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HOXA 13Barrett食管的病因及致癌潜能

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发表时间:2021-06-11 10:59作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

胃肠道反流患者Barrett‘s食管是一种具有远端特征的柱状上皮,易发展为食管腺癌。霍克斯基因是已知的位置依赖的形态学中介。我们在这里展示霍克斯成人肠内共线性,Barrett食管高HOXA 13在干细胞及其后代中的表达。HOXA 13过度表达似乎足以解释表型(通过下调表皮分化复合体)和巴雷特食管的致癌潜能。有趣的是,使用了一个鼠标模型,其中包含一个连接到HOXA 13启动子我们从生理食道远端鉴定出单个HOXA 13阳性细胞,这在人的生理上是镜像的,但在Barrett‘s食管中增加。此外,我们观察到HOXA 13表达赋予细胞竞争优势。因此,我们认为Barrett‘s食管和相关的食管腺癌是这种胃食管扩张的结果。HOXA 13-上皮损伤后表达室。

导言

Barrett食管(BE)和胃肠上皮化生(IM)是食管胃腺癌的重要危险因素。在食管中,与胃食管反流病(GERD)相关的慢性炎症被认为导致Barrett‘s食管(BE),这是一种具有远端胃肠道特征的隐窝结构柱状上皮,位于胃-食管交界(GEJ)上方。BE是食管腺癌(EAC)的前兆病变。1,2在过去的几十年里,这种疾病的发病率有了很大的上升。类似地,幽门螺杆菌-感染可退化为萎缩性胃炎和胃IM,进而可发展为胃癌,而胃癌是癌症相关死亡的第三大原因。3。同样,虽然绝对风险较低,但梅克尔憩室和胃近端食管入口补片中的异位组织分别是腺癌相对于回肠和近端食管其他部位的相对高风险区域。4,5。因此,深入了解BE和胃IM的生物学特性,对于设计合理的胃肠道肿瘤防治途径是十分必要的。

Be的特征是在吻侧存在具有尾状肠表型的细胞。因此,位置规范的失调可能与BE的病因有关。胚胎学和成年期专门组织的吻尾模式的调控在很大程度上取决于两个进化高度保守的基因系统Caudal相关的同源盒(Caudal RelatedHomeobox)的协同作用。CDX)转录因子基因家族和Homeobox基因(霍克斯)集群。我们投入了大量的研究工作来调查……的作用。CDXBe基因定位错位6。然而,这些努力并没有提供令人信服的证据证明这些基因是本病远端表型的主要媒介。7,8。然而,有趣的是,一项基于微阵列的基因表达研究表明,霍克斯Be基因家族9. 霍克斯基因与形态转变和肿瘤有关。10,11。四组霍克斯基因,霍萨霍克斯,已被定义。3‘到5’序列霍克斯基因序列对应于它们沿着轮尾轴作用的顺序。这种特性称为共线性和链接聚类功能。以前,a霍克斯在小鼠胚胎肠道中发现表达梯度。12。异位霍克斯小鼠体内表达可改变肠分化8。一个霍克斯成人肠道的梯度也有报道。13,但这项研究涉及汇集全厚度的肠道标本,限制了数据的解释。尽管如此,我们仍然认为有足够的证据可以促使我们进一步探讨霍克斯基因在胃肠道生理和病理中的位置同一性的表达,尤其是Be基因的表达。

在这里,我们发现上消化道的单个细胞表达远端基因。HOXA 13它们的数量在BE中增加,HOXA 13表达表型上皮化生,促进增殖。

结果

霍克斯成簇基因在胃肠道中的表达在人和小鼠中呈共线关系。

调查霍克斯基因mRNA在小鼠和人胃肠道中的表达,我们观察到与成人和小鼠相似的共线性(图一)。1A为人类霍萨,补充图。1为所有人霍克斯基因与补充图。2的图形表示霍克斯人群和活检的地点(n=3)和鼠标(n=4)胃肠道。最高层霍克斯基因簇在结肠中的表达,除了HOXC集群。对于个别的目录,有一个更高的表达式5‘Hoxa/B上消化道的基因HOXA 5/B5继续前进。在所有霍萨目录、表示.HOXA 13是最高的,仅限于结肠(如图所示)。1A). HOXA 13表达受incRNA调控热尖,它位于5‘到HOXA 1314。因此,热尖HOXA 13有相似的表达模式(附图)。1A)。为霍克斯,所有的副命令基因在远端结肠中的表达都增加了,而HOXC主要分布在近端和回肠区。因此,霍克斯基因的表达与哺乳动物肠道中的位置同源性有关,对于哺乳动物肠道来说,共线性特别强。Hoxa/B目录。

图1:霍萨聚类基因表达沿成人胃肠道呈共线性,但在Barrett‘s食管(BE)、各种化生细胞和食管腺癌(EAC)中表达减弱。
figure1

a 霍萨聚类基因沿着成人的胃肠道(GI)共同表达。n=3)。数字代表相对于食管的mrna折叠变化,因此可以在每个食管内进行比较。霍萨副戒律成员,但不是他们之间。b 霍萨Be患者食管鳞癌中簇基因的表达(英文)n13),柱状内衬食管(CLE)(n=14),为(n=13),选管会(n和胃肠上皮化生(IM)n=12)的特征是5‘霍萨基因。数量代表正常人食管的mRNA折叠变化。c HOXA 13QPCR定量检测胃Be、CLE、IM和胃肠道异型阿片及其相应的生理上皮细胞的表达。鳞状上皮(SQ)Barrett‘s和Be来自同一个人(n=13)。胃入口补片(GIP);n5);健康对照(HC)鳞状食管(n=12);CLE(n=14)n=13);选管会(n=12);胃(n=14;胃IM(n=12);回肠(nMeckel憩室合并胃异位症(MD)n和冒号(n=9)。中位数±IQR,*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. For esophagus, Kruskal–Wallis test with Dunn’s multiple comparisons test (SQ healthy vs. GIP, p=0.015;SQ健康对CLE,p < 0.0001; SQ healthy vs. BE, p < 0.0001; SQ healthy vs. EAC, p=0.0009)。胃和回肠,曼-惠特尼试验(两尾),p < 0.0001. d 霍萨聚类基因,特别是5‘霍萨基因包括HOXA 13,在大肠有较高的表达(n=3技术副本)与小肠比较(n=3技术复制),干细胞(左面板)和分化细胞(右面板)。将小肠的mRNA表达设定为1进行正常化。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. This figure includes no estimate of variance as the empirical Bayes-moderated two-sided t-statistic was used which does not generate a standard error. e5‘霍萨在干细胞和气液界面(ALI)分化培养中,Be中的簇基因表达高于鳞状食管。n=12(BE)对决 n=2(鳞状食管)在技术上重复显示为干细胞培养和n=技术副本中ALI差异样本各1份。将mRNA表达定位于食管鳞状细胞,实现正常。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. This figure includes no estimate of variance as the empirical Bayes-moderated two-sided t-statistic was used which does not generate a standard error. f解除管制HOXA 13临床标本RNA原位杂交检测胃肠道病理组织中的表达。HOXA 13在IM和异位症中表达上调,在结肠幽门和潘氏细胞上皮化生中表达下调。分析每种组织类型的一个样本。g下调HOXA 13表达(修正肽酰脯氨酸异构酶B-)PPIB相对于邻近的非化生组织,观察到潘氏细胞化生。n=5;FC 0.59;p=0.0003)和幽门化生(n=5;FC=0.22;p=0.0001)(下面板)。未配对t检验(两尾)。苏木精和伊红(HE)染色的典型图像,HOXA 13RNA-范围,和PPIB参考基因RNA-范围内的Paneth细胞上皮化生(从结肠)出现在两个腺体的右下角(上面板)和幽门化生(从结肠)在左上两个腺体(中板)。

随后,我们讨论了GIHox编码是否已经存在于GI干细胞阶段,还是仅在分化衍生物形成的情况下才存在的问题。为此,我们使用了Wang等人公开发表的数据。它包含从胃肠道分离出来的人干细胞的mRNA表达,或者作为干细胞培养,或者在气液界面(Ali)中分化。15。对这些数据的分析表明霍克斯干细胞和ALI细胞的基因表达模式相似。霍萨B聚类基因在大肠中的表达明显高于小肠,尤其是5‘。霍萨基因包括HOXA 13(无花果)1D霍萨基因,用于集群HOXB, C,和D见附图。3)。并无明确的规管HOXCD在DataSet中可以看到集群,除了HOXC 10在大肠。因此,霍克斯编码是特定于位置的干细胞的固有特征,并在其衍生物中保持。

HOXA 13Be、GI异位症与GI癌

由于位置表型与Hox在生理上的状态有关,我们随后对其进行了表征。霍克斯在已知的几种化生组织中,mRNA的表达表现为其他肠道部位的形态表型,以及它们的后遗症。正表现出对.的升华HOXA 10, 11,和13,和HOXB 6, 7, 9,和13与正常食管相比,qPCR法检测食管组织中mRNA的表达(图1)。1B和补充图。4),非常类似于结肠霍萨B表达模式。高5‘霍萨基因表达也存在于柱状内衬的食管中,没有杯状细胞(CLE;Be相关条件)、食管腺癌(EAC)和胃IM(见图)。1B,c)。根据对.的管制作用热尖在……上面HOXA 13表达,我们发现热尖在be中也过表达,并与HOXA 13表达模式(附图)5A-C). 霍塔,一个位于HOXC肿瘤进展过程中与染色质重编程相关的簇16也被放大(补充图。5D-f)14。我们得出结论:BE、EAC和各种具有尾部组织形态学特征的元细胞瘤都有。霍萨HOXB典型的尾状胃肠道的表达模式,并伴有HOXA 13表达是突出的特征。异欧阿片,即食道近端的胃入口补片和梅克尔憩室的异位症,是一种具有生理形态的组织,但通常位于不同的位置。这两种异鸦片都有丰富的特征。HOXA 13MRNA表达1CMeckel憩室上皮上皮化生的方向是前部的,而不是后部的,这表明Meckel憩室的情况是例外。关于Be起源细胞的现有假设之一,即可能产生于具有能够产生多种细胞类型的祖细胞的细胞。17。为了研究Be中Hox基因的异常表达是否是在上皮特异性干细胞的水平上建立的,我们询问了Yamamoto等人的公开资料。15,18. 霍克斯获取食管鳞状细胞和BE干细胞及其各自的ALI分化衍生物的基因表达模式。Hox基因在这些地方的干细胞培养物中的表达类似于ALI分化的干细胞(图1)。1E,补充图。3)。在Be干细胞中,5‘的上调霍萨基因(图1.1E)以及HOXB 6, 7, 13,和HOXC 10见(附图)。3),达到与在结肠中观察到的水平相似的水平。因此,与BE相关的另一种Hox编码是在上皮特异性干细胞水平上建立的,并在所涉干细胞的衍生物中保持。

根据共线性理论,与前类组成员相比,13组成员更有可能呈现BE中所见的远端特征。19。第13组成员中,HOXA 13HOXB 13在be中被过度表达,与HOXA 13表现出比HOXB 13在BE,EAC和IM的胃(补充图。4)。因此,虽然Hox基因,如HOXA 11,B6,B9,和B13也是潜在的有趣的候选人,这里我们选择的重点是HOXA 13用于进一步深入分析不同化生组织的基因。AS免疫组织化学HOXA 13未成功,(检测了两种抗HOXA 13抗体,但缺乏特异性),我们采用原位杂交(ISH)方法。HOXA 13进一步证实该基因在不同组织中的非典型表达(如图所示)。1F)。化生在整个胃肠道都有发现。而BE和IM则具有更远的表型,位于远端的结肠幽门和潘氏细胞化生,与炎症性肠病有关,具有更多的鼻端表型。20。因此,下调对.的管制HOXA 13表达式(更正为PPIB作为参考基因表达)相关的邻近非化生组织,可见这些组织(图)。1g,再次支持HOXA 13在位置身份上)。

二进制调节HOXA 13表达

为了更详细地研究健康胃肠道中哪些细胞表达hoxa 13,我们采用了内源性小鼠模型。霍萨13启动子驱动Hoxa13-GFP融合蛋白的表达。在上皮室内,近端表达边界位于从远端到近端结肠的过渡处,如荧光图像和抗GFP IHC染色所见(如图所示)。2A,b和补充图。6A-d获取更大的概览图像)。这个近端的表达边界似乎是克隆性的,有些隐窝表达Hoxa 13,而另一些则没有(见图中的箭头)。2B在图中特写。2C)。这种克隆性的功能后果尚不清楚,虽然超出了本手稿的范围,但却提出了一个有趣的生物学问题。远端Hoxa 13-GFP的表达受肛门鳞状体尺交界处的限制(SCJ;附图)。6E请注意,这一点在图中是不能理解的。2A,因为这部分是为这只老鼠损坏的)。为了研究人类是否也存在Hoxa 13表达的这些局部梯度,HOXA 13在另一组来自不同结肠部位的活检标本中,用qPCR方法检测mRNA的表达。盲肠活检HOXA 13否定,而HOXA 13从回盲瓣到远端横结肠的表达增加,表现出与小鼠相似的表达模式(如图所示)。二维空间).

图2:小鼠和人类HOXA 13表达式在冒号中受到严格的空间控制。
figure2

a一个典型的例子来自3只小鼠的“瑞士卷”结构的大肠Hoxa13-GFP杂合子小鼠模型。星号表示上皮的最远端部分。嵌体的放大显示在面板上。b, ce. b生理Hoxa 13在成年小鼠中表达的近端边界呈片状分布,位于结肠近端和远端之间,以底部面板上的黑色虚线(打开的小鼠结肠的宏观图像)表示。有代表性的抗GFP,IHC和共焦显微镜的图像。箭头表示在Hoxa 13阴性地穴中Hoxa 13阳性的地穴。cHoxa 13的表达为隐窝克隆。这是观察到的n=1。d成人盲肠底部为阴性HOXA 13而积极情绪则会大幅增加(n=5个独立样本)。平均±扫描电镜*p < 0.05, repeated measures ANOVA with Holm-Šídák’s multiple comparisons test, p=0.001。HOXA 13横结肠中mRNA水平正常。eHoxa 13的表达沿着基底-腔轴受到严格的调控。在远端,Hoxa 13沿结肠隐窝的整个下腔轴表达,近端仅在腔侧表达。此外,间充质在上皮下的细胞中有表达,主要在近端结肠。显示了反GFP、IHC和共焦图像。

除了沿着胃肠道的Hoxa 13梯度,上皮性Hoxa 13-gfp的表达也在单个隐窝的基底腔轴上受到严格的调控。近端仅见根尖表达,而远端Hoxa 13-gfp沿地穴的整个下腔轴表达(图1)。2E)。此外,间充质在近端结肠上皮下的细胞中也有表达(如图所示)。2E)。在细胞内,最强烈的信号与细胞核共定位,正如预期的那样,但细胞质染色也可以用核糖体合成来解释。2E).

我们的结论是,HOXA 13表达的空间调控是非常精确、稳健和结肠特异性的,这就提出了在BE中观察到HOXA 13表达的细胞起源的问题。

个人Hoxa 13/HOXA 13-上消化道阳性细胞

无显著表达HOXA 13应用qPCR技术检测BE患者食管鳞状细胞中mRNA的表达(见图)。1C,e),暗示GERD不会引起HOXA 13表达本身。事实上,当两株永生化的食管鳞状细胞(EPC2-hTERT和het-1A)暴露在胆汁酸或胆汁酸中时,只有轻微的作用。HOXA 13观察到两到四倍的低基线表达;如图所示。3A,b),与细胞的相对高度一致。HOXA 13表现出更好的生存治疗,而不是提高表达本身。对欧文等人最近公布的可公开获得的单细胞RNAseq数据库的分析证实了这一点。21。单细胞水平的结果显示,HOXA 13-Be患者正常食管组织中阳性细胞(8%)。在BE组织中,这些HOXA 13阳性细胞的百分比增加到30%,但它们的个体。HOXA 13与正常食管的HOXA 13表达细胞相比,mRNA水平没有增加。3C,d)。同样,HOXA 13-阳性细胞,但不是阳性细胞HOXA 13表达细胞,在胃、早期胃癌和结直肠癌的IM中增加(如图所示)。3C,d)。因此,我们进一步研究了Hoxa 13在我们的样本细胞水平。尽管HOXA 13在上消化道4只小鼠中,只有1只在Q-PCR中检测到mRNA的表达.2)用免疫组织化学方法检测Hoxa 13-GFP小鼠胃中单个Hoxa 13阳性细胞。这种信号从GEJ开始出现在胃的基底外侧,但在沿食管的鳞状细胞和间质中未见(图1)。4A和补充图。7)。这是特别令人感兴趣的,因为GEJ被认为是Be的起源地。17。少量Hoxa 13-GFP阴性无阳性(补充图)。6d,补充图。7D)。后来,我们雇用了ISHHOXA 133例成人GEJ手术标本分析HOXA 13-在人上消化道表达细胞。在这三个样本中,ge连接区都含有一个清晰的阳性信号。HOXA 13MRNA,部分信号在胃近端细胞,而在鳞状上皮和间质细胞中信号更低(见图)。4B和补充图。8a,b)。食管黏膜下腺体(ESMG)21存在于一个样本中HOXA 13阳性(图1.4C)。有趣的是,ESMG对KRT 7+KR5+TP 63+细胞(在GEJ中被假定为原产细胞)22)虽然与HOXA 13不同+细胞,KRT 7+KR5+TP 63+胃内未发现三重阳性细胞。4D)。(请注意,这是为一个样本显示的,我们无法评估可能的可能性。)HOXA 13由于缺乏特异性HOXA 13抗体,与这些三重阳性细胞共表达。我们还研究了HOXA 133例17~20周龄自然流产胎儿GEJ表达,以食管上皮由柱状向鳞状表型转变为妊娠期。我们观察到高度和特异性HOXA 13贲门部表达较少,远端胃及食管上皮较少阳性。4E,补充图。8C,d)。这些数据表明HOXA 13-人类胚胎食管在上皮过渡期存在阳性细胞,成人鳞状食管中阳性细胞减少,而BE则再次增加。因此,人和小鼠成人上消化道的上皮细胞,特别是人类的GEJ和ESMGs,其特征是存在以下几个亚群体:HOXA 13/Hoxa 13阳性细胞HOXA 13/Hoxa 13负环境。

图3:HOXA 13+细胞而非细胞表达水平与化生有关。
figure3

接触胆汁(pH值为7)(a)或酸性(b),在胃食管反流病(GERD)的两个离体模型系统中,轻微诱导胃食管反流病(GERD)的表达HOXA 13在两个原发性永生化食管细胞系中的低水平表达。误差条表示平均值的95%CI。n=4项独立实验。对于Het1a,双尾t-使用测试(p=0.0096 a,p=0.0322(B),对于EPC2-hTERT Dunn的多重比较测试,a(对照对200 M,p>0.99;控制对400 M,p=0.0112;200 M对400 M,p=0.14),单尾t-测试b, p=0.0486。c.的数目HOXA 13-Barrett食管(BE)和肠上皮化生(IM)的阳性细胞较正常食管或胃组织增加。健康和BE食管样本都是从同样的病人身上提取的。平均±扫描电镜显示。n=4人为食管,n=3表示NAG,CAG,n=4对IM,n=1表示GC,n健康结肠=6,n=11代表“儿童权利公约”。图表是基于对单细胞RNA数据的分析。21、GSE 13452082,GSE 8186183。双尾t-食道试验p=0.0443)和冒号(p0.6808),用邓尼特多重比较检验法对胃进行单因素方差分析(P<0.01)。p < 0.0001). d HOXA 13每个单元格的表达式级别不变。表示级别HOXA 13+只有细胞。H健康,巴雷特的食道唠叨非萎缩性胃炎,CAG慢性萎缩性胃炎,胃肠上皮化生,气相色谱早期胃癌启联结直肠癌。n=37对H,n=132表示Be,NA表示NAG,n=CAG=5,n=163对IM,n=69表示GC,n健康结肠=37,n=87来自(C)中提到的个人的单个细胞的CRC。对于GC,统计数据不显示为每个病人没有提供数据。中间线为正中线,上下铰链对应第25至75百分位数,晶须代表最小最大值。

图4:HOXA 13在上消化道的表达。

a胃食管结合部Hoxa 13-GFP杂合子小鼠抗GFP免疫组化代表例(SQ;鳞状上皮,ST;胃)n=3)。Hoxa 13从GEJ(5-6)开始在胃单个细胞中表达,在食管和间质(1-4)中缺失。b HOXA 13RISH在具有代表性的示例中的表达n3与成人GEJ相似,放大板为:a-食管,B-GEJ区,C-近端胃。橙色圆圈表示概览图像中的正信号。c HOXA 13RNA ISH检测人食管粘膜下腺体(ESMG)的表达,放大板为:a-H&E,C,D-ESMG,B,E-鳞状食管。n=1。d在ESMG中发现角蛋白7(KRT 7)、角蛋白5(Krt 5)和p63三重阳性细胞。n=1。e一个具有代表性的17周龄胎儿GEJ的例子综述:a)食管远端分层食管上皮(蓝色),B)GEJ区,C)近端胃上皮(粉红色),n=3。

HOXA 13影响分化潜能和后验

在确定单个HOXA 13阳性细胞存在于生理上消化道,并在BE组织中增强后,我们接下来将开始研究这一群体细胞在BE病因中的潜在作用。为此,我们进一步分析了单细胞rna-seq。21上述数据集。在这项研究中,没有对GEJ进行抽样分析。然而,8%的正常食管细胞表达HOXA 13从t分布的随机邻接嵌入(t-SNE)图中可以看出,Be组织中的细胞与转录重叠。5A)。基因表达分析表明,这些细胞来源于ESMG。5B和补充数据1)21,23。具体而言,与HOXA 13-阴性细胞人口,占人口总数的70%以上HOXA 13-正常鳞状黏膜的阳性细胞为黏膜下标记物。LEFTY 1Olfm 4,被指定为esmg标记,也被描述为be祖细胞的标记。21。此外,HOXA 13-阳性细胞表达粘膜标记物TFF 3, 利兹SOX 9,以及柱状标记和BE标记TFF 1、KRT 7、VIL 1、MUC5B、MUC3A、MUC 13、MUC 1,和CEACAM 5,而角化标记阴性IVL和基底上皮细胞标记物P63(无花果)5B和补充数据1的基因列表HOXA 13-阳性细胞)。在BE中,这些柱状标记和导管标记阳性细胞的百分比在HOXA 13-阴性群体,这意味着在分化过程中,有些细胞可能会失去HOXA 13表达,或者说有不止一个群体产生组织。这将与小鼠数据一致,因为小鼠食道缺乏ESMGS和Hoxa 13阳性细胞。有趣的是,虽然在此数据集中很少见,但在TFF 3+四组细胞均为三倍阳性。KRT 14(基因对)Krt 5), TP 63KRT 721但这些都不是积极的HOXA 13.

图5:HOXA 13细胞表达调控细胞命运。
figure5

a HOXA 13+T分布随机近邻包埋正常食管细胞与BE细胞(t-SNE)基于单细胞RNA表达谱的作图21. b对单细胞RNA seq数据的分析表明,与HOXA 13细胞,HOXA 13+细胞表达黏膜下腺体标记物、Barrett食管标记物(BE),降低正常食管鳞状细胞标记物(p63、IVL)的表达。在BE中没有观察到这种差异。n=846个HOXA 13健康食道中的细胞,n=37HOXA 13+在健康的食道,n=263 HOXA 13Be中的细胞,n=132HOXA 13+细胞进入Be。c HOXA 13-过度表达的内胚层对终末分化具有相对的抵抗力。小鼠胚胎干细胞(MESC)HOXA 13表达从多能干细胞分化为确定性内胚层。分化的最终内胚层细胞的百分比,定义为CXCR 4。+/E-钙粘蛋白+细胞,用流式细胞仪分析(上板)。下面的面板(典型的光学显微镜图像)显示了不同培养物的形态差异。HOXA 13MESCs在分化为确定的内胚层时过度表达和野生型mESCs,诱导细胞层变平,有较大和不规则的形状细胞。d对FACS分析结果的量化结果表明,CXCR 4所占的百分比+/E-钙粘蛋白+细胞减少HOXA 13-在分化条件下过度表达细胞培养物(p < 0.0001). HOXA 13-在分化过程中,表达细胞的扩张速度比对照细胞快(细胞总数增加)p=0.0135)。平均±扫描电镜*p < 0.001, n=4个独立实验,t-试验(二尾)。eBe发展中的细胞同一性模型。这个X轴代表接触GERD诱导剂后的时间(假设单位)。Y轴在胚胎学和病理过程中表现出分化。Z-轴指示胃肠道组织的位置同一性。关于BE的起源细胞有几种理论:它们可能是完全分化的食管或胃细胞,也可能是这些器官内较少分化的细胞(由这些器官上的4个细胞描述)。Y-Z飞机)。无论其位置或分化状态如何,这一细胞或起源可能失去其正确的位置身份或保持其异常的位置身份,并类似于一个明确的内胚层样细胞。这是可视化的蓝色矩形隐藏的细胞与更厚的蓝色轮廓。对于BE中的细胞身份模型,我们的数据表明HOXA 13在GEJ中表达克隆(用橙色描述)可能会超过克隆与另一个位置的同一性,从而为在BE中观察到的远端表型提供了一个解释。

起源于BE段形成的细胞应该能够产生各种分化的细胞类型,表现为结肠、胃、胰腺腺泡或其他表型。24,25。在小鸡胚胎中,HOXA 13调整发展1.5天后的区域化,显示HOXA 13在早期分化中,这一基因对这类多能祖细胞的细胞表型的影响是一致的。26。为了在实验上测试.的影响.HOXA 13关于细胞命运,我们HOXA 13-诱导性多能小鼠胚胎干细胞(MESCs)。通过CXCR 4和E-cadherin的膜表达,可以将这些多能mESCs有效地分化为多能的最终内胚层。5C)。RNAseq进一步证实了这一点,显示出明确的内胚层标记有很强的上调作用,例如Sox 17FOXA 1在这些分化的细胞中,同时多能标记,如奈诺被下调(见补充表)1)。利用独创性途径分析(IPA)进一步分析不同表达基因,发现与“胚胎细胞分化”呈正相关。z=1.82,p=6.38×10−15)。有趣的是,当HOXA 13诱导表达,CXCR 4测定的细胞向确定内胚层分化的效率较低。+/E-钙粘蛋白+表达和形态学评估(图。5C,d)。与减少的单边分化一致,克隆表达HOXA 13显示了更大的扩张(图)。5D).

接下来我们比较了无分化多能体的转录组。HOXA 13-过表达和控制培养物以识别潜在的分子中介物HOXA 13观察到的效果。差异基因表达的ipa分析结果与HOXA 13赋予多能表型。特别是,强迫HOXA 13表达导致“的作用”的提升。奈诺哺乳动物胚胎细胞多能性“类别(z=1.34,p=2.32×10−3),一种涉及SOX 2, 奈诺, TBX 3, Hesx-1,和DPPA-其中1人27,28(见表1有关更多详细信息/结果,请折叠更改,以及q-与这项试验有关的价值观)。HOXA 13表达似乎也下调了wnt信号,可能是通过bmp信号。29。众所周知,Wnt信号可以促进中胚层的分化。30,这些结果与HOXA 13-介导Wnt信号在轴向伸长过程中的下调31。因此,由HOXA 13与维持相对多能表型是一致的,这反过来又会增加室间隔的扩张。

表1的变化和Q值的mRNAs提到的结果一节的主要文本有关的细胞培养模型分析的RNA-Seq。

HOXA 13表达并不能完全阻断mESC细胞的内胚层分化,提示mESC的作用是HOXA 13在这个隔间里仍然是相关的。明确内胚层是整个胃肠道上皮的一个特征,不能区分上、下消化道上皮本身。调查.的作用HOXA 13在这个细胞室里测试我们的预测HOXA 13表达使内胚层易于获得远端表型,我们对CXCR 4进行了分类。+/E-钙粘蛋白+细胞HOXA 13阳性和阴性培养并比较其mRNA表达。HOXA 13上调与确定内胚层细胞形态学有关的基因表达。在IPA分析中,“肌动蛋白细胞骨架信号”被激活最多(z=3.00,p=3.74×10−2)。“RhoA信号”,刺激肌动蛋白聚合,(z=2.12,p=1.12×10−2)也受到刺激。HOXA 13通过微绒毛相关基因的上调来支持远端上皮功能,埃兹尔维尔角蛋白Krt 1920克朗,河豚网络基因,IgG 8,以及外分泌功能相关基因,如Gcnt 3,通常在胃肠道远端上皮中表达。32。此外,还有更多“癌细胞增殖”的转录本(z=1.13,p=1.5×10−6)和“癌细胞瘤”(z=1.13,p=2.22×10−4)类别,例如FGFR 2内克2,被检测到。因此,强迫HOXA 13内胚层分化过程中的表达支持尾状上皮功能和增殖潜能(见表)。1对于折叠变化和q-数值;见补充数据2其他相关分子)。

总的来说,这些数据与HOXA 13-表现出祖细胞表型并具有竞争优势的表达细胞,同时驱动获得一种更远的柱状表型,一旦致力于分化(见图1)。5E).

HOXA 13与1号染色体表皮分化复合体

进一步支持HOXA 13在食管鳞状表型丢失和尾柱型的出现中,我们通过实验研究了其对食管鳞状细胞表型和尾状柱状表型的影响。HOXA 13直接出现在食管细胞模型上。为此,我们使用crispr-ca9技术删除。HOXA 13一种来源于BE患者化生组织的原发单克隆永生化细胞系,其细胞同时表达柱状和鳞状标记。33。三分HOXA 13为了规避潜在的目标效应,选择了敲除克隆。相反,我们引发了慢病毒HOXA 13EPC2-hTERT在永生化食管鳞状细胞株EPC2-hTERT中的表达。对于这些后期的实验,我们使用混合细胞群的慢病毒转导细胞,以避免克隆伪影影响结果。在这两个模型的转录(图。6A)与各自的控制线进行对比。在基因组中有大量的重叠,主要受损失的影响。HOXA 13在bar-T中,与那些受HOXA 13在EPC2-hTERT中,考虑到监管的方向(X)2测试:p=4.74×10−34)(见补充数据3)。对这两个技术上独立生成的数据集的重叠调查限制了偶然发现或单一模型系统偏差的发生率。重叠基因HOXA 13在食管细胞中的表达IL7r, FAM196B, ADAMTS 6, NRG 1, LTBP 1, 日航1, ELL 2,Smad 7, C12ORF75, 阿克塞尔, TIPARP, IKBIP, DUSP 7,和GOLIM 4。被HOXA 13表达SERPINB 13, MYO5C, KLK 7, ANXA 9, TMPRSS 4, TTC 9, MATN 2, TNFAIP 2, RAB27B, HCAR 2,C6ORF 132, EXPH 5, MAP3K5,和FUCA 1。IPA分析结果预测“(恶性)细胞转化”(z=2.00,p=5.81×10−3)和减少“器官炎症”(z=−2.59,p=8.29×10−3基因功能在补充数据中被描述3)在细胞中表达。HOXA 13。有趣的是,HOXA 13抑制表皮分化复合体(EDC);6B,c)。EDC位于1q21.3染色体上,包含与分层鳞状上皮细胞角质层形成相关的多基因簇,如S 100和小脯氨酸区(Sprr)基因。34。在这两种细胞模型中重叠的下调基因中,ANXA 9也与分化角质形成细胞有关。35,和EVPL, SCEL,和KLK 7被修饰的包膜基因36,37,38. EMP 1SERPINB 13下调与胃癌的严重程度有关(EMP 1)和头颈部鳞状细胞癌(SCC)SERPINB 13)39,40。见表1对于折叠变化和q-价值和补充数据3以获得更多与形态学相关的差异表达的分子。已知对维持鳞状表型至关重要的基因区域的下调为改变这种观念提供了机械支持。HOXA 13表达是激发Be表型的基础。

图6:HOXA 13对抗鳞状组织,促进食管细胞的生长。
figure6

a构造了两个模型来研究HOXA 13在胃食管交界处(GEJ)。一种模型采用EPC2-hTERT,这是一种原发性永生化的人食管鳞状细胞株,其特点是低。HOXA 13表达,其中HOXA 13被换上了。第二种模型采用的是Barrett‘s食管(BE)细胞株Barrett’s原代永生化细胞系bar-T,其特征是高度。HOXA 13表达,其中HOXA 13被击倒了。b一例患者食管鳞状细胞的苏木精和伊红(H&E)染色,未显示某些Ch1q21.3表皮分化复合体产物的预期位置,也未显示表皮角质层的其他基因。c HOXA 13在这两个模型系统中,Ch1q21.3表皮分化复合物中的基因被下调。三次样条拟合HOXA 13用bar-T控制的转导细胞株与其比较,显示了mRNA的调节作用。HOXA 13击倒对手,和HOXA 13与亲本相比,EPC2-hTERT细胞高表达.FC折叠零钱。d HOXA 13MTT法测定,Be细胞中的敲除可降低细胞池的生长。平均±扫描电镜*p < 0.05, exact p=0.0204,双尾t-测试,n=9项独立实验。e HOXA 13EPC2-hTERT细胞在三维培养(球体面积,平均±扫描电镜,*)中的过表达促进了细胞的生长。p < 0.05, p=0.0174,双向方差分析与西达克的多重比较检验)。fEPC2-hTERT细胞HOXA 13过度表达对胆汁酸暴露不太敏感(p=0.0343)。MTT数据显示为相应的车辆处理的对照%。平均±扫描电镜*p < 0.05, t-试验(二尾)。

这些实验也为以下观点提供了机械支持:HOXA 13表达式可以解释为什么Be容易发展到EAC。HOXA 13介导edc的下调,许多edc和corniated包膜基因在be to eac级联过程中被逐渐下调。36,41。在BE、EAC和食管SCC中,EDC杂合性丢失(LOH)是常见的。42,43,44。EDC基因低表达可预测化疗无效,EDC的LOH与早期治疗的EAC患者的生存率降低有关。43,45。在我们的实验模型中,我们观察到HOXA 13-介导Notch信号相关基因的上调,特别是DLL 1, 呋喃,和日航1。Notch信号与恶性转化相关46,47。在IPA分析中“非黑色素瘤实体瘤”(z=2.03,p=9.28×10−8)和“细胞入侵”(z=2.08,p=2.47×10−3)被证明是被激活的。HOXA 13,鉴于HOXA 13表达对“凋亡”有负面影响(z=−1.5 2,p=2.23×10−3)和“杀死细胞”(z=−2.03,p=2.03×10−3)类别。许多单个基因在原癌方向上表现出差异调节(见补充数据)。3).

最后,使用HOXA 13在Barrett‘s和鳞状细胞中的敲除和过度表达,我们证明HOXA 13下调上皮分化复合体等角膜内皮基因,维持鳞状上皮细胞的形态,发挥抑癌基因的作用。此外,Notch信号被过度表达,许多单个基因在原癌方向上表现出差异调节。

HOXA 13支持柱状表型并提供增殖优势

建立了转录效应HOXA 13在bar-T和EPC2-hTERT细胞上,我们接下来研究了HOXA 13在这些细胞里。就像mESCs一样,HOXA 13表达显著提高食管细胞的生长速度。对于bar-T细胞来说,这是一种增殖优势。HOXA 13在2D培养中有表达(如图所示)。6d),而对EPC2-hTERT而言,HOXA 13在三维培养条件下,细胞生长的表达更为明显。6E)。此外,HOXA 13表达降低角质形成细胞对胆汁酸暴露的敏感性(如图所示)。6f),与以下概念一致:HOXA 13在类似GERD的条件下给予细胞保护。

进一步了解…的作用HOXA 13在细胞形态和组织方面,我们利用EPC2-hTERT细胞可以在三维球体培养中分化,并在球体中间形成更加扁平的细胞学组织和高表达角蛋白等角化标记物的事实,类似于食管分层上皮(见图1)。7A分化形态的顶部面板)48。过度表达HOXA 13,EPC2-hTERT球状体在保持较低分化表型的同时增大(未分化形态图)。7A底部面板)。对这些形态状态的量化表明,在对照组培养中,80%的球体达到分层的上皮表型,而HOXA 13的过度表达则使这一数目减少到28.6%(p < 0.05, Fig. 7b左面板)。以雪莲为角化标志的染色进一步证实了这一点,表明其在球体中的表达减少。HOXA 13-高表达EPC-hTERT细胞(p < 0.05, Fig. 7b右面板)。因此,在原发性永生化食管细胞中HOXA 13过度表达可以减少角质化。

图7:HOXA 13支持肠型柱状上皮分化。

HOXA 13过表达会影响EPC2-hTERT球体的鳞状分化,如有代表性的图片(a)和基于苏木精和伊红(H&E)或抗雪莲(IVL)免疫组织化学(IHC)的形态学定量评估(p=0.0086)。(b)。中间带四分位数范围,*p < 0.05, Mann–Whitney test (two-tailed). c HOXA 13敲除(KO)影响条形T细胞的空间分布.平均±扫描电镜*p < 0.001, p=0.0001,t-试验(二尾)。e柱状和混合的bar-T上皮的长度HOXA 13大鼠气管KO活体组织重建模型。平均±扫描电镜*p < 0.05, exact p=0.0439。d典型的H&E,PAS染色,抗IVLIHC从大鼠气管组织重建模型的bar-T上皮。H&E染色显示移植动物体内有更多的细胞层。HOXA 13+野生型细胞。周期性酸性希夫(PAS)染色多囊糖类分子,且阳性是杯状细胞的标志.箭头指向PAS正性,它存在于右侧面板中,而不在左侧面板中,其中bar-THOXA 13细胞显示。IVL染色在左侧组的形态鳞状细胞中较强,而在左侧组中较弱。HOXA 13+上皮(n=3霍萨n=5HOXA 13+). f HOXA 13HOXA 13+条形T型细胞培养系统的H&E染色、PAS染色和IVL IHC的代表图片表明:HOXA 13KO将柱状上皮表型向鳞状角质化上皮(n=1项独立实验)。

我们进一步研究了HOXA 13在Be衍生的bar-T细胞中的形态学作用。在2D培养中,观察到细胞在生长模式上的空间分布变化,在没有HOXA 13的情况下,细胞更紧密地生长在一起,这表明对组织形态有影响(图1)。7C)。条形T细胞模型还允许测试HOXA 13论柱状对决鳞状细胞分化在体外和体内的设置。采用体内三维组织重建模型,将条状T细胞移植到失活、剥脱的大鼠气管腔内,植入NOSCID小鼠体内。在这些条件下,亲本未转染的bar-T细胞从同一克隆中产生肠型柱状上皮和复层鳞状上皮。因此,该细胞系有可能产生两种形态不同的上皮细胞。33,49(无花果)7E和补充图。9)。因此,模型中的上皮细胞发现自己处于两种形态之间的临界点上。这一特点使得活体组织重建模型适合于研究形态学调节剂的影响,即显示调节剂是否偏向肠型柱状上皮或复层鳞状上皮。研究HOXA 13敲出,提出了两个重要的观察。首先,HOXA 13敲除会减少柱状上皮的长度,柱状上皮含有PAS阳性细胞,而雪莲蛋白阴性(见图)。7E、f)。因此,损失HOXA 13对抗肠型柱状上皮的增殖,而复层鳞状上皮增生仍然存在。第二,HOXA 13从上皮层的厚度推断,敲除一般会损害上皮细胞的增殖(如图所示)。7D;补充图。9B)。这些细胞系的2D有机型ALI体外培养证实了体内研究结果。HOXA 13将bar-T上皮细胞重排至鳞状角化分化上皮(图1)。7F)。最后,HOXA 13支持肠型柱状上皮分化和Barrett‘s上皮的增殖,证实了以下观点:HOXA 13表达既能调节竞争优势,又能调节柱状表型形成的倾向。

讨论

在本研究中,我们描述了霍克斯基因在小鼠和男性中的表达和定位,这些基因沿着胃肠道呈共线性。分析了其中的一个霍克斯基因,HOXA 13,我们观察到HOXA 13+上消化道中的细胞,这是对霍克斯基因共线性理论具体来说,在食管和胃近端的正常生理过程中,非鳞状结构,如GEJ处的上皮细胞,ESMGs的腺细胞和胃的腺体,都含有单一的表达细胞。HOXA 13。这些细胞以前没有被描述过,这可能反映了qPCR的组织匀浆掩盖了这个部分,而且以前还没有对这个基因进行过胃肠道的单细胞分析。我们观察到肠上皮化生等远端表现型胃肠病理的特征是胃和食管的扩张。HOXA 13-阳性细胞,而相反,相对较低的表达HOXA 13与周围的生理组织相比较,发现于结肠典型的腺端Paneth细胞上皮化生和幽门化生。

很明显在正常生理上,HOXA 13导致了尾状胃肠道的远端表型,引起了人们对肠系膜的作用和来源的疑问。HOXA 13-表达室现在观察到在上消化道。我们证明食道HOXA 13-阳性细胞表达柱状和BE标记,并显示与BE衍生细胞重叠的基因表达模式。在功能上,HOXA 13提供单元格开发BE段所需的几个属性。HOXA 13使细胞处于干细胞样祖细胞状态,同时赋予细胞增殖优势,促进细胞迁移。50以及对胆汁酸的耐受性。此外,在已提交的单元格中,HOXA 13支持一个表型柱状表型,很可能部分由第一染色体表皮分化复合体的下调所驱动。因此,我们的数据与居民膨胀所产生的假设是一致的。HOXA 13-在GERD等磨料环境下的阳性细胞。关于BE的起源,人们提出了几种可能的理论:鳞状上皮基底细胞的转分化,GEJ中特殊细胞群的扩展,损伤后食管的再增殖,来源于祖细胞ESMG或导管的细胞,驻留的胚胎干细胞或循环的骨髓细胞。51。这些潜在的食管柱状上皮来源并不是相互排斥的,而且可能有多个前体细胞或位置。我们的研究支持了先前提出的假设,该假说可能来自ESMGS和GEJHOXA 13表示为OLMF 4。+、LEFTY 1+ESMGS的细胞,最近被认为是起源于Be的细胞21。事实上,除了GEJ之外,少有的HOXA 13+细胞存在于人的食道和胃中,与观察到的食管胃吻合术可在患者中再次发生一致,说明GEJ的介入并不是BE发生的绝对先决条件。52。此外,我们的数据显示HOXA 13已经存在于干细胞水平,支持由具有干细胞特征的细胞产生的概念。当HOXA 13表达式与KRT 7,这是Barrett‘s中的柱状细胞角蛋白,我们没有观察到与前面描述的直接转录重叠KRT 7+KRT 14/5+TP 63+原产细胞。然而,KRT 7+KR5+TP 63+细胞只有在异位表达的情况下才能产生类上皮细胞。CDX 222。谱系追踪研究需要进一步证实是否存在一种或多种类型的起源细胞。当我们专注于HOXA 13在这里,可以想象霍克斯基因与病理生理学有关,尤其是尾端基因,如HOXA 10, 11, B13,和C10是否值得进一步调查,特别是据报Be组B的共线中断9小鼠胚胎十二指肠12.

BE被认为是EAC的前兆病变,这是一种危险的癌症形式,其发病率在近几十年中大幅上升。对BE发病机制的深入了解有助于EAC防治策略的制定。HOXA 13参与ESCC53和其他类型的癌症54,55,56,57。这里我们展示了HOXA 13EAC和结直肠癌也增加,为细胞提供增殖优势,并激活与癌症相关的基因转录,如Notch信号。因此,我们推测HOXA 13可能在向EAC发展中起作用。

全部,本研究确定了区域模式的重要性。霍克斯肠道上皮中的基因。在Barrett食管,胃IM和上消化道异位症,结肠样。霍克斯基因的表达是存在的,特别是以HOXA 13升华。表达通常被认为是远受限制的单细胞。HOXA 13基因存在于生理上消化道,尤其是GEJ,它支持柱状表型,并可能具有相对竞争优势。因此,HOXA 13介导是表型和增殖潜能,因此似乎是一个合理的目标战略,旨在对抗东非共同体的发展。


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