以更好地理解配体的最大DC表达与受体的Ag特异性T细胞表达之间的关系（补充图 3）。OX40在48h的2W1S特异性CD4 T细胞上明显表达，其中约50％的细胞表达OX40，许多细胞也共表达CD25，据描述由早期Th1效应T细胞表达38。表达OX40的2W1S特异性CD4 T细胞的比例在2 dpi达到峰值，然后迅速下降，以至于在4 dpi之前，绝大多数响应的CD4 T细胞缺乏任何可检测到的OX40表达，并且OX40L的DC表达恢复到基线。因此，OX40和OX40L表达的表达都非常早地集中在响应中，并且OX40表达仅限于具有与Th1效应细胞一致的表型的响应的2W1S特异性CD4T细胞的一部分。
在感染Lm -2W1S 后的不同时间从小鼠分离脾细胞。一个 OX40L的由DC（林表达-（CD3，B220，CD49b），CD11c的+，MHCII +，CD86 +，SIRPα +）来自未感染小鼠和小鼠感染Lm的 -2W1S 24,48和72小时之前。b Lm -2W1S 感染后不同时间表达DC的OX40L的比例，与未感染和PGK cre ×OX40L f / f对照相比。数据代表2个独立实验（n = 5 PGK cre ×OX40L f / f小鼠，Ñ = 7 UN WT小鼠，Ñ = 9的WT小鼠在24小时后Lm的 -2W1S，Ñ 在48小时后= 7的WT小鼠Lm的 -2W1S，Ñ 在72小时后= 6 WT小鼠Lm的 -2W1S感染）。用Great×Smart17A小鼠在感染后24小时评估IFNγ的产生。c代表性的流式细胞仪图显示了NK细胞表达IFNγ。d表达IFNγ（eYFP）的NK细胞百分比。e代表性的流式细胞仪图显示了不同免疫细胞表达的IFNγ。F归因于NK细胞或其他免疫细胞群的总IFNγ的百分比。数据来自2个独立实验（n = 5 GS UN小鼠，n = 12 GS小鼠，Lm -2W1S 后24 天）。克来自WT和IFNγ脾细胞- / -小鼠在感染后与24小时评估OX40L表达Lm的 -2W1S，沿着PGK CRE ×OX40L F / F和未感染（UN）对照。数据来自2个独立实验（n = 5个PGK cre ×OX40L f / f小鼠，n = 7个UN WT小鼠，n = 9 WT小鼠，n = 7IFNγ-/-小鼠）。h代表性的流式细胞仪图显示了Lm -2W1S 后24小时未感染的WT和感染的WT和IL-12p35 -/-小鼠的NK细胞产生IFNγ 。i，j感染Lm -2W1S 后24 h产生IFNγ和MFI的NK细胞的比例。k代表性的流式细胞仪图显示了Lm -2W1S 感染后24小时，WT和IL-12p35 -/-小鼠在DC上的OX40L表达。l Lm感染后24小时，WT和IL-12p35 -/-小鼠中DC表达的OX40L的百分比-2W1S。数据代表1个实验（n = 7只WT小鼠，n = 6只IL-12p35 -/-小鼠）。m代表性的流式细胞仪图显示了Lm -2W1S 感染后24小时，来自IFNγ -/-，WT和CD1d -/-小鼠的脾脏NK细胞表达的IFNγ 。n表达IFNγ的NK细胞百分比。o感染Lm -2W1S 后24小时，DC从WT和CD1d -/-小鼠表达OX40L 。数据代表1个实验（n =每组4只小鼠）。流式细胞仪图上的值代表百分比；散点图上的条形表示中位数。统计学显着性在测试b，克通过使用采用Kruskal-Wallis单因素ANOVA和事后唐恩的测试和在d，我，Ĵ，升通过使用未配对，非参数，曼-惠特尼双尾Ť试验：* p ≤0.05，** p ≤0.01，*** p ≤0.001，**** p ≤0.0001。
虽然可以通过CD40 21刺激体外上调OX40L的表达，但在Lm -2W1S感染后观察到的OX40L的表达迅速上调表明，先天免疫细胞的早期信号将先于活化T细胞表达CD40L。NK细胞有助于鲁棒Th1应答的活化40，41，42，并通过激活的NK细胞更最近，IFNγ释放显露作为通过该佐剂疫苗响应增强Th1应答的机制43。此外，先前已将NK细胞与DC之间的串扰确定为完全激活两个种群的关键机制44。为了研究体内早期产生的IFNγ，GS小鼠感染了Lm -2W1S，并在24小时后进行了评估。与来自未感染的GS对照小鼠的NK细胞相比，在NK细胞上的门控显示出实质性的IFNγ表达（图 4c，d）。此外，此时NK细胞是IFNγ表达的主要来源（约70％），其中T细胞贡献了大部分剩余信号（图 4e，f）。为了询问是否需要这种早期的IFNγ信号来上调DC上的OX40L，野生型（WT）和IFNγ -/-小鼠感染了Lm -2W1S，并在24小时后评估了OX40L的DC表达。值得注意的是，从IFNγ -/-分离的DC对OX40L表达的上调与WT对照相比，小鼠受阻，但高于未感染小鼠中观察到的基础水平（图 4g）。这些数据表明，早期IFNγ导致DC引起OX40L表达增加，但其他信号也可能起作用。在体外，对热灭活Th1应答Lm的所需IL-12 45，46，和IL-12在体内导致降低到电阻的中和Lm的，这可能通过重组IFNγ逆转47。为了评估对IL-12的需求，将IL-12p35 -/-小鼠感染了Lm-2W1S，并在24小时后通过脾脏DC评估NK细胞产生的IFNγ和OX40L表达。在IL-12p35 -/-小鼠中，产生IFNγ的NK细胞比例（图 4h，i）和产生的IFNγ的量（图 4j）显着降低，并且OX40L的DC上调受到损害（图 4k，l）。 ，表明IL-12介导的IFNγ的NK细胞表达与DC OX40L表达有关。我们进一步证实，感染Lm -2W1S 后，来自CD11c cre ×OX40L f / f和OX40L f / f同窝幼仔对照的DCs同样上调IL-12 mRNA的表达（补充图 4）。），表明OX40L缺失的DC产生的IL-12并未受到损害，并且Th1效应细胞的损失不是由于在启动过程中极化受损而引起的。
因为NK细胞的活化可以发生通过IFNγ的非常早期的iNKT表达之后不变NK T（的iNKT）细胞的快速激活和介导48中，我们评估使用的CD1d为的iNKT细胞激活的要求- / -小鼠。用Lm -2W1S 感染WT，CD1d -/-和IFNγ -/-小鼠，并在24小时后评估NK细胞IFNγ的表达。CD1d -/-小鼠的NK细胞显示出与WT对照的NK细胞相当的IFNγ表达（图 4m，n）。此外，在CD1d -/-小鼠中，OX40L的DC表达也未受损（图 4o））。综上所述，这些数据表明，NK细胞对Lm -2W1S的响应并不要求iNKT细胞产生IFNγ，并突显了IFNγ在增强OX40L DC表达中的重要性。
为了研究IFNγ是否可以直接上调DCs上调OX40L的表达，在脾细胞中用重组IFNγ和抗CD40抗体（Abs）作为阳性对照进行体外培养21。用IFNγ培养可诱导DC强烈上调OX40L表达（图 5a，b），表明IFNγ可通过IFNγR信号直接刺激OX40L表达。为了在体内进行测试，生成了CD11c cre ×IFNγRf / f小鼠，并与CD11c cre和IFNγ -/-对照一起感染了Lm -2W1S 。从CD11c cre ×IFNγRf / f或总IFNγ -/-分离的DC小鼠表达的OX40L明显低于对照组（图 5c，d）。CD11c + DCs 对IFNγR表达的流式细胞术分析证实了CD11c cre ×IFNγRf / f小鼠中该受体的有效缺失（图 5e）。最后，来自用重组IFNγ培养的CD11c cre ×IFNγRf / f小鼠的DC 无法将OX40L上调至野生型对照所观察到的水平（图 5f，g）。结合起来，这些数据表明了DC表达的IL-12指示NK产生IFNγ的机制，然后IFNγ直接发回DC以增强OX40L表达并协调产生强大的Th1效应子T细胞反应。
为了确定IFNγ如何引起DC上OX40L上调的机制，进行了体内和体外实验以测试直接相互作用。a代表性的流式细胞仪图显示了用抗CD40 Abs或重组IFNγ培养的脾脏DCs OX40L的表达。b培养后表达DC的OX40L的百分比。数据来自2个独立实验汇集，Ñ = 7 Ç代表从CD11c的流式细胞术图，显示OX40L的DC上表达Cre重组酶，CD11c的酶Cre ×IFNγR F / F和IFNγ - / -感染后的小鼠24小时Lm的 -2W1S。dLm -2W1S 感染后24小时表达DC的OX40L的比例。数据代表3个独立实验（n = 14个CD11c Cre小鼠，n = 11个CD11c Cre ×IFNγRf / f小鼠，n = 7个IFNγ -/-小鼠）。e WT中的DC表达IFNγR与CD11c Cre ×IFNγRf / f小鼠的比例。数据代表2个独立实验（ 每组n = 4只小鼠）。f代表性的流式细胞仪图显示了从WT分离的DC与CD11c Cre ×IFNγR 分离的DC表达OX40Lf / f小鼠，并用重组IFNγ培养。g用重组IFNγ培养后，表达DC的OX40L的比例。数据代表2个独立实验（n = 7个WT小鼠，n = 4个CD11c Cre ×IFNγRf / f小鼠）。流式细胞仪图上的值代表百分比；散点图上的条形表示中位数。统计学显着性在测试的b，d通过使用采用Kruskal-Wallis单因素ANOVA和事后唐恩的测试和在ë，克通过使用未配对，非参数，曼-惠特尼双尾Ť试验：* p ≤0.05， ** p ≤0.01，*** p ≤0.001，**** p ≤0.0001。
尽管NK细胞是表达IFNγ的细胞的最大群体，但Lm -2W1S 感染后24 h明显出现CD3 + IFNγ +细胞，这增加了多种干扰素表达源促成DC活化的可能性。为了更好地了解Lm感染后脾脏中产生IFNγ的细胞的空间分布，在感染后24小时，IFNγ表达被定位在组织切片中。在感染小鼠的脾脏的一些白色牙髓区域内检测到IFNγ的表达（补充图 5）。IFNγ + NK细胞和IFNγ +在脾脏白髓中DC附近以大约相等的频率检测到CD8 T细胞（图 6a，b）。为了在体内特异性测试NK细胞是否是IFNγ的重要来源，将小鼠单独用抗NK1.1 Abs或与抗CD8 Abs组合治疗，然后用Lm -2W1S 感染并在24小时后进行分析。通过流式细胞术证实了该人群中靶细胞的消耗和IFNγ表达的丧失（补充图6），并且在存在布雷菲德菌素A的离体培养后分析脾细胞时观察到了预期的IFNγ表达降低（图6）。 。 6C-E）。重要的是，与IFNγ -/-对照中观察到的情况相比，NK细胞的耗尽导致DC上调OX40L表达的上调受损（图 6f），这表明NK细胞是细胞因子的重要体内来源。在感染了Lm -2W1S的小鼠的脾脏白髓中，由于IFNγ + CD8 T细胞与DC 接近，还用抗NK1.1和抗CD8 Abs的组合治疗了小鼠。但是，这并没有显着降低DC进一步降低OX40L的表达。
为了探索Lm感染后制造IFNγ的细胞的空间分布，将WT小鼠感染Lm并在感染后24小时处死（在收获脾脏前6小时用布雷菲德菌素A处理）。脾脏切片用抗CD8（绿色），Nkp46（NK，品红色），IA / IE（DC，红色）和IFNγ（青色）抗体染色。a照片是与树突状细胞紧密相关的产生IFNγ的CD8和NK细胞的代表性实例，比例尺：4μm。数据代表2个独立实验。b量化 每个树突状细胞接触的产生IFNγ的CD8 T细胞（n = 67）和产生IFNγ的NK细胞（n = 70）的数量（n = 112）在2个不同的脾脏中; 显示了均值和sem，数据来自2个独立实验。为了研究NK细胞或CD8 T细胞早期产生IFNγ的特定作用，在感染Lm -2W1S 之前，给WT小鼠提供αNK1.1或αNK1.1和αCD8单克隆抗体。在感染后24小时评估DC上的IFNγ应答和OX40L表达，并将其与未感染的WT，感染的WT和IFNγ -/-小鼠进行比较。c代表性的流式细胞仪图显示了感染后24 hIFNγ的总产量。d总数的IFNγ +细胞。È IFNγ的百分比+细胞。F感染后24小时表达树突状细胞的OX40L的比例。数据来自2个独立实验（汇集Ñ = 6 UN WT小鼠，Ñ = 6的WT小鼠，Ñ = 6IFNγ - / -小鼠中，Ñ = 6αNKWT小鼠，Ñ = 5αNK/ CD8 WT小鼠）。统计显着性使用普通单向ANOVA与事后Tukey的测试，下面的成功正态性检验测试：* p ≤0.05，*** p ≤0.001，**** p ≤0.0001。
尽管我们的数据表明IFNγ在调节OX40L表达中具有重要作用，但当IFNγ信号被破坏时，DC的OX40L表达仍然高于未感染小鼠，这表明其他信号可能也促进了该配体的上调。为了进一步研究这一点，我们采用了脾细胞的体外培养来筛选其他可能通过DC增强OX40L表达的细胞因子。平行比较了来自WT和IFNγ -/-小鼠的脾细胞，以通过刺激培养物中的IFNγ表达来帮助确定潜在的间接作用。值得注意的是，OX40L在IFNγ -/-中的基础表达脾细胞培养低于野生型对照。如先前观察到的，重组IFNγ强烈上调了OX40L的表达，但是在该测定中，IL-18和TNFα均被鉴定为可以通过DC增强OX40L表达的其他细胞因子（补充图 7）。
已经确定了如何在体内控制响应Lm -2W1S感染的OX40L的DC表达，我们试图确认该途径在人DC中是保守的。通过荧光激活细胞分选术（FACS）将人cDC2分离到高纯度，然后单独培养或与自体FACS分离的NK细胞一起培养（补充图 8）。在这些条件下，重组人IFNγ足以显着增强OX40L表达，这与该细胞因子对人cDC2的直接作用一致（图 7a–c）。通过添加IL-12和IL-15，在与cDC2共培养中激活NK细胞也能够将OX40L表达增强至与重组IFNγ相似的水平。因此，由与NK细胞的串扰导致的直接干扰素γ信号传导至DC的机制似乎也适用于人DC。
为了研究NK细胞串扰是否调节了人DC上的OX40L表达，通过FACS分离了cDC2和NK细胞至高纯度并进行了体外培养。a代表性的流式细胞仪图，显示了在所示条件下培养40 h后OX40L和CD40在cDC2上的表达（CD14 - CD19 - CD3 - HLA-DR + CD1c +）。b在所示条件下表达cDC2的OX40L的百分比。c在指定条件下cDC2对OX40L表达的MFI。数据来自3个独立实验（n = 6个患者样本）。流式细胞仪图上的值代表百分比；散点图上的条形表示中位数。*：统计显着性使用秩和检验单因素方差分析与事后邓恩检验测试p ≤0.05，** p ≤0.01。
我们的数据显示，通过与NK细胞的早期串扰许可的DC的OX40L表达足以在急性系统性细菌感染模型中使Th1细胞扩增并发挥作用。为了询问这种机制是否特定于Lm -2W1S感染所观察到的脾反应，我们试图在完全不同的实验条件下测试对DC OX40L的需求。为此，我们使用减毒沙门氏菌 -2W1S菌株49建立了口服沙门氏菌感染模型，因此能够在引流性次级淋巴组织（肠系膜LNs（mLNs））和非淋巴样效应位点（结肠）中追踪相同的内源性2W1S特异性CD4 T细胞反应。沙门氏菌感染模型已经确定沙门氏菌感染模型不需要在Lm -2W1S 的应答中通过ILC3s表达OX40L 50，这为进一步检验ILC3s通过表达OX40L 50支持粘膜部位CD4 T细胞的潜在作用提供了机会。因此，CD11c cre ×OX40L f / f和Rorc cre ×OX40L f / f小鼠，以及同窝出生的OX40L f / f仅感染和缺乏OX40的对照被感染，并在7天后在结肠中评估2W1S特异性应答（图 8a）。为了帮助评估细胞因子的产生，将不同的OX40L条件小鼠与Great×Smart17A双重IFNγ和IL-17A报告基因杂交。枚举总的CD4 T细胞反应证实了在缺乏OX40的小鼠中肠道CD4 T细胞区室的显着减少（图 8b）51，在条件性OX40L缺陷小鼠中未检测到。令人惊讶的是，在Rorc cre ×OX40L f / f中，特异性地减少了2W1S 特异性CD4 T细胞的数量以及IFNγ +（eYFP +）的比例和数量。，但在CD11c cre ×OX40L f / f小鼠中却没有（图 8c–e），这表明，对于结肠中的效应Th1细胞，需要ILC3s而非DCs表达OX40L。此外，对mLN中应答的评估（图 8f）再次表明，在Rorc cre ×OX40L f / f小鼠中，2W1S Th1应答特别降低（图 8g–i），这表明ILC3s可能在引流中提供了OX40L淋巴样组织，是在结肠内的补充或替代。无论如何，数据清楚地表明，在沙门氏菌的主要反应中-2W1S，不需要DC来表达OX40L即可维持效应子Th1反应。
为了研究OX40L信号在其他Th1感染模型中的作用，感染了GS，GS×Rorc cre ×OX40L f / f，GS×CD11c cre ×OX40L f / f和GS×OX40 -/- ×CD30- / +报告基因小鼠在给药链霉素后24小时，通过口服管饲法检测了肠道病原菌S almonella -2W1S，并在7天后评估了结肠和mLN的反应。a流式细胞仪图，显示GS，GS×Rorc cre ×OX40L f / f，GS×CD11c cre ×OX40L 结肠中2W1S特异性CD44 hi CD4 T细胞应答和eYFP表达f / f和感染后D7时的GS×OX40 -/- ×CD30- / +小鼠。b枚举结肠中的CD4 T细胞。c列举结肠中2W1S特异性CD4 T细胞。d列举eYFP + 2W1S特异的CD4 T细胞。e表达eYFP的2W1S特异性CD4 T细胞的百分比。˚F流式细胞术图，显示2W1S特异性CD44 喜 CD4 T细胞应答并在GS的肠系膜LN的EYFP表达，GS×RORC CRE ×OX40L F / F，GS×CD11c的CRE ×OX40L F / F和GS×OX40 - / − ×CD30感染后D7处的-/ +小鼠。g肠系膜LN中2W1S特异性CD4 T细胞的计数。h枚举eYFP + 2W1S特异的CD4 T细胞。i表达eYFP的2W1S特异性CD4 T细胞的百分比。数据来自3个独立实验（n = 8 GS小鼠，n = 15 GS×Rorc cre ×OX40L f / f小鼠，n = 11 GS×CD11c cre ×OX40L f / f小鼠，n = 6 GS×OX40- / - ×CD30- / +老鼠）。流式细胞仪图上的值代表百分比；散点图上的条形表示中位数。*：统计显着性使用秩和检验单因素方差分析与事后邓恩检验测试p ≤0.05，** p ≤0.01。
这些数据共同证明了OX40L在支持效应子Th1反应中的关键作用，并且在体内，取决于微环境和反应，这些信号的特定细胞提供者。
许多细胞能够将Ag呈递给T细胞，并可能提供对最佳响应至关重要的共刺激信号52。这表明CD4 T细胞可能会在免疫反应的初始阶段与不同的Ag呈递细胞群体相互作用，因为它们会通过次级淋巴组织内的不同微环境移动29。。然而，尽管其与理解如何调节CD4T细胞应答相关，但尚未在体内测试这种模型。在这里，我们提供了针对Th1效应CD4 T细胞的OX40L细胞提供的详细体内解剖，对比了急性全身感染和慢性肠道感染。我们的数据显示，在急性Th1感染模型中，DC提供的OX40L与T细胞，B细胞或对Th1效应器T细胞反应多余的ILC3的OX40L表达至关重要。相比之下，Th1效应细胞对口服沙门氏菌的反应不需要DC OX40L表达绝对需要感染，并且这里绝对需要ILC3s或潜在的T细胞表达OX40L。因此，通过有条件地删除不同免疫细胞群上的OX40L，我们的数据显示，体内存在对正常OX40L提供至关重要的特异性细胞相互作用，这是组织和反应特异性的。
已经确定了产生强烈的Th1应答需要OX40L的DC表达，然后我们可以剖析DC调控OX40L的表达所通过的途径，从而确定NK细胞：DC串扰可确保通过早期IFNγ最佳OX40L的表达。生产信号返回到DC。该机制对于调节人OX40L的DC表达也很明显，表明这是控制该共刺激分子表达的广泛相关途径。但是，很明显，其他促炎细胞因子也可以增强OX40L的DC表达，并在体外培养重组IL-18或TNFα可以通过DC增强OX40L的表达，而这两种细胞因子都需要最佳清除毒性Lm感染53，54。OX40L的DC表达对于 Lm -2W1S的反应至关重要，这可能反映了这种减毒感染的非常急性的性质，导致活化T细胞仅短暂表达OX40，因此推测提供OX40L信号的不同细胞相互作用的时间有限。在较高水平的银维持较长时间的情况下，例如在更多的慢性感染中，OX40的T细胞表达延长，因此在最初的DC启动后其他细胞相互作用变得很重要。
在对沙门氏菌 -2W1S 的反应中，使用Rorc cre删除OX40L会导致引流淋巴组织和效应组织（冒号）中产生IFNγ的Th1 CD4 T细胞丢失。虽然OX40L的T细胞提供不能排除，这些数据与ILC3 OX40L表达肠道T细胞应答的关键一致，显著开发使用免疫缺陷小鼠先前的研究50，55，其中ILC频率都严重扰动31。ILC3在对Lm-的脾反应中缺乏作用2W1S可能反映出急性反应，或者可能只是反映了脾脏中ILC3的频率非常低，以及缺乏ILC3的清晰簇，如在肠道及其引流LN中所见30。在肠道中，显而易见的是，ILC3s不仅在效应T细胞应答水平的限制，以共生细菌的反应56，57也到T滤泡辅助细胞和IgA生产58。因此，ILC3促进某些T细胞反应，而限制其他T细胞反应，表明在肠道免疫中具有关键的调节作用，可能为治疗操作提供有吸引力的细胞靶点59。ILC3与激活的T细胞相互作用的确切位置尚未得到解答。但是，在mLN和结肠中观察到的受损的2W1S特异性反应提示在淋巴样淋巴组织排泄中起作用，mLN的小泡间空间可能是促进此类串扰的关键微环境31。
对Lm -2W1S 的2W1S特异性CD4 T细胞反应已进行了详细表征38，并以大致相等的比例包含T-bet依赖性Th1效应细胞和Bcl-6依赖性卵泡T细胞。人们对这种多克隆反应中单个细胞如何沿着一个分化途径或另一个分化途径被了解的了解很少，但至少部分反映了TCR信号强度60的差异。我们的数据表明，只有大约一半的活化CD4 + T细胞响应Lm的 -2W1S不断表达OX40并分化为Th1效应细胞通过Blimp1的上调和T-bet的，沿着的Bcl-6的抑制35，61。慢性沙门氏菌内在模型中，在ILC3和T细胞上OX40L的缺失再次导致Th1效应细胞数量的显着减少。然而，那些存活的细胞仍表达IFNγ。因此，通过OX40的信号支持Th1效应细胞的扩增和存活，而不是CD4 T细胞的分化9。该手稿的主要发现是，根据响应的性质，OX40L信号的提供是通过完全不同的相互作用实现的，DC和ILC3在体内的关键作用已得到证明。
总的来说，我们的数据表明，尽管许多细胞类型能够表达T细胞的共刺激配体，但在体内，提供这些信号仍需要特定的细胞相互作用。了解这些调节检查点以及在这些情况下如何控制共刺激分子的表达将为更好地操纵T细胞应答带来治疗的益处提供进一步的机会。
除了在曼彻斯特大学产生并运送到伯明翰的IL-12p35 -/-小鼠外，所有使用的小鼠均为C57BL / 6背景并在伯明翰繁殖。使用的菌株为C57BL / 6（WT），CD11c cre，Cd1d1 -/-（JAX股票017294），E8111 cre 62，Great×Smart17A 36，H2-Ab1 f / f 63，IL-12p35 -/-（JAX股票编号002692）64，IFNγ -/-，IFNγRf / f（JAX股票＃025394）65，mT / mG（JAX股票＃007576）66，OX40 -/-，OX40 -/- ×CD30 -/- 13，OX40L f / f 39，PGK cre 67和Rorc cre 68。根据伯明翰大学内政部的规定使用动物。在7–7 IVC笼中，将小鼠置于21°C +/- 2°C，55％湿度（+/- 10％），12h的明暗循环中，并在环境中充实塑料房屋和纸垫。
小鼠感染10 7 actA-缺陷LM-表达OVA-2W1S（Lm的通过尾静脉静脉注射-2W1S，从M.詹金斯博士惠赠）。将细菌在来自单个菌落的10 ml含20μg/ ml氯霉素的LB肉汤中预培养，并在37°C下以200–250 rpm的速度生长过夜。第二天，将1 ml Lm -2W1S接种到200 ml含20μg/ ml氯霉素的LB肉汤中，并在37°C下以200–250 rpm的速度生长，直到OD600为0.6–0.7。然后将液体细菌培养物在4°C，4000 rpm下离心20分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于含15％甘油的LB肉汤中。Lm甘油库存将-2W1S等分到1 ml冷冻管中，并保存在-80°C。通过将细菌的连续稀释平板接种在含有20μg/ ml氯霉素的琼脂上，使用三个随机选择的样品评估细菌原种的活力。给药前，将1 ml Lm -2W1S离心并用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，然后重悬于适量的无菌PBS中，每200μl 获得10 7个细菌。
在给予表达2W1S表位49（Salmonella -2W1S，由Dr. S博士提供的沙门氏菌）的鼠伤寒沙门氏菌BRD509菌株24小时前，通过口服管饲法在100μl无菌PBS中给小鼠20 mg链霉素（Sigma-Aldrich）。（麦克索利）将细菌重悬于足够量的无菌PBS中，每100μl 获得10 9个细菌，并通过管饲法给药。
使用与上一节所述相同的方法制备甘油原液。链霉素被用作选择抗生素。通过随机选择3个样品并将细菌接种到含有100μg/ ml链霉素（Sigma-Aldrich）的MacConkey琼脂（Sigma-Aldrich）上来测试种群的生存力。
NK细胞和CD8 T细胞的耗竭是通过在感染10 7 Lm -2W1S 之前的48小时内腹膜内（ip）施用PBS中250μg抗NK1.1和400μg抗CD8来实现的。Abs由阿斯利康提供。
在无菌条件下制备细胞悬液。
评估条件性OX40L缺陷型小鼠中OX40L表达的实验：评估Ag呈递细胞（如树突状细胞和B细胞）上的OX40L表达，需要用CD40刺激过夜培养。为此目的，以1μg/ ml加入纯化的抗CD40抗体。为了评估OX40L在T细胞上的表达，在10μg/ ml Abatacept和0.5μg/ ml功能级抗CD3ε的存在下，于37°C，5％CO 2下培养2×10 6脾细胞72小时。
评估OX40L在脾脏DC上的表达和调控的实验：总共，将未感染或Lm -2W1S感染的小鼠的2×10 6脾细胞在37°C，5％CO 2下于24孔培养过夜（18-24 h）。单独或与1 µg抗CD40 Abs或100 ng重组IFNγ（Peprotech）一起放入1 ml培养基（RPMI / 10％胎牛血清/ L-Glu /青霉素和链霉素）中的平板中。
检测NK细胞产生IFNγ的实验：将24小时前感染Lm -2W1S的小鼠的脾细胞在布雷菲德菌素A（10 µg / ml）的存在下于培养基中培养3 h，然后通过流式细胞仪进行分析。
用细镊子取脾，并在含有250 µg / ml胶原酶分散酶（Roche）和25 µg / ml DNase I（Sigma）的RPMI中消化25分钟。然后将消化的组织通过尼龙筛网压碎，用Gey's溶液红血细胞裂解缓冲液处理，然后重悬于适当体积的染色缓冲液中。使用前将脾细胞重新过滤。2W1S：IA b的染色MHCII Tetramer和CXCR5在室温（RT）下进行1小时。在+4°C下进行表面染色30分钟。根据制造商的说明，使用FoxP3固定和通透试剂盒（eBioscience）或Cytofix / Cytoperm Plus（BD Biosciences）进行细胞内染色。使用针对以下小鼠因子的抗体：B220（1：300或1：200;克隆RA3-6B2，eBioscience），CCR6（1：100;克隆29-2L17，eBioscience），CD3（1：100或1： 200;克隆145-2C11或17A2; eBioscience公司，BD生物科学公司，或BioLegend公司），CD4（1：200和1：300;克隆RM4 -eBioscience）和TCRβ（1：100；克隆H57–597，Biolegend）。添加了Spherotech Accucount空白颗粒以计算细胞频率。使用FACSDiva 8.0.2软件（BD）在Fortessa分析仪上进行流式细胞术，随后使用FlowJo软件版本10（Tree Star）分析数据。
如先前描述的那样已经执行了步骤69。简而言之，WT小鼠感染了10 4个菌落形成单位LmOVA。在处死前6小时，通过腹膜内注射给予小鼠250μg布雷菲德菌素A。24小时后，对小鼠实施安乐死，并取出脾脏，固定在4％PFA中，并冷冻保存在OCT中。冷冻脾脏的连续切片（厚度为30 µm）在+4°C的潮湿室内用以下Abs染色过夜：抗B220 PB（1：300； 103230，Biolegend），抗CD169 Alexa647（1：300） ; 142407，Biolegend），抗CD8 BV510（1：100; 100751，Biolegend），抗IFNγBV421（1：200; 505829，Biolegend），抗IA / IE生物素（1：200; 107603，Biolegend），或抗NKp46（1：200； AF2225，研发）。为了进行二次检测，然后洗涤切片，并与链霉亲和素-Cy3（1：200; 016-160-084，Jackson Immunoresearch）和抗山羊IgG A647（1：500; ab150131; Abcam）在室温下孵育3小时。通过共聚焦显微镜分析所有切片。DCs和产生IFNγ的细胞之间的相互作用的定量是手工进行的。在富含IFNγ的区域中随机选择DC。对于每个DC，记录产生IFNγ的CD8T细胞的数目和产生IFNγ的NK细胞的数目并取平均值。
人类数据的所有分析均按照相关的道德规范进行。健康献血者在德国DRK德累斯顿获得了知情同意，并获得Charité伦理委员会（EA4 / 059/17）的认可获得了血沉棕黄的大衣。
通过密度梯度离心（Ficoll Paque Plus，GE Healthcare）从血沉棕黄层中分离出外周血单核细胞。去除CD56 +和CD19 +细胞（CD56，CD19微珠和LD柱，Miltenyi Biotec），剩余的细胞用生物素化的抗CD1c Ab（1:50; 130-110-535，Miltenyi Biotec）和CD1c +富集细胞（抗生物素微珠和LS柱，Miltenyi Biotec）。从富含CD1c的馏分中分选出cDC2作为存活的CD14 - CD1c +细胞（补充图 8a）。纯NK细胞从CD56来分类在FACS咏叹调II（BD）+ / CD19 +级分作为可行的CD14 -CD19 − CD3 − CD56 + CD57 −淋巴细胞（补充图 8b中所示）），抗CD14（1:50; 301820，Biolegend），抗CD19（1:50; 302216，Biolegend），抗CD3（1:50，内部产生），抗CD56（1：200， 318306，Biolegend）和抗CD57（1:50，393304，Biolegend）抗体。将自体NK细胞和cDC2以2：1的比例混合，并在指定条件下在补充有10％胎牛血清的RPMI-1640（Gibco）中培养40小时。指出时，以100 ng / ml的浓度加入重组IFNγ（Miltenyi Biotec），并分别以50 ng / ml的浓度加入IL-12和IL-15（均为Miltenyi Biotec）。40小时后，将细胞染色并在FACS Aria II（BD）上使用以下其他抗体进行分析：抗HLA-DR（1：200；内部产生），抗CD86（1：50； 130-114-095） ，Miltenyi），抗OX40L（1：100; 326308，Biolegend），抗CD40（1:50; 334336，Biolegend）和抗CD3（1:50; 47-0036-42，eBioscience）。
所述DC [林-（B220，CD3，NK1.1）的CD11c +，MHCII +，的Ly6C - ]物在感染后与LM-2W1S 4小时排序。根据制造商的说明，使用Mini Kit（Qiagen）从含有1％β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich）的DC缓冲液RLT中提取总RNA。RNA样品在-80°C下保存，直到转化为cDNA。
用SuperScript TM III RT（Invitrogen TM）对 RNA进行反转录ThermoFisher Scientific）使用oligo-dT策略并根据制造商的说明进行操作。要合成cDNA，请在65°C下将1μl的寡核苷酸（dT）引物，1μl的10 mM dNTPs（Invitrogen）储备液和11μl的总RNA在65°C下孵育5分钟，然后置于冰上3分钟 添加以下试剂：4μl的5x第一链缓冲液（Invitrogen），1μlRNase OUT（Invitrogen），1μl的0.1 M二硫苏糖醇（Invitrogen）和1μl的200单位/μl的Superscript III RT（Invitrogen）通过在50℃下孵育60分钟。在72℃下使反应失活15分钟。为了去除与cDNA互补的RNA，加入1μl（2个单位）的RNase H，并将反应混合物在37°C下孵育20分钟。cDNA样品以等分试样的形式保存在-20°C下，以备后用。
cDNA与所述SensiFAST扩增TM SYBR®的Hi-Rox的试剂盒（生物在线子午线Bioscience公司），按照制造商的说明。在ABI PRISM 7900HT序列检测系统（Applied Biosystems TM ThermoFisher Scientific）上进行扩增反应和检测：50℃2分钟，95℃10分钟，[95℃15 s； 100℃。60°C 1分钟]×40。
使用的引物是Il12a p35（Mm_Il12a_1_SG Qiagen QT01048334）和Il12b p40（Mm_Il12b_1_SG Qiagen QT00153643）。每个样品一式三份，并将检测到的mRNA水平标准化为β-肌动蛋白。通过计算每个样品中靶标相对于β-肌动蛋白的相对表达= 2ΔCt（ΔCt= Ctβ- 肌动蛋白 -Ct 靶标）来分析数据。
使用GraphPad Prism（版本8）分析数据。非参数Mann-Whitney，两个尾或非参数Kruskal-Wallis通过事后Dunn检验进行单向方差分析（ANOVA），或在成功的正态性检验之后，使用通过事后Tukey检验进行的普通单向方差分析以确定显着性，其被设定为p ≤0.05。除非另有说明，否则计算中值并将其用于所有分析。
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