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基因组测序揭示了血小板反应性的调控格局

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发表时间:2021-06-16 14:50作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

动脉粥样硬化性血管损伤部位的血小板聚集是心肌梗死和脑卒中的病理生理基础。为了建立在以前GWAS的基础上,我们报告了通过全基因组测序(WGS)方法在3,855个NHLBI跨-全谱精确医学(TOPMed)参与者中发现的16个基因座。我们确定RGS 18基因座,编码粒红系特异性G蛋白信号调节因子,与表达数量性状位点(Eqtl)共同定位。RGS 18血小板表达。基于基因的方法将SVEP 1基因,已知的冠状动脉疾病风险的贡献者。前哨变体RGS 18PEAR 1分别与血栓形成风险和消化道出血风险增加有关。我们的WGS发现补充了先前确定的GWAS基因座,提供了关于遗传学可能影响心血管疾病风险的机制的见解,并强调了罕见变异和调控方法在识别导致复杂表型的位点方面的重要性。

导言

动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)仍然是全世界发病率和死亡率的主要原因。ASCVD的特点是活化血小板聚集在破裂的动脉粥样硬化斑块上,然后血栓形成。1...止血和血小板聚集是一个进化的保守过程,维持在ADP和肾上腺素等激动剂和前列腺素等拮抗剂之间的微妙平衡。2。先前的研究表明,血小板聚集对激动剂的反应是高度遗传的,遗传力估计在40%到60%之间。3,4,5。在基线时和服用阿司匹林后血小板反应性增高与心血管预后不良有关。6,7。抗血小板治疗是预防冠状动脉、脑动脉和外周动脉闭塞并发症的标准护理方法。先前的基因组和外显子范围的关联研究已经确定了至少8种针对不同激动剂的血小板聚集的常见变异体。8,9,10,11。除了一些有限的基因扫描9,12以往的全基因组研究还没有系统地评估普通和罕见的变异体对激动剂诱导的血小板反应性遗传力的贡献。因此,血小板功能性状可能仍然存在显着的缺失遗传力。

在这项工作中,我们利用NHLBI跨全基因组计划(TOPMed)的科学资源,利用全基因组测序(WGS)数据首次报道了血小板聚集响应于各种生理刺激的关联研究。我们试图改进先前鉴定的GWAS基因座,2)确定新的位点,根据不同剂量的ADP、肾上腺素和胶原确定血小板聚集,3)检查血小板聚集的编码变异体的总体负担,4)评估巨核细胞特异性超增强区罕见的非编码变异体对血小板聚集的集体负担。利用生物库资源以及体内外细胞功能系统扩展遗传发现。

结果

基于单变量的关联测试

本研究共评估19项血小板聚集表型指标(补充表)。1)。这包括9种作为激动剂的二磷酸腺苷(ADP)、9种肾上腺素和4种胶原。对3125名欧洲裔美国人(EA)和730名非洲裔美国人(AA)(补充表)中的~2800万个变异体进行了全基因组单变异试验。2)来自Framingham心脏病研究(FHS)、老年Amish研究(OOA)和动脉粥样硬化风险的遗传学研究(GeneSTAR)。我们鉴定了101个与ADP、肾上腺素或胶原反应的血小板聚集相关的变异体(P值<5×10−8、图1.1,补充图。1)。使用迭代条件分析,基因组范围内的显着变异被细化到16个独立的位点(表)。1)。除两个变异体(rs 12041331和chr 17:21960955)外,所有基因座都与血小板聚集相关(图1)。1B),而且大多数已识别的基因座在现有的基于数组的方法中不存在。8,9,10(表)1、补充图。24).

图1:16个基因座血小板聚集和汇总效应的全基因组关联研究结果P < 5 × 10−8.
figure1

A3855名TOPMed参与者的全基因组关联研究结果显示血小板聚集反应肾上腺素、ADP和胶原。P提供的值是单个激动剂的所有个体表型的摘要(即最小值)。P肾上腺素、ADP和胶原的8、7和4种个体表型变异的价值,详见补充表1). P值来自双面分数测试,不对面板中的多次测试进行调整。AB。基因座通过基因组范围的意义(P < 5 × 10−8)标记为红色的点。位点名称代表最近的(对于新的)或以前注释(对于已知的)基因。红线表示P值阈值为5×10−8,对应于全基因组的意义。B19个表型在16个位点上的前哨变异圆图显示了GWAS信号的强度(从中心环第二个)和效应的大小/方向(中心环)。

表1 3855名TOPMed参与者通过基因组范围内血小板聚集对肾上腺素、ADP和胶原反应的单一变异方法确定的16个位点。

单变量结果的复制

对来自FHS、OOA和GeneSTAR的多达2 009个独立样本进行了发现发现的复制(补充数据)1),并扩展为一个独立的队列(凯尔菲利前瞻性研究[CAPS],N=1183)ADP和胶原诱导的血小板聚集表型8,13(补充表)4)。在先前报道的7个位点中10,在这次调查中复制了2次(PEAR 1ADRA2A1)。样本数目减少,在先前研究的两个队列(FHS和GeneSTAR欧洲样本)的参与者中,重叠百分比较低(<75%),增加受试者(OOA和GeneSTAR非裔美国人),以及WGS数据和HapMap估算剂量数据之间的差异(补充表)5A在一定程度上,可以解释与其他5个先前确定的基因座之间缺乏关联的原因。元分析,而不是超级分析方法,并没有有意义地改变对这些发现的解释(补充表)。5A,b)将目前的WGS结果与先前的研究进行比较。与目前调查结果的比较RGS 18变体见补充表5B在之前的研究中,没有其他新发现的WGS变异体。

血小板eQTL基因座的共定位

鉴于采用单变异方法识别的所有16个基因座都位于基因组的非编码区,我们通过基因STAR对180个欧洲裔美国人的血小板进行了rna测序,检测了这些区域之间的共定位和eqtl数据。6)。我们发现PEAR 1和RGS 18位点上的哨兵变体为eQTL。PEAR 1RGS 18分别。其余14个位点均未发现共定位。如图所示。2A,很可能只有一个变量来解释PEAR 1与之形成对比的是GWAS峰值RGS 18可能有几个因果变异。

图2:WGS信号的共定位PEAR 1RGS 18影响血小板基因表达的区域及其调控特征RGS 18等位基因特异性SNP对增强子活性的影响。
figure2

WGS相关信号与血小板eQTL信号的共定位及等位基因特异性实验RGS 18SNP增强剂P面板中的值A分别是GWAS/eQTL的双面分数/线性模型测试,不对多重测试进行调整。P面板中的值B是来自双面韦尔奇测试,没有调整多个测试。A顶部面板显示PEAR 1EQTL和WGS对Epi_low1反应血小板聚集的关联(见附表)1)和底部面板之间RGS 18与WGS关联的eQTL对Epi_low 5的血小板聚集反应(见补充表)1)。在左面板中,共定位区域被放大到SNV±25 kb,Y轴显示GWAS关联的-log(P),点的颜色代表eQTL基因证据的强度,eQTL分析中不包括的SNV以灰色表示。右面板显示了GWAS的ChiSquare统计量与两组数据中所有SNV的eQTL信号之间的散点图和相关性。BRs12070423 A或G等位基因在HEK 293细胞中表达GATA 1(TOP)和rs4495675T或G等位基因过表达NFE 2(下)的等位基因特异性增强子活性差异。每个等位基因特异性结果代表12个实验的结果(12个生物复制超过3个独立复制)。提供的数据表示平均值。(下午)扫描电镜

外部生物圈中的PheWAS

对表中所报告的哨兵变体的检查1在英国Biobank和BioVU执行,如补充数据所示2。次要等位基因(A)PEAR 1在rs 12041331,已知与较小的血小板聚集有关,PEAR 1RNA和蛋白表达14,15,在BioVU Biobank PheWAS中,EAs和AAS的消化道出血几率增加。

RGS 18位点的功能随访

RGS 18区域,使用独立样本复制了几个变量(补充数据)1),在CAPS研究中还观察到了ADP和胶原聚集表型的额外证据(补充表)4)。将相关变异体与血小板eQTL和巨核细胞表观基因组特征相结合,有几种潜在的候选多态性(补充表)。8)。与人类的结果一致,独立RGS 18−/−小鼠研究表明rgs 18可以抑制激动剂前刺激的血小板反应性,而敲除则表现出对多种激动剂途径的过度血小板反应,减少出血时间,增加动脉阻塞。16,17。这是由于血小板中G蛋白偶联受体信号通路丧失抑制所致。18。次要等位基因(C)RGS 18在rs 1175170时,与BioVU Biobank中EAs和AAS的动脉血栓/栓塞有关(补充数据)2)。等位基因特异性和转录因子过表达研究表明,可能扰乱GATA 1靶点的rs 12070423和可能破坏NFE 2靶点的rs 4495675,都能降低RGS 18的表达(图1)。2B,补充表9、补充图。45)。这些SNP在LD中(最小r值)。20.614)rs 1175170提示它们可能是影响RGS 18介导的血小板活化的单倍型的功能变异。

基于稀有变异方法的基因鉴定

斯卡特19对17,774个蛋白质编码基因进行了mf阈值为0.05的有害变异体的基因检测(补充表)。10,补充图。6)在Bonferroni矫治后有显著发现SVEP 1(ADP诱导的血小板聚集,P数值=2.6×10−6), BCO 1(肾上腺素诱导的血小板聚集,P=8.9×10−7), NELFA(胶原诱导的血小板聚集,P=1.7×10−6)和IDH3A(胶原诱导的血小板聚集,P数值=2.6×10−6)。贯通独处分析,我们观察到这些关联主要是由单一或有限的稀有变异(补充图)驱动的。7,补充表11)。例如,SVEP 1与ADP诱导的血小板聚集的关联完全是由第二外显子(rs 61751937,MAF 0.028)中的一个非同义变异体(Gly229Arg)驱动的。P数值=5.8×10−6)。这一变异改变了一个高度保守的残基位于蛋白质的VWFA结构域(如图所示)。3A-C)。这一发现在复制队列中仍然具有重要意义(P数值=0.004,补充表3)和上限(P数值=0.008,补充表4),两者均与ADP诱导的血小板反应性增强有关。这两种变体都与英国生物库的CVD结果有一定的关联(补充表)。7).

图3:SVEP 1中的蛋白编码变异对229 g,2702D及周围序列的ADP血小板活化、蛋白结构域和跨物种保守性的影响。

年聚集的稀有有害编码变异体的关联SVEP 1和ADP诱导的血小板聚集。P面板中的值A都来自于双面分数测试,没有对多重测试进行调整。A使用独处方法,我们发现了一个罕见的编码变异(Rs 61751937),解释了大多数关联。第一个橙色点代表了整个基于基因的测试,包括64个变种。当特定标记的变异被剔除时,随后的橙色点代表基于基因的测试的-log 10(P),而蓝色的条形代表被排除在外的特定变异的小等位基因频率。BSVEP 1的图式蛋白结构Rs 61751937在229位用甘氨酸代替精氨酸。另一个变体SVEP 1在2702位与以甘氨酸代替天冬氨酸的冠心病有关。C利用UniProt技术,共鉴定出98个同源物为最大的人SVEP 1蛋白亚型,并对其进行了排列。对准在MAFFT中可视化(第7节,Https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/,Katoh等人。2017年)59有杂色的。229g和2702D两种氨基酸在不同物种及其周围蛋白质结构域上都高度保守。序列标识符、属和种在补充数据中给出。3.

基因变异在MK特异性超促进剂中的作用

为了研究基因变异在超增强子环境下对调控重要性的作用,我们在一组1065个发表的mk特异性超级增强子中聚集了罕见的非编码变异(补充图)。8)20。我们在超级增强子中发现了罕见的非编码变体PEAR 1位点与ADP-(P=2.4×10−8),肾上腺素-(P数值=1.1×10−7)和胶原蛋白-(P数值=2.7×10−5)诱导血小板聚集。我们观察到,与基于基因的编码变异分析形成鲜明对比的是,PEAR 1超级增强剂是由该地区的多个稀有变体驱动的(补充图)。9).

讨论

在这对血小板聚集的WGS研究中,我们发现并复制了几个导致性状变异的位点。WGS方法继续验证PEAR 1轨迹。以前的工作证明了一个单一的,常见的(~14%MAF)内含子峰变异PEAR 1(Rs 12041331)使用gWAS、区域测序和外显子方法与血小板表型相关。8,12,14,21。Rs 12041331的小等位基因与PEAR 1血小板蛋白水平降低有关。14,15,可能是通过改变mks中的甲基化位点来实现的。22。此外,这一基因在血小板信号传导中的作用也得到了机制研究的支持。23,24。在这里,一种基于序列的方法,然后与血小板eqtls共同定位,结果表明,结果与一个单一的、常见的因果变异解释血小板反应性信号的模型是一致的。PEAR 1。类似于PEAR 1,我们最近发现了一个强大的Snp,rs 10886430内含子GRK 5,这会影响gga 1转录因子位点,并以高度细胞型特异性的方式调节血小板基因的表达,最终通过PAR 4受体调节,导致凝血酶-血小板反应性变异的20%,并与静脉和动脉疾病风险都有因果关系。11。这些例子说明了如何识别单一的SNPs,并最终与CVD终末点相关联,但需要对激动剂特异性表型和细胞特异性表达模式进行详细的研究,否则将被忽略。

RGS 10和RGS 18蛋白在血小板中高表达,是G蛋白信号转导的重要调节因子,在血小板的多种激活途径中起重要作用。我们的结果表明RGS 18血小板调节等位基因可能通过GATA 1和/或NFE 2相互作用位点调节人血小板功能。此外,我们在独立生物基底和祖先群体中发现,导致血小板反应性增加的等位基因也与心血管和血栓形成有关,包括闭塞、脑血管病、心脏骤停、栓塞和深静脉血栓形成,提示RGS 18可能是干预血小板的关键节点。

WGS方法允许基于稀有变异基因的分析表明,SVEP 1可能以前在心血管疾病中起着不受重视的多因素作用。纯合子斯韦普1−/−小鼠死于水肿,杂合子小鼠以及斑马鱼也会出现动脉和淋巴管畸形。25,26,27。与以前的调查一致28,GeneSTAR参与者子集中的RNAseq数据并不表示SVEP 1在血小板里。我们发现rs 61751937是SVEP 1最强的血浆蛋白QTL。P数值=5.2×10−64),减少表达29提示这种作用可能是通过血小板与其他细胞在循环中的相互作用来实现的。这种保守的蛋白可能通过多种机制影响血小板功能和cvd,包括细胞粘附、细胞分化和骨髓缝隙中的功能。30。最近的功能研究表明,SVEP 1在斑块中表达。进一步的实验表明,svep 1缺乏会影响CxCL 1内皮细胞的释放,并促进炎症性白细胞向斑块的再吸收。31...鉴于PRP缺乏内皮细胞、白细胞和平滑肌细胞的体外血小板功能评估,提示血浆中SVEP 1水平的改变或其他相关因素可能对血小板有直接影响,可能影响血栓形成。

总之,有大量的证据支持这一假设,即高反应性血小板可以预测两位健康人未来的血栓形成。6那些已经经历过血栓形成的人32,33。因此,更好地理解血小板聚集增高的遗传决定因素可能对早期预测血栓形成事件以及帮助与抗血小板治疗有关的药物遗传努力至关重要。通过在具有广泛血小板反应性表型数据的参与者中应用当代WGS策略,我们展示了这些方法在识别可能影响这些性状的遗传决定因素方面的潜力


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