单抗纯度、理化特性、与相应抗原的反应性鉴定

单抗纯度、理化特性、与相应抗原的反应性鉴定

单抗纯度的鉴定

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-PAGE、等电点聚焦电泳（IEF）及免疫转印分析（WB）等方法都可用于鉴定单抗的纯度。PAGE、SDS-PAGE、IEF、WB的原理和方法请参阅有关专著，这里不再赘述。

单抗理化特性的鉴定

从实用意义上说，单抗对温度和PH变化的敏感性以及单抗的亲合力都是理化特性鉴定的主要项目，它们可为单抗的使用和保存提供重要依据。其中单抗亲合力测定比较复杂，下面作简要介绍。

抗体亲合力是指抗体与抗原或半抗原结合的强度，其高低主要是由抗体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇（部）和抗原决定簇之间的立体构型的合适程度决定的。亲合力通常以平均内在结合常数（K）表示。

单抗亲合力测定是十分重要的，它可为正确选择不同用途的单抗提供依据。在建立各种检测方法时，应选用高亲合力的单抗，以提高敏感性和特异性，并可节省试剂。而在亲和层析时，应选用亲合力适中的单抗作为免疫吸附剂，因为亲合力过低不易吸附，亲合力过高不易洗脱。

精确测定单抗的亲合力是较困难的，好在实际应用中选择单抗时，通常只需测定各单抗的相对亲合力及其高低排列次序。常用的方法有竞争ELISA、非竞争性ELISA 、间接ELISA、间接法夹心ELISA等，这里仅介绍竞争性ELISA测定单抗亲和常数的方法。其步骤是：

取适宜浓度的纯化抗原包被酶标板，100ul/孔，4℃过夜。洗涤后，加入封闭液（0.5% BSA-PBS，PH7.2）100ul/孔，37℃ 1小时。取一定浓度的单抗，与系列倍比稀释的抗原混合，4℃过夜，使反应达到平衡；必须注意所用抗原浓度至少要比抗体浓度高10倍以上。将平衡后的抗原抗体复合物加入酶标板孔中，100ul/孔，37℃ 1小时。洗涤后，加入适宜稀释度的HRP标记抗小鼠IgG抗体，100ul/孔，37℃ 1小时。洗涤后，加入底物（OPD）溶液，100ul/孔，37℃显色15分钟；2mol/L H2SO4终止反应后，于495nm波长测定各孔的吸收率（A）。按下列公式计算各单抗的亲和常数（K）：

A0/（A0-A）=1 K/a0

其中A0=无抗原时A值；A=采用不同浓度抗原时的A值；a0=抗原总量；K=亲和常数。

单抗与相应抗原的反应性测定

单抗与相应抗原的反应性决定于它所识别的抗原表位，确定单抗针对的表位在抗原结构上的位置，是单抗特性鉴定的关键环节，同时，进一步分析这类表位的差别，可正确评价单抗的特异性和交叉反应性，如一些抗原为同属不同血清型共有，甚至是科内不同属所共有，而另一些抗原表位则是某种血清型乃至某一菌株或毒株所特有。此外，单抗的反应性往往呈现一种或几种免疫试验特异性，这在建株时予以测定，有利于正确使用这些单抗。

单抗反应性测定的方法很多，包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等，选择何种方法依据不同的单抗特性和试验目的而定，请参阅有关论著的详细论述。