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晚期AR阴性前列腺癌进展过程中细胞异质性的时间演变

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发表时间:2021-06-16 14:01作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

尽管在治疗晚期前列腺癌的高效率雄激素受体(AR)导向疗法方面取得了进展,但对这些治疗的获得性耐药仍时有发生。有很大一部分有抗药性疾病的患者发展为AR阴性肿瘤,这些肿瘤失去了其腔内特征,并表现出神经内分泌特征(神经内分泌前列腺癌(NEPC))。从AR阳性腺癌到AR阴性NEPC的细胞异质性和分子进化还有待研究。利用一种新的基因工程小鼠模型,我们描述了Rb1损失和MYCN(编码N-Myc)过表达,导致AR阴性、低分化、高转移潜能肿瘤的形成.以单细胞为基础的方法揭示了转录组和染色质可达性的显著时间变化,这些变化确定了不同细胞群体的出现,其特点是差异表达。ASCL 1Pou2f3,在向NEPC过渡期间。此外,全球DNA甲基化和N-Myc旋回被重定向如下Rb1损失。总之,我们的数据提供了对前列腺癌进展到NEPC的深入了解。

导言

尽管在高效雄激素受体(AR)治疗晚期前列腺癌的治疗方面取得了进展,但最终还是会出现耐药性。有很大一部分患者患有AR阴性前列腺肿瘤,失去腔内特征并显示神经内分泌特征(神经内分泌前列腺癌(Nepc))。1,2,3)。NEPC的特点是AR和腔内(细胞角蛋白8和18(CK 8,CK 18)上皮标记的丢失,基底上皮标记(CK 14,CK5)的表达,多能性(Sry-box 2,SOX 2),神经内分泌标记物(突触素(Syntophysin,SYP),嗜铬素A(chromoGranin A,CHGA),神经元特异性内酰胺酶(Neuron SpecificEnolase,NSE))的表达,以及与神经谱系相关的基因表达。4。虽然NEPC肿瘤是由去势耐药的前列腺癌(Crpc)引起的,并有共同的基因组改变,但在从cpc向nepc的进展过程中,出现了明显的表观遗传放松。2。我们和其他先前确认的N-Myc(编码为MYCN)作为这一进展的关键驱动因素5,6,7,8。N-Myc细胞及其相互作用的辅助因子和N-Myc导向的表观基因组重新编程的变化是雄激素依赖性的,促使前列腺癌上皮细胞向神经身份转变,从而促进AR独立性和NEPC的发展。5,6,7。损失TP 53Rb19,10,11,12,13,14,15,并上调了zasthomolog 2(EZH 2)的增强子(EZH 2)。7,10)也与AR阴性前列腺癌的发生有关。然而,对于异常的N-Myc表达如何与特定的基因组事件(如丢失)进行协作,人们知之甚少。TP 53,和Rb1和其他分子改变,以促进神经内分泌表型的获取和肿瘤向NEPC进化的异质性,在缺乏雄激素的情况下。

无论是CRPC还是NEPC,MYCN过度表达和Rb1丢失可以独立发生,也可以在病人样本中同时发生。视网膜母细胞瘤和神经母细胞瘤小鼠模型显示Rb1损失MYCN-驱动性肿瘤加速肿瘤的进展,缩短生存期。16,17。这种共同发生在前列腺癌中的临床和生物学意义还没有被描述.在本研究中,我们描述了MYCN过度表达和Rb1失去驾驶AR阴性,低分化转移前列腺癌和一个分子程序,与临床NEPC。

结果

高肿瘤MYCN表达和Rb1缺失与更坏的预后有关。

以确定MYCN过度表达和Rb1丢失在临床上是有意义的,我们评估了总体生存差异。76例患者活检按肿瘤组织学分类(crpc或nepc)分组,根据rna-seq值分为三类。MYCN表达(高与低)和Rb1基因组状况(删除,是和否)。在76例患者标本中,55例为CRPC,21例为NEPC。我们观察到19/76(25%)患者有高N-Myc表达的肿瘤,Rb1删除。有趣的是,9/55(16.4%)CRPC和10/21(47.6%)NEPC的N-Myc高表达,Rb1删除,表明N-Myc过表达和Rb1在NEPC的发展过程中,损失可能会增加(图1)。1A和补充图。1A)。此外,我们观察到N-Myc的高表达与Rb1与N-Myc高表达者相比,CRPC和NEPC肿瘤的缺失与整体生存率下降显著相关。Rb1正常或低N-Myc表达/Rb1正常(19.93个月(1.83至81.5个月),而32.27(6.6-87.17)个月或42.90(4.2-145.3)个月。p=0.03,图1。1A和补充图。1A)。我们的数据表明,高N-Myc表达和Rb1缺失预测整体预后较差。一些研究已经探讨了N-Myc过表达的作用。5,6,7,8Rb1损失10,12然而,在推动NEPC的发展过程中,这些基因改变作为驱动因素可能发挥的协同作用(如果有的话)还没有报告。

图1:MYCN+和Rb1缺失加速向NEPC的进展。
figure1

aCRPC的Kaplan-Meier地块(n=55)和NEPC(n(21)病人按MYCN(n-Myc)表达和/或Rb1现状。从转移性疾病的最初诊断到任何原因的死亡,进行单因素整体生存分析。上次随访时还活着的病人接受了检查。N-Myc高表达及Rb1与其他两组相比,缺失组的存活率明显下降(p=0.031,Kaplan-Meier估计量(双面对数秩检验).b完整的生存图样PNPRN使用Kaplan-Meier估计量的小鼠(**)p=0.0056,对数秩检验)。c根据病理评估,创业板肿瘤病灶与传统腺癌(包括HGPIN、囊内癌、腺癌)、低分化/神经内分泌特征、鳞状分化和肠分化的百分比。底部:苏木精和伊红(H&E)染色,NEPC染色,N-Myc,RB1,上皮标记物AR和CK8,重组因子EZH 2,小细胞神经内分泌标记INSM 1。图为13只小鼠的代表。标尺:50μm。dAR、N-Myc、INSM 1对19周龄原发性肿瘤、肺、肝和淋巴结转移的h&E和IHCPRN老鼠。图像代表2只小鼠。标尺:50μm。eMRI冠状扫描P (n=5),公共关系 (n=3);PN (n=4);及PRN(n=6)8~20周龄的宝石。12周龄时处死小鼠。f随时间折叠变化量P (n=5),公共关系 (n=3);PN (n=4);及PRN (n6)12周切除小鼠创伤性肿瘤。PRN:*p=0.0187,**p=0.0027,*p=0.0002,*p < 0.0001, PN: #p=0.0129,##p=0.0075,双尾t-表明基因型与P老鼠。数据为平均值+/−扫描电镜。g低分化小鼠同种异体移植瘤及腺病毒介导的转移瘤的研究PRN有机化合物。破折号线将肿瘤转移与正常组织分离开来。图为18只独立小鼠的代表。标尺:50μm。

MYCN+和Rb1缺失加速向AR阴性、低分化/nepc肿瘤、转移和中位生存期的进展。

以确定N-Myc过表达和Rb1在体内肿瘤进展的损失,我们介绍了Rb1F/f等位基因进入我们之前描述的Pb-Cre4+/−;PtenF/f;LSL-MYCN+/+转基因小鼠模型7...为了简单起见,我们将参考不同基因型和对照的别名(补充图)。1B)。与临床病例相似PTENF/f;Rb1F/+;MYCN+(公共关系HETN)和PTENF/f;Rb1F/f;MYCN+(PRN)小鼠存活率较差(中位生存期为12.5周(PRN或19周(公共关系HETN(与老鼠相比)PTENF/f;MYCN+(PN)小鼠(中位生存期为26周)和PTENF/f;Rb1F/f (公共关系)小鼠(38周,图1)。1B和补充图。1C)。此外,PRN公共关系HETN小鼠早在8周就发展出AR阴性低分化灶的大、侵袭性肿瘤(PRN)或12周(公共关系HETN)。这些区域与传统腺癌几乎没有相似之处,但NE标记阴性,可能是传统腺癌与NEPC状态之间的过渡。然而,其中一些病灶对神经内分泌标志物INSM 1呈阳性反应。18,19,EZH 2,以及NKX 2-1,一种与小细胞神经内分泌癌(包括前列腺)相关的标记物。18,19,20(无花果)1C,d和补充图。1D,e)。苏木精和伊红(H&E)染色显示,部分病灶细胞核致密,胞浆稀少,具有NEPC形态特征。这些肿瘤还包括其他分化不同的病灶(即肠和鳞状细胞),以及与原发肿瘤相似的常规的AR阳性腺癌。PN以前描述过的老鼠6,7但随着时间的推移,传统腺癌的比例逐渐下降,而低分化组织学的比例则随着时间的推移而增加。这与来自PNPRN小鼠,早期以高级别前列腺上皮内瘤变(HGPIN)为主.

我们还发现不同基因型与不同的转移潜能有关(详见补充表)。1、图1.1D,以及附图。1E-g)。肺、肝转移灶均为AR阴性,但淋巴结转移灶同时含有AR阳性和阴性肿瘤细胞,提示AR表达缺失对转移无必要。此外,肺和淋巴结病变均为rb1阳性,进一步表明肺和淋巴结病变完全丧失。Rb1没有必要提供转移潜能。为PRN小鼠,早于8周就有转移,与对照组相比,转移速度明显加快。PN6,7公共关系10老鼠。在12周前,100%完好无损PRN小鼠发生远处转移灶(n=8)。类似于原发肿瘤(附图)。1E,g)肺、肝、淋巴结和肾脏转移主要由大细胞和小细胞神经内分泌组织学组成,INSM 1和N-Myc染色阳性,AR阴性。这些数据表明Rb1在下列情况下的损失PN小鼠加速高转移潜能低分化肿瘤的形成,并最终形成NEPC。

以确定Rb1在以下情况下,损失促进了去势抵抗。PN在12周龄时,我们对小鼠进行了纵向磁共振成像(MRI)分析,以追踪去势前后肿瘤的生长情况。基于冠状和轴向MRI的肿瘤体积测量,PRN小鼠对手术阉割没有反应,并继续快速生长(见图)。1E,f)。相反,肿瘤公共关系, PN,和PTENF/f (P小鼠去势后退步。不出所料,我们发现PN公共关系肿瘤在阉割后24周恢复生长,而肿瘤PTEN光是丢失就没有显示肿瘤在52周时重新生长,这与以前的报告一致。7,10。去势小鼠中位生存期缩短。PRN(24周)公共关系(43.5周)和PN(44周)小鼠(附图)。2A)。此外,阉割后肿瘤PRN与腺癌相比,小鼠有丰富的分化腺癌组织学和转移潜能。公共关系PN小鼠(附图)2A,b,d).

为了确定局部前列腺微环境是否是观察到的表型所必需的,我们从7到8周龄的正常前列腺上皮组织中提取了三维器官。铅-Cre4-阴性的宝石在体外用一种表达CRE的腺病毒转导.免疫印迹和IHC分析证实CRE诱导后存在功能性等位基因,并证实所有创业板来源的细胞器均为AR(补充图)阳性。2C,e)。我们注射了PNCREPRNCRE器官植入裸鼠皮下,并随时间的推移监测移植瘤的生长。肿瘤体积持续增加PRNCRE异体移植(n=20)从第3周到第6周PNCRE异体移植(n=5)生长速度明显减慢,这也导致各组间肿瘤重量的显著差异(p=0.0003,补充图。2F,g)。此外,PRNCRE同种异体移植瘤表现出与原发肿瘤相似的破裂和不同的组织学模式。PRN小鼠(如AR阳性腺癌和AR阴性,低分化灶,补充图。2H,i)。有趣的是,来自任何一种基因型的同种异体移植物都含有AR阴性、弱或强的肿瘤细胞,表明最初在体外AR阳性的细胞器逐渐失去了AR在体内的表达。然而,我们观察到的低分化灶主要是在PRNCRE异体移植(附图)2H,i). PRNCRE去势后移植物生长速度略有下降(附图)。2J这很可能是因为肿瘤是异质性的,有一个AR反应的腺癌成分。

最后,仅在荷瘤小鼠体内观察到肺和淋巴结转移灶。PRNCRE异体移植(图1.1g)。大多数转移灶是低分化的,虽然有些是鳞状和骨样分化。总之,这些数据表明MYCN过度表达和PTEN/Rb1丢失诱导的NEPC形态、AR表达的丧失和转移潜能的增加以细胞自治的方式出现.

N-Myc和Rb1基因组损失驱动着与NEPC一致的分子程序。

以确定MYCN表达协同Rb1由于无法驱动与NEPC相关的分子程序,我们对从腺癌到NEPC的不同组织结构的肿瘤灶进行了大量的RNA-seq检查(见图)。2A)。以前的研究表明TP 53突变Rb1损失驱动一种表型,类似于我们在PRN小鼠10,12,14。因此,我们首先查询rna-seq数据以了解Trp53和在Rb1。所有单核苷酸变异(SNV)和插入/缺失(Indels)Trp53Rb1对所有基因型的小鼠肿瘤的每一种组织病理学亚型进行了基因分析(补充图)。3A)。我们观察到外显子非沉默突变Trp53外显子和同义外显子突变Rb1。.的.Trp53改变后,我们注意到DNA结合区第7外显子出现错义突变(CT715G)。这种突变在人类中相当于C242R。TP 53基因(从Vista-Point工具获得)21,22),并预测其对有害(SIFT)或破坏性(PolyPhen)有中等影响(Ensembl变异效应预测器)。23,24对TP 53功能的影响。另一个Trp53突变(c.157dupT)是连接子结构域第4外显子中的移码插入,人类当量(W53Cfs*4)对TP 53功能(Ensembl变异效应预测器)有很大影响。这两种人类突变都是在宇宙突变数据库中发现的,然而,在这两种基因中,没有一种基因对小鼠低分化或NEPC肿瘤有特异性,无论基因型如何。

图2:低分化肿瘤具有与临床NEPC相似的分子特征。
figure2

a冷冻宝石肿瘤的H&E表现为腺癌、低分化腺癌和NEPC组织学。图像是20只独立小鼠的代表。标尺:50μm。bNEPC乐谱的小提琴情节PRN宝石与传统腺癌和低分化/NEPC组织学,以及PCA,CRPC,和NEPC患者样本。采用单因素方差分析和TUKEY多重比较检验计算显着性。c低劣、鳞状、腺癌和混合分化灶的热图和分级聚类PRN穷人与穷人PN阿诺签名。所有去势小鼠PRN基因型d与E2F靶点、细胞周期、神经元发育、表观基因重编程、上皮身份、p53靶点和AR信号有关的TOP基因集。向上:原木2(Fc)>1.5;向下:log2(Fc)<−1.5,benamini-hochberg调整双面t-测试p < 0.05. eHallmark E2F靶区和Hallmark MYC靶点在低分化(差)和腺癌(腺)中的GSEA富集图。

先前描述的NEPC评分是根据70组差异表达的NEPC相关基因来估算测试样本为临床NEPC的可能性。2。我们计算了每个肿瘤病灶的NEPC评分,发现低分化肿瘤病灶的NEPC评分明显高于传统的腺癌,并且与从一组患者NEPC肿瘤中获得的数值相似(图一)。2B)。有趣的是,去势小鼠分化不同的肿瘤灶(鳞状、差、骨样)的NEPC评分与临床NEPC相似,明显高于完整肿瘤的腺癌(p=0.0004)。这表明去势导致NEPC分子程序的激活,而不管组织学如何。

然后,我们比较不同组织学肿瘤灶之间的表达差异,以确定与加速肿瘤进展相关的差异表达途径。Ward的分层聚类使用了一个2,043个基因签名来区分PRN低分化/NEPC焦点PN腺癌灶p < 0.05, |(Log2(折叠变化)>2),显示了三组不同的基因簇(图1)。2C)。簇1和2中发现的基因在低分化和NEPC样样品中高度上调,并且富含E2F、MYC和PRC 2复合物,以及细胞周期、神经谱系和EMT基因(见图)。2D,e)。腺癌灶有EMT基因、PRC 2复合靶基因和AR信号/前列腺发育基因(补充图)。3B,c)。有趣的是,我们观察到与低分化肿瘤病灶中tp 53信号丢失相关的基因与腺癌相比增加了,尽管没有明显的功能突变或改变。Trp53表达式(附图)3A,c,d).

基于单细胞的方法揭示了NEPC样的子种群。

接下来,我们试图描述肿瘤的时间演变。公共关系PRN老鼠。为此,我们对8周龄完整小鼠的前列腺组织进行了ihc染色。公共关系小鼠由AR阳性,hgpin病变,肿瘤PRN小鼠含有AR阳性腺癌的大区域,以及由AR阴性的INSM 1阳性细胞组成的邻近灶(图)。3A)。为了更好地了解我们在发育中的肿瘤中观察到的这种异质性,我们在8周龄的前列腺上进行了单细胞RNA测序(scrna-seq)。PRN老鼠(n=3),以及年龄匹配公共关系老鼠(n=3)并设法找出可能有助于肿瘤发生的亚群体。K-均值聚类和UMAP对这两种基因型的联合数据显示了10个主要的细胞簇的基因表达(如图所示)。3B)。簇间差异表达分析按聚类列出了前50位差异表达基因的列表(如图所示)。3C和补充表2),我们使用已知标记的表达式为每个集群分配身份(如图所示)。3B)。我们限制进一步的分析,以包括被确认为腔上皮、基底上皮或神经内分泌细胞的群体。Krt 5,Krt 8,Cd24a,Trp 63,和Insm1表情。对这个子集进行重新聚类,可以进一步描述这些种群内部的异质性(公共关系小鼠:8,151只细胞;PRN小鼠:5160个细胞)(如图所示)。三维空间)。然后,我们评估了每个簇中由来自每种基因型的细胞组成的比例,发现它们在组成上有显著的差异(图一)。3E)。例如,我们发现,与神经内分泌群体相对应的C8簇中75%的细胞来自PRN肿瘤的比例为25%公共关系肿瘤。通过基因表达,我们在公共关系肿瘤腔内标志物阳性艾尔Cd24a,以及高水平的AR信号活性FKBP 5表达(占细胞总数的17.3%)。3F)。这个人口减少了近两倍PRN肿瘤(占细胞总数的10.6%),相反,有近3倍的细胞膨胀,表达。EZH 2AR信号活性低(26.5%)PRN占9.3%公共关系),意味着从AR依赖状态过渡(如图所示)。3F)。的差异表达基因EZH 2+/AR信令低和艾尔 + /Cd24a+群体显示了已知PRC 2、EED和SUZ 12目标的富集(补充图)。3E)。这些数据与之前关于N-Myc和EZH 2协同抑制AR信号的发现是一致的。6,7。此外,EZH 2-阳性/AR信号低的人群也增加了先前发表的成人干细胞(Asc)标志评分的表达。25和表达SOX 2,与远离腺癌状态的转变一致(如图所示)。3F)。有趣的是,我们还发现了大量表达神经内分泌标记的细胞,包括ASCL 1, 奇加, FOXA 2,和Insm1(无花果)3F)。ASC签名评分显著高于PRN肿瘤相比较公共关系肿瘤(如图所示)。第三代),并被发现在含有神经内分泌细胞的簇中富集(如图所示)。3H).

图3:基于单细胞的方法显示了NEPC样的亚群体。
figure3

a单链RNA-seq样品中AR和INSM 1的H&E和IHC染色。标尺:50μm。b完整的scrna-seq数据的联合t-sne图公共关系 (n=3)和PRN (n=3)小鼠。c聚类前50位差异表达基因的聚类。d的联合管腔、基底和神经内分泌种群的聚集公共关系 (n=3)和PRN (n=3)小鼠。e聚类间基因型的分布d. f表示指示标记或签名的公共关系 (n=3)与PRN (n=3)小鼠。饼图显示阳性或阴性细胞比例或高/中/低/负基因表达比例。g史密斯的小提琴作曲25. hASC按小组分组评分d.

向神经内分泌样谱系方向的细胞轨迹

为了了解上皮细胞和神经内分泌细胞之间的转录关系,我们采用了一种计算方法。26若要定义给定世系状态之间的单元格轨迹,请执行以下操作。产生的细胞的聚类PRN肿瘤本身再次显示出三种不同的细胞群,包括基底上皮和腔上皮,以及神经内分泌细胞群。Krt 5,Krt 8,Cd24a,Trp 63,和Insm1表达式(图1.4A)。细胞轨迹和UMAP投射强调了腔上皮细胞和神经内分泌细胞之间的过渡(图)。4B)。通过评估已知标记基因的表达与神经内分泌群体的假时间距离的关系,进一步证实了这一点。角蛋白5(Krt 5一种已知的基底上皮细胞标记物,在与神经内分泌细胞距离最大的假时间距离最大的细胞中高表达,主要局限于基底上皮细胞群(图1)。4C)。水平艾尔及其靶基因TMPRSS 2在腔内和基底细胞中高表达,在神经内分泌人群中表达水平较低(图1)。4C)。稳健水平EZH 2在所有细胞中观察到,在神经内分泌人群中的表达略有增加(图1)。4C)。如所料,神经内分泌标记物如ASCL 1, Insm1, FOXA 2,和奇加在神经内分泌人群中均有高表达(图一)。4C)。令人惊讶的是,这一分析揭示了管腔上皮簇中表达这些神经内分泌标记物水平较低的小细胞群,尽管它与神经内分泌群之间存在着明显的假时间距离(图一)。4C)。而终末神经内分泌状态也存在于公共关系肿瘤,这些早期过渡细胞的出现以更高的频率出现,并在假性时间的早期出现。PRN肿瘤,并暗示这一方法可以潜在地识别细胞在过渡到神经内分泌状态的早期(图一图)。4C)。然后,我们采取了一种无偏的方法来识别基因模块,这些基因模块的差异表达是假时间的函数。我们确定了22个模块的表达水平与三种细胞状态相关(图)。4D)。GSEA在每组中表达最高的基因上表现出不同的差异,其中最显著的包括在神经内分泌簇中EZH 2相关发育基因和神经基因的富集(第3组,图3)。4E)。三个表达程度最高的模块的表达分数的投影,如预期的一样,对应于定义它们的三种细胞状态(图1)。4F)。有趣的是,模块9和20分别被限制在腔内和基础群体中,模块19在神经内分泌细胞以及计算细胞轨迹上最接近神经内分泌群体的腔细胞子集中高表达(图19)。4F)。中的相应模块公共关系肿瘤虽然能够识别神经内分泌群,但在沿着计算细胞轨迹的腔内细胞中并没有显示出明显的富集(图1)。4F和补充图。4A-d).

图4:细胞向神经内分泌样谱系方向的轨迹。
figure4

aUMAP投影腔(红色),基底(绿色)和神经内分泌(蓝色)人群PRN老鼠(n=3)。b面板投影到UMAP上的伪时轨迹a。颜色反映假时间距离(神经内分泌种群位于t=0)。c年,个体细胞中指示基因在假性时间内的基因表达水平PRN(左)及公共关系(右)老鼠。颜色反映假时间距离(神经内分泌种群位于t=0)。d基因表达模块的热图和聚类,这些模块作为假时间的函数在PRN老鼠。eGSEA的结果显示,前5个基因集在第9、19和20个模块中富集。f第9、19和20号模块基因的表达PRN(左)及公共关系(右)老鼠。g6周龄大鼠腔内和神经内分泌细胞中指示基因的表达n=2)和8周(n=3)PRN老鼠。h转移性NEPC样本中scRNA-seq数据的UMAP。根据聚类间差异表达基因的GSEA结果命名聚类。

为了更好地了解表达神经内分泌标记的细胞的进化过程,我们在一个较早的时间点(6周)进行了scRNA-seq,n=2)。在这个年龄,PRN小鼠主要含有HGPIN,以及AR-/INSM 1-浸润癌灶(补充图)。4E)。前列腺内所有细胞的聚类分析显示了不同的神经内分泌和腔内群体(附图)。5)。随后根据6周和8周时间点的腔内和神经内分泌细胞的综合数据进行分析,发现两组明显的AR阴性细胞,并显示出中到高水平的神经内分泌标记基因表达(Insm1),以及泛素C末端水解酶L1(UCHL 1)(图1.4G和补充图。4F)。此外,这两个群体的差异表达ASCL 1/CHGA与10月11日编码基因Pou2f3(无花果)4G,补充图。4F,以及附图。5)。在6周和8周的时间点观察到这些群体,两个时间点的细胞对所有集群都有贡献(补充图)。4G)。接下来,我们试图找出标记细胞中间群体的基因,这些细胞有可能向神经内分泌表型转变。我们进行了差异表达分析,鉴定出1,822个基因,这些基因在腔内和神经内分泌群体之间发现的细胞簇中显著富集,包括Pou2f3, Ovol3,和Ascl 2(无花果)4G,补充表3,以及补充数据1).

为了确定这些发现在临床上的相关性,我们在纽约长老会医院/威尔康奈尔医学的一个临床样本上进行了类似的scRNA-seq方法,该患者有AR阳性的前列腺癌和AR阴性的NEPC肝转移。原发肿瘤基因组图谱鉴定为5.8Mb局灶性缺失PTEN(10:89,536,129-90,122,394)TP 53(R273C)。NEPC肝转移PTEN原发肿瘤的缺失并含有一个错义突变TP 53(R114c),转移灶携带无意义的突变,并预测功能丧失。Rb1(R579X)(补充表)4)。患者在雄激素剥夺治疗、多西紫杉醇和卡铂治疗后取得进展,并发展出一种NEPC胸腔积液,并接受scRNA-seq治疗。对scRNA-seq数据的分析显示,在去除造血和基质种群后,主要肿瘤细胞群中有许多亚群(图)。4H)。对簇间差异表达基因的基因本体论分析揭示了不同细胞过程(包括DNA损伤反应和神经谱系途径)所丰富的群体。类似于小鼠模型的遗传背景,NEPC患者样本包含了大量的MYCN-积极/Rb1-阴性细胞(图1.4H)。我们还观察到大量的EZH 2+/AR信号低细胞(图1.4H),其中许多还表示SOX 2(无花果)4H)和UCHL 1(补充图。4H),与我们在PRN老鼠。最后,ASC签名评分的应用25显示与标记阳性的细胞有很强的重叠。MKI 67,表明该种群的增殖能力增强(附图)。4H)。我们还对第二个前列腺癌样本进行了scRNA-seq检查,该患者在ADT治疗后出现前列腺局部复发并伴有混合小细胞癌和腺癌。与我们在PRN小鼠,我们发现了一群对神经内分泌标记基因强阳性的细胞。INSM 1CHGA,以及SOX 2UCHL 1(补充图。4I)除了大量的细胞外,这些基因的表达也明显降低。这两个群体的RNA速度分析揭示了细胞轨迹的存在,这表明细胞最有可能向神经内分泌簇过渡(补充图)。4J).

神经内分泌亚群体中存在着不同的染色质可及性模式。

根据肿瘤发生过程中所观察到的转录异质性和细胞轨迹的存在,提示腔上皮和神经内分泌细胞之间可能存在谱系可塑性,我们试图找出可能导致这种谱系状态改变的因素。为此,我们进行了转座酶-可访问染色质的单细胞分析,然后从一名8周龄的人进行了测序(scatac-seq)。PRN确定不同种群间染色质可达性的区域。在文库产生和测序之后,片段大小随周期变化而变化,大致对应于核小体间距(附图)。6A)。正如预期的那样,可达性水平最高的区域以基因转录起始点(TSS)为中心(补充图)。6B)。在对染色质可达性数据进行聚类后,我们评估了一些特定于谱系的基因座的可访问性(例如Krt 8, PSCA, Ar,Insm1, Ptprc, Col3a1,和PECAM 1)给细胞分配身份(腔、基、神经内分泌、间质)(附图)。6e-g)。此外,我们还观察到在基底、腔内和神经内分泌群之间存在明显的亚组(图1)。5A)。这两个神经内分泌子簇在已知的神经内分泌标记基因位点上具有很高的可达性,因此我们对NE1和NE2群体进行了差异可达性分析,以揭示这两个群体之间的差异(补充表)。5和补充数据2)。通过这一比较,我们发现NE1种群的染色质可达性在ASCL 1FOXA 2而NE2群体在Ascl 2Pou2f3位点(图1.5B,补充图。6g,及补充表5),类似于scRNA-seq数据(如图所示)。4G)。相反,基因组基因座艾尔AR靶基因TMPRSS 2在所有的腔内和基础人群中,有很高的可及性,而在任何一种神经内分泌人群中,几乎没有可及性(图一)。5B和补充图。6C)。我们确定了染色质区域与所有亚群体之间的差异可达性,并进行了基序分析,以确定转录因子结合位点,其中富集在高可及低可及区。正如预期的那样,GATA基序以及糖皮质激素反应元件(GRE)和雄激素反应元件(ARE)(补充图)丰富了腔内种群。6d)。有趣的是,神经内分泌群体的特征是NE1群体中的ASCL 1基序与NE2群体中的OCT/Pou家族成员的差异富集(图1)。5C)的可访问性方面的差异。Pou2f3位点(图1.5B和补充表5)。为了更好地了解这两个神经内分泌群体的出现,我们还对6周龄的前列腺进行了scatac-seq检查。PRN老鼠(n=2),并将数据与8周时间点相结合。类似于8周的数据,合并后的数据再次揭示了两个具有较高染色质可达性的种群。Insm1轨迹,但在ASCL 1Pou2f3位点(附图)6h,j)。此外,这些群体由6周和8周时间点的细胞组成(补充图)。6I)。与我们的scRNA-seq的发现一致,这些数据表明存在离散的神经内分泌群体,这可能是由不同的转录程序驱动的。为了确定scRNA-seq和scATAC-seq所观察到的NE亚群体之间的关系,我们从NE1和NE2 scATAC-seq群体中的50个最不同的可访问位点中创建了一个基因签名。然后我们评估了scrna-seq数据中这些基因的表达,发现ne1 scatac-seq特征在ASCL 1-阳性scRNA-seq亚群体,而NE2 scATAC-seq签名在Pou2f3-阳性scRNA-seq亚群体(图1)。5D)。最后,我们研究了POU2F3前列腺癌患者。来自临床队列的rna-seq数据显示POU2F3在CRPC和NEPC患者的子集中表达(如图所示)。5E)。类似于PRN小鼠,表达POU2F3似乎是相互排斥的ASCL 1(补充图。7ARb1表达式(附图)7b,d)。此外,POU2F3表达与神经内分泌指标呈正相关。ENO 2(补充图。7C)。为验证POU2F3在蛋白水平上的表达,对22例CRPC患者和8例NEPC患者进行了含有可评价材料的前列腺癌组织芯片(TMA)的POU2F3免疫组织化学检测。致盲病理检查显示,77.3%的CRPC病例和37.5%的NEPC病例有中至强POU2F3染色(图1)。5F-h)。这些数据表明POU2F3在临床CRPC和NEPC病例中均有表达,可作为CRPC向NEPC过渡的生物标志物。然而,需要进一步的工作来了解POU2F3在CRPC和NEPC群体中表达的异质性。

图5:神经内分泌亚群中存在不同的染色质可及性模式。
figure5

a的scATAC-seq数据的t-sne图PRN老鼠。b染色质可达性在各亚居群中所指示的位点。c指示的NE亚居群中差异转录因子基序的富集图要求簇间的高可及低可达染色质区域。d在NE1和NE2群体中,前50位最具差异的可接近基因的基因表达水平。补充表中确定的基因5从图中投射到UMAP上。4G. e POU2F3良性表达(n29),局部晚期前列腺癌(PCA)(n=66),CRPC(n=73),以及NEPC(n36)病人样本。f临床组织芯片POU2F3 IHC染色综述gTMA患者诊断中IHC评分的量化(CRPC:n=22;NEPC:n=8)。方框表示25%−75%百分位数,中间值表示为一行。晶须扩大+/−1.5×四分位数范围。位于胡须外的数据点是单独绘制的。hPOU2F3-强和POU2F3阴性/弱患者的典型图像。标尺:50μm。

N-Myc雪崩是在Rb1损失

根据宝石中基于单细胞的测序数据,我们观察到MYCN再加上.的损失Rb1导致具有神经内分泌样特征的侵袭性转移性肿瘤迅速形成。因此,我们假设Rb1会与MYCN过度表达可以重塑N-Myc细胞并推动肿瘤的进展。为了解决这个问题,我们对多个独立的肿瘤进行了N-myc染色质免疫共沉淀测序(芯片-seq)。PNPRN老鼠。与其作为转录因子的作用一致,N-Myc结合在两种基因型的基因转录起始点(TSS)附近高度富集(补充图)。8A)。我们发现了36,789个N-Myc峰PN肿瘤,与我们先前对人前列腺癌细胞中N-Myc结合的研究相一致。6。令人惊讶的是,在失去了Rb1,N-Myc cistrome被急剧扩展到62,171个结合位点。PRN老鼠有近60%的这些位点对应于新的结合位点PN只有老鼠(图1)。6A)。此外,GSEA的PNPRN独特的峰揭示了在不同条件下由N-Myc结合的不同的基因集。而许多腔上皮和激素反应基因集在PN肿瘤,大量富集的PRC 2复合靶点,表观遗传标记的发育和神经系基因集。PRN肿瘤(附图)8B)。为了确定可能导致这一差异重塑的旋回的转录辅助因子,我们在N-Myc峰之间进行了基序富集分析。PNPRN老鼠。而PN肿瘤由TP 53组成,PRN肿瘤为ASCL、POU2F3(OCT 11)和蜗牛家族(图11)。6B)。更引人注目的是,观察到一个与E2f家族转录因子一致的基序高度富集。27(无花果)6B)。为了评估N-Myc结合和染色质可达性的改变程度,我们将scATAC-seq和芯片-seq数据结合在一起,并将分析局限于亚群体之间的差异可达性区域。在野生类型水平的情况下Rb1,N-Myc结合在可接触染色质区域与腔内种群相关(图1)。6C)。在.的背景下Rb1失去,N-Myc结合在腔特异性区域减少,相反,在只有在神经内分泌人群中才能接触到的区域显着地富集(图1)。6C)。具体来说,我们发现N-Myc绑定在艾尔重定向到神经内分泌相关基因,如ASCL 1Insm1,在PRN肿瘤(如图所示)。6d)。重要的是,失去了Rb1似乎以一种非常特殊的方式重新构造N-Myc雪铁龙,作为绑定在GAPDH位点(已知的N-Myc靶基因)保持一致PNPRN肿瘤(如图所示)。6d)。这些数据表明,Rb1与N-Myc过表达协同作用,可以通过ASCL-家族和E2F-家族成员的帮助,将N-Myc雪崩重定向到新的基因组位点来调控基因表达。

图6:Rb1丢失后N-Myc雪崩发生改变.
figure6

a中显示N-Myc绑定的重叠的Venn图PRN (n=3)和PN (n=2)肿瘤(峰值截止:q < 0.0001). bN-Myc结合位点间差异转录因子基序的富集PRNPN肿瘤。cN-Myc结合的热图PRNPN通过scATAC-seq在与神经内分泌和腔细胞亚群相关的染色质区的肿瘤,如图所示。5A. dN-Myc在指定位点的结合PRN (n=3)和PN(n(2)肿瘤。

N-Myc和Rb1缺失肿瘤采用nepc甲基化程序。

差异DNA甲基化是另一种机制,可能解释表达差异在组织学上不同的肿瘤病灶。根据gEM肿瘤的大量rna-seq数据,我们发现dna甲基转移酶(DNMT 1,Dnmt3b)、去甲基酶(TET 1),以及甲基-CpG结合域基因(MBD 3)Mbd 4)差异上调,而Mbd 2Zbtb 4低分化灶的表达低于腺癌灶(图1)。7A)。类似的上调丁姆茨TET 1NEPC患者与CRPC患者比较2。此外,基于N-Myc芯片-seq数据,我们发现N-Myc结合在DNMT 1, Dnmt3b,和Mdb 4在……里面PRN(主要是低分化组织学)与PN肿瘤(主要是腺癌组织学,图)。7b)。为了确定这些基因调控差异是否转化为差异DNA甲基化,我们进行了减少代表性亚硫酸氢钠测序(RRBS)。我们从邻近区域的组织中产生甲基化图谱,这些区域以RNA-seq分析为核心,来自低分化灶或腺癌灶的小鼠。在主成分分析中,基于这些甲基化特征,腺癌病灶聚集在一起,但明显地与低分化肿瘤分离(补充图)。9A)。此外,同一组织学的甲基化谱高度相关(腺癌,r=0.95;r=0.83,附图。9B),与临床肿瘤相比,NEPC临床肿瘤的低甲基化程度更高。2。差异甲基化位点在基因组区和cpG环境中的分布表明,在启动子区域和cpG岛(CpGi)中,高甲基化位点的频率较高,类似于其他甲基化研究的结果。28(补充图。9C)。然而,在CpGi处,甲基化启动子位点富集,而在CpG海岸则以低甲基化启动子位点为主(附图)。9d)。有趣的是,CpGi中的高甲基化曾被报道与前列腺癌的严重程度有关。28。Rna-seq数据的整合显示,与腺癌灶相比,102个差异高甲基化基因在低分化的肿瘤灶中也被下调,在临床的nepc肿瘤中也有与crpc肿瘤不同程度的甲基化。2。同样,在GEM肿瘤中,258个差异低甲基化基因在NEPC患者标本中也被上调和差异甲基化(图1)。7C)。为了排除甲基化差异可能是由于不同基因型所致,我们比较了同一只小鼠360个(102+258)基因的低分化和腺癌组织学亚型中甲基化Cs的频率。这360个基因中的大多数在这两个亚型中有不同的甲基化水平,这与它们的表达水平是一致的。7D)。有趣的是,ESR 1, FGFR 3和AR靶基因,FKBP 5TMPRSS 2,细胞分化和神经发育的调节因子(例如,Slit2,Prox 1,和奥利格1低分化腺癌病灶与腺癌病灶相比,低分化肿瘤病灶中低甲基化和高表达(图1)。7D). FOXA 2,在NEPC中,细胞命运决定的主要调控因子是低甲基化的,上调的,并优先被N-Myc在其tss附近结合。PRN肿瘤相比较PN肿瘤(如图所示)。7E)。唯一的N-Myc结合位点PRN低分化肿瘤与腺癌相比,肿瘤与差异甲基化部位重叠。SOX 2,一个定义谱系的因素,被发现在增强的N-Myc结合区域内。PRN低分化的肿瘤组织学(图)。7F).

图7:N-Myc和Rb1缺失肿瘤采用NEPC甲基化程序。
figure7

a原木2DNA甲基化调控因子在低分化创业板肿瘤中的表达发生了翻倍的变化。班吉米-霍奇伯格调整双面t-测试*p < 0.05, **p < 0.01 (p=0.0437,0.0267,0.0089,0.0164,0.0031,0.0582,0.0013,0.0131)。b在低分化腺癌和低分化腺癌肿瘤中,每种基因转录起始点附近的N-Myc结合峰。c低分化肿瘤与腺癌差异甲基化基因下游分析流程图。d高甲基化基因甲基化分数的热图(n=102)和低甲基化(n在两对肿瘤组织中为258)。e, f上调基因的N-Myc结合和甲基化状态FOXA 2 (e)或SOX 2 (f)在小鼠肿瘤的两种组织学亚型中。红色表示每种肿瘤类型在每个部位甲基化C的百分比。gCRPC集群地图(n=18)和NEPC(n=10)样本采用360个基因甲基化评分(距离法:相关法,聚类法:Ward D2)。P每个主要星系团的数值是基于两个超几何学的测试,以增加NEPC(p=1.45×10−5)或CRPC(p=1.45×10−5)分别在这两个簇中的样本。hCRPC集群地图(n=73)和NEPC(n360个基因表达样本(距离法:相关法,聚类法:Ward D2)。P每个主要星系团的数值是基于两个超几何学的测试,以增加NEPC(p=1.8×10−10)或CRPC(p=3.6×10−10)分别在这两个簇中的样本。iGSEA结果使用小鼠肿瘤的高甲基化基因(顶部面板)n=102)和LNCaP细胞(n=57)和低甲基化基因(下面板)来自小鼠肿瘤(n=258)和LNCaP细胞(n=185)(底部面板)。每个水平条上的数字表示与各自基因集重叠的基因数目。

为了解决来自小鼠模型的甲基化数据的临床相关性,我们使用360基因小鼠甲基化标记来查询28组特征良好的crpc的甲基化数据(n=18)和NEPC(n=10)样本2。分层聚类将样本分为两组,其中一组(第1组)仅由NEPC样本组成(8/8);p=1.4×10−5,超几何检验),而另一组(第2组)在CRPC样品中显著富集(18/20,p=1.4×10−5,超几何检验,图1.7g)。当所有差异甲基化基因被用于聚类分析时,与CRPC聚类分离的两个NEPC样本之一也被发现与CRPC聚类(补充图)。9E)。进一步研究了这360个基因在NEPC中的相关性,利用360个基因的表达值对较大样本(73例CRPC和36例NEPC)进行聚类分析。在这三个集群中,一个是CRPC和NEPC样品的混合物,第二个是NEPC的富集(19/20);p=1.8×10−10,超几何检验),第三次富集CRPC(67/79);p=3.6×10−10,超几何检验,图1.7H)。用360个基因的表达对小鼠低分化腺癌和腺癌进行了相似的聚类,形成了两个簇,一个是腺癌(5/8),另一个是低分化肿瘤(6/6)(附图6)。9F).

为了测试小鼠甲基化结果的鲁棒性,我们在LNCaP细胞中进行了rrbs的高表达。MYCN5,6,7,8,以及靶向的shRNARb1,并与对照LNCaP细胞进行比较(附图)。9g)。在差异表达的360个基因中,242个(57个高甲基+185个低甲基化)在LNCaP-NMYC-shRB1细胞中也有表达,而LNCaP-NMYC细胞中的基因表达也有差异(图1)。7C)。使用这242个基因甲基化数据对临床样本进行聚类分析,将NEPC和CRPC样本分离成离散的子簇(补充图)。9H)。我们还发现,在LNCaP细胞中,高甲基化和低甲基化基因之间的信号通路与360基因列表中所观察到的信号通路相似(见图)。7I).

讨论

Rb1丢失在前列腺癌中很常见,N-Myc过表达在NEPC中占很大比例,对这两种事件之间潜在的协同作用知之甚少。在这里,我们使用了一组crpc和nepc患者,研究了基因表达和结果数据,以确定cpc和nepc患者之间的共现性。Rb1丢失和N-Myc过表达与整体存活率比任何一种事件都更糟糕。为了研究这种关联背后的机制,我们产生了一个结合双元的创业板。PTENRb1失去N-Myc过表达。这些小鼠迅速发展为低分化组织学肿瘤,并且比对照组动物更耐阉割。

基于大量RNA-seq的特殊组织学(例如腺癌与低分化/NEPC)之间的差异程度并不奇怪,因为它们的表型差异很大。然而,在N-Myc漩涡的上下文中,有着显著的差异。Rb1损失是耐人寻味的和意外的,我们假设,共同因素和/或其他转录因子可以解释这些差异。有趣的是,我们观察到E2F和MYC在低分化腺癌病灶中的富集,提示E2F和N-Myc可能改变或增强了从腺癌向低分化状态的转变过程中的活性。这也反映在我们的芯片-seq研究中,E2F基序在低分化肿瘤中唯一发现的N-Myc结合位点富集。对于N-Myc,这与我们先前的发现一致,即N-Myc池可以被动态地调节。6。然而,在雄激素戒断的背景下,N-Myc结合位点在Forkhead基序中得到丰富.有趣的是,FOXA 1的主题在这两个方面都同样丰富。PNPRN肿瘤。相反,在N-Myc结合位点上的E2F基序在Rb1丢失表明N-Myc与E2F靶基因结合,协同作用推动肿瘤的转录状态。还需要进一步研究,以确定E2F转录因子是否与N-Myc协同作用,并在下列情况下重定向N-Myc结合Rb1损失。下调基因在表观基因重编程和PRC 2靶点以及上皮身份、AR信号和p53目标中富集。我们先前的工作证明,N-Myc激活了EZH 2的转录重组,在神经内分泌前列腺癌的发生中起着重要的作用。7。PRC 2靶基因和表观标记基因(H3K27me3,与抑制相关)的富集表明,当细胞从腺癌向低分化/NEPC表型过渡时,PRC 2介导的表观基因重编程发生了改变。我们还观察到与上皮身份相关的基因的下调,例如那些被上皮粘附分子E-cadherin(Cdh 1)丢失而下调的基因。E-cadherin的丢失被认为是通过EMT的启动和侵袭促进转移的。29。我们主要在我们的宝石和小鼠同种异体移植中看到组织学低分化的转移灶,表明由于EMT通路的激活,低分化细胞具有更高的转移潜能。有趣的是,我们使用器官衍生的皮下同种异体移植显示,NEPC样疾病的发展可能发生在Rb1丢失和N-Myc过表达与前列腺微环境无关。需要进一步的研究来充分认识肿瘤微环境在早期前列腺肿瘤发生中的作用。

使用RBS来查询体内和体外模型以及患者样本中DNA甲基化的变化,我们发现与腺癌相比,低分化/NE肿瘤中DNA甲基化机制的成分被解除管制。这与整个基因组中许多临床相关基因的甲基化状态相对应。基于我们从创业板肿瘤中获得的甲基化数据,我们开发了一个360基因甲基化标记,成功地分离了临床CRPC和NEPC样本。DNA甲基化水平如何与H3K27me3水平和染色质可及性相一致仍有待观察。

考虑到肿瘤发展过程中的异质性,基于单细胞的方法可以更精确地描述肿瘤发生的过程。单细胞rna-seq研究回顾了我们以前关于N-Myc和EZH 2协同抑制AR信号的作用的报道。6,7。我们还证明,表达已知神经内分泌标记的细胞群也显示出与患者生存不良相关的基因表达增加。25。特别值得注意的是,我们发现一些神经内分泌标记基因在细胞中被上调,这些基因并不是不同的神经内分泌簇的一部分,而且在假时间内距离很远。这些数据有力地支持了这样的观点,即细胞从腔状状态向NEPC样状态过渡,而不仅仅是现有神经内分泌前体细胞的扩展。此外,由于其中许多细胞表达AR,但AR靶基因水平较低,提示EZH 2的药物抑制可能恢复雄激素信号,逆转诱导的NE转录程序。这一点尤其重要,因为目前正在进行一些使用EZH 2抑制剂的临床试验,包括许多前列腺癌(NCT 03480646,NCT 04179864,NCT 03460977)。此外,我们的scRNA-seq和scATAC-seq研究发现了两个不同的神经内分泌簇的基础上转录和染色质可及性。这两个簇的表达方式不同。ASCL 1和Pou2f3,以及它们对ASCL和Pou/OCT转录因子家族结合基序的富集作用。最近在小细胞肺癌(SCLC)方面的研究发现,c-myc驱动的肿瘤中Notch激活可以促进ascl 1阳性、neurod 1阳性和yap 1阳性状态之间的转换。30。我们以前的研究表明,虽然c-myc和N-myc有许多共同的靶基因,但前列腺细胞中的N-myc池包含了一组更大、更多样化的转录靶点。6。我们确实在一个神经内分泌亚群体的scATAC-seq数据中发现了神经D1基序的富集。可以利用的主题的变化可能标志着正在经历国家间过渡的人口。需要做更多的工作来了解这两个子种群是如何受到管制的,以及细胞是否有不同的谱系结果,取决于作为一个起源群的群体。此外,临床样本的数据也显示POU2F3在CRPC和NEPC患者的子集中表达,需要更多的机械洞察力来确定POU2F3在疾病进展过程中。

总之,我们的研究已经确定了一群下调AR信号的细胞,并在N-Myc过度表达之后经历了向神经内分泌样表型的沿袭。PTEN/Rb1共同损失。这一谱系变化伴随着染色质可及性和N-Myc结合在许多临床相关基因上的变化。最后,我们发现了一个甲基化特征,它可能会为将来使用EZH 2抑制剂的临床试验提供信息,即哪些患者最有可能受益于EZH 2抑制,并将其作为一个生物标志物来识别那些表现出有益反应的患者。这些研究揭示了N-Myc过表达和Rb1失去协同作用推动神经内分泌前列腺癌的发展,并为确定和验证新的治疗目标提供了新的探索途径。


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