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携带生殖细胞的妇女乳腺上皮细胞加速衰老的证据BRCA 1或BRCA 2突变

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发表时间:2021-09-18 14:49作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

在人乳腺的衰老过程中,上皮细胞通过表达通常在肌上皮细胞中表达的标记而失去谱系逼真度。我们假设,失去血统忠诚是上皮的一个普遍的表现,是容易发生癌症的。在本研究中,我们发现在组织学上正常的乳腺组织来自较年轻的易患乳腺癌的妇女,这是由于在BRCA 1, BRCA 2PALB 2基因,表现出加速衰老的特征。这些因素包括获得肌上皮标记物的腔上皮细胞按比例增加,肌上皮细胞比例降低,以及cKit的基本分化偏向或分化失败。+祖先。高风险腔上皮细胞和肌上皮细胞是转录丰富的基因的相反的谱系,炎症和癌症相关的途径。我们已经确定了反映癌症易感性的趋同生物学特征的乳房老化特征,而不考虑特定的潜在遗传或年龄依赖性风险或相关的乳腺癌亚型。

年龄是散发性乳腺癌的最大危险因素。1。然而,尽管衰老与癌症易感性之间存在着显著的关系,但在美国任何年龄组中,只有八分之一的女性最终患上乳腺癌。这些乳腺癌大多是散发性的,原发于特发性。只有5-10%的乳腺癌是由少数几种基因中的一种突变引起的,例如BRCA 1, BRCA 2, CHEK 2, 自动取款机, TP 53PALB2.携带这些生殖细胞突变的妇女不仅更频繁地被诊断为乳腺癌,而且在较早的年龄被诊断为乳腺癌。2例如,BRCA 1突变(BRCA 1穆特)据估计,携带者一生中患乳腺癌的风险超过70%2。由于这些种系突变大多发生在编码关键dna损伤修复蛋白的基因中,我们推测随机物理化学损伤可能会更频繁地累积,从而导致生物学年龄的加速和相应的衰老表型。3.

乳腺是一个双层上皮,内层有角蛋白19(KRT 19)表达的分泌腔上皮细胞,周围有一层收缩的KRT 14表达的肌上皮细胞。肌上皮细胞是一种上皮细胞,被认为具有基本性质,并被认为具有抑制肿瘤的作用。4,5。这种双层上皮被隔膜包围,隔开上皮室和脂肪丰富的基质室。随着年龄的增长,基质中脂肪组织的相对数量增加,结缔组织减少。6。在上皮细胞中,管腔细胞比例增加,肌上皮细胞比例降低,酪氨酸激酶受体cKit表达的祖细胞积累基本分化偏向。6,7。腔上皮中一个显著的年龄依赖性变化是肌上皮蛋白的获得性表达,如中间丝KRT 14的表达(参考文献14)。6,7,8)。我们将这种年龄依赖性的状态定义为家族忠实性的丧失,在这种状态下,腔上皮获得了一些肌上皮细胞的特征,同时保留了腔上皮细胞的特征特征。8。腔上皮发生的表型变化值得注意,因为ckit祖细胞和更成熟的腔细胞是起源于乳腺癌的细胞。6,9,10,11,12。忠诚度的丧失是否明确地与衰老有关,还是与癌症易感性有更广泛的关系,目前尚不清楚。

上皮可塑性是指细胞通过进入上皮间充质转换(EMT)和干细胞相关基因程序,在不同的亚稳态之间过渡的能力。13。上皮可塑性在发育过程中很重要,但也被癌症所取代。上皮可塑性是基底样乳腺癌的一个显著特征,主要为三重阴性。14,15。基底样乳癌通常发生在携带乳腺癌的高危妇女身上。BRCA 1突变,并以其攻击性和对化疗的抗药性而闻名。16,17。这种侵略性行为被归因于可塑性的增强和跨越祖、基和腔状态的能力。14。我们推测,在腔细胞中年龄依赖性的谱系忠诚丧失是上皮可塑性的一种形式,其基本特征的获得是增加肿瘤易感性的一步。在平均风险(AR)人群中,年龄是乳腺癌的一个重要的危险因素,而某些生殖系基因变异的携带者即使在绝经前也有明显的高风险,并且被认为是长期年轻的。我们推测腔上皮细胞的谱系忠诚缺失是乳腺上皮细胞的一种生物学特性,易发生癌症,并在高危(HR)妇女中加速。

为了确定我们先前确定的年龄依赖性的乳腺上皮改变是否与乳腺癌易感性有关,我们从携带乳腺癌易感基因生殖细胞突变的预防性乳房切除中检查了病理正常的乳腺组织。与AR对照组相比,经临床证实的乳腺上皮细胞、生殖细胞、HR乳腺组织中,KRT 14表达的腔内细胞明显增多。分化试验表明,ckit富集(CKit)。+)来源于HR上皮的祖细胞有一个基本的偏差,而不考虑特定的生殖系突变。根据衰老、炎症和衰老基因信号的富集,HR腔上皮细胞和肌上皮细胞与AR细胞在转录上是不同的。HR上皮中一些独特的基因信号的富集,是基于不同的胚芽系突变,表明这些细胞产生突变特异性的微环境。我们认为,诱发生殖细胞突变会加速乳腺上皮细胞的衰老过程,从而导致乳腺上皮细胞成分的改变,从而降低组织抑制肿瘤发生的能力,增加肿瘤细胞的来源。

结果

风险状况和年龄组的定义

妇女被定义为高风险,如果她们有一个生殖细胞突变,大大增加了终生乳腺癌诊断的风险,包括BRCA 1, BRCA 2PALB 2(参考文献。2,18)。HR样本年龄分布在24~59岁之间,平均为45.5岁(中位数=48年;补充表)1)。如果女性没有携带易感基因突变,她们就被定义为AR。在本研究中,样本被指定为“年轻”,如果他们是从≤35岁的妇女收集的,如果他们是≥55岁的“年长”的,以及从36-54岁的妇女中被指定为“中年人”。

HR腔上皮细胞共表达KRT 14和KRT 19

正常乳腺组织取自接受乳房切除或预防性乳房切除的HR和AR妇女(补充表)。1)。KRT 14和KRT 19蛋白在AR中的表达n=26,平均年龄=38.5岁,中位年龄=39岁)和人力资源(n2 3岁,平均年龄4 5.5岁,中位年龄4 8岁)组织切片和RNA在上皮细胞中的表达。在AR年轻妇女组织切片中,管腔上皮细胞(LEPs)表达KRT 19,肌上皮细胞(MEPs)表达KRT 14,尽管在不同年龄存在一些异质性(图1)。1A)。然而,在老年AR妇女中,LEPs得到了KRT 14的表达,这与我们先前的研究结果一致。6,7(无花果)1B)。有代表性的组织切片图像显示在人力资源载体上。BRCA 2(无花果)1C), BRCA 1(无花果)1D), BRCA 1BRCA 2(无花果)1E),以及PALB 2突变(图1.1F),所有这些都在KRT 19中表达了KRT 14。+LEPs。我们开发了一种图像分析管道来量化与KRT 14和KRT 19对应的荧光信号在原组织切片免疫荧光图像中上皮细胞中的表达。1g)。在HR上皮中(n=23),占19克朗的31%+LEPs也表达KRT 14,而在AR中只有7%的LEPs(Mann-Whitney)。U-测试,P < 0.0001; Fig. )。较年轻(<35岁)AR(n=11)上皮细胞的KRT 14显著减少。+LEPs较旧的AR(n(5)或任何年龄的HR上皮细胞,而老年AR组织与任何年龄的HR组织之间无差异(图5)。1I)。表达KRT 14在较老的AR LEPs中,信使RNA显著升高(P<0.05)。n=14)与较年轻的(n=17)及中年(n=7)AR LEPs,但与HR样本没有差别(n=13)(图1。1J)。HR LEPs有更多KRT 14MRNA与更年轻的AR LEPs比较(见图)。1J)。表达KRT 19在HR LEPs中的mRNA(n=13)与较旧的AR LEPs并无分别(n=14)但显著低于中、年轻的AR LEPs(n=7)(图1。1K)。瀑布图显示了KRT 19中KRT 14高表达的总体趋势。+HR乳腺组织中的LEPs对每种突变、年龄组和组织类型进行了定位(图一)。1L)。在我们的样本中,有生殖细胞的女性BRCA 1穆特相对于其他突变载体,KRT 14在LEPs中的表达最高(图1)。1L)。增加的KRT 14所占比例+HR组织中的LEPs与年龄无关(Spearman‘s)ρ=0.047,P在AR组织中,这种增加与年龄有关(Spearman‘s)ρ=0.37,P=0.0334)。

图1:HR LEPs与KRT 19共同表达,类似于老化的LEPs。
figure1

af,一位32岁的AR女性乳腺导管的免疫荧光图像,染色为KRT 19(绿色)和KRT 14(红色)。a),一名62岁的AR妇女(b),一个33岁的女人窝藏着BRCA 2突变(BRCA 2穆特) (c),一个24岁的女人BRCA 1穆特 (d),一个31岁的女人窝藏着BRCA 1BRCA 2突变(e)和一个52岁的女人PALB 2穆特 (f)。标尺,50μm。g,一种用于免疫荧光图像量化和分析的方法的原理图。h,KRT 19所占百分比的点状图+在HR中表达KRT 14的LEPs(n=23)和AR(n=26)样本。这个P值是使用双边Mann-Whitney计算的。U-测试。i,KRT 19所占百分比的点状图+在HR中表达KRT 14的LEPs(n=23岁,AR年轻(≤35岁,n=11岁(>55岁)和AR(>55岁),n(5)菌株。这个P数值采用单因素方差分析(ANOVA)计算,并采用Tukey的后特别检验进行多次比较.j,k,原木2(表达)KRT 14 (j)和KRT 19 (k)第4代LEPs中的mRNA。方框的轮廓代表第一和第三四分位数。盒子内的垂直线代表中值,晶须从每个四分位数到最小值和最大值。这个P数值计算采用Welch‘s ANOVA检验,并与Dunnett的T3后特别检验进行多次比较。l,KRT 19所占百分比的瀑布地块+在HR和AR菌株中表达KRT 14的LEPs定位于突变、年龄和组织类型。年龄组为:青年35岁,≤35岁,中年>35岁,≤55岁,老年>55岁。m、KRT 14所占百分比的点状图+在HR和AR标本中表达KRT 19荧光信号的MEPs。n,KRT 19所占百分比的点状图+LEPS和KRT 14+免疫荧光法检测HR和AR标本中表达KRT 14和KRT 19的MEPs。在……里面mnP值是使用双边Mann-Whitney计算的。U-测试。o,KRT 19所占百分比的瀑布地块+在所有HR株、所有AR株和乳腺癌前及恶性病变组织切片中表达KRT 14的LEPs。这个P数值计算采用Kruskal-Wallis检验,调整后用邓恩的后特别检验进行多次比较。在……里面lo,条的边缘代表手段,错误条代表S.E.M。灰点l表示每个应变所拍摄的每幅图像的数据。灰点o表示所列组中每个应变/样本的平均图像。每个个体至少有两个切片进行染色和分析,结果相似。代表每一组别的不同人士数目如下:a, 11; b5;c5;d,9;e两个;f三个。

由于怀孕对乳腺癌的风险有不同的影响,这取决于第一次怀孕时个人的年龄和最后一次分娩的时间。19,20,21我们评估了分娩和妊娠状态,以及自上次分娩以来的时间(如果有的话)与KRT 14在LEPs的变化。LEPs家系忠诚度的丧失与分娩状态无关,因为自上次出生以来的平均胎次、妊娠率和出生时间在危险组之间没有差异,并且与LEPs中KRT 14表达增加无关(扩展数据图,图1)。1).

为了评估MEPs中的谱系忠诚度损失,我们检测了MEPs中KRT 14和KRT 19的表达。KRT 14+HR上皮内MEPs占18%(n也表示KRT 19,表明MEPs中的谱系忠诚度下降(图1)。1M)。谱系保真度下降似乎是HR上皮的特征之一,在所有上皮细胞(LEPs和MEPs)中,11%的HR上皮细胞表达两种角蛋白染色,而AR上皮细胞中有3%的细胞表达染色。n=26)(Mann-Whitney)U-测试,P < 0.0001; Fig. 1N).

接下来我们检测kt 14在kt 19中的表达频率。+乳腺良恶性病变中的细胞,如导管原位癌(DCIS);n5)浸润性导管癌(IDC);n=6)。DCIS患者年龄为21~54岁(中位数=37岁),IDC患者年龄为34~51岁(中位数=47岁)。在IDC,几乎50%的KRT 19+细胞也表达KRT 14,而KRT 19的表达率为31%。+HR上皮细胞中的LEPs及KRT 19的7%+AR上皮细胞中的LEPs(Kruskal-Wallis试验,P < 0.0001; Fig. 十度)。占KRT 19的比例+DCIS病变组织中表达KRT 14的细胞明显高于AR组织,但无显着性差异(图5)。十度)。总之,携带癌症易感突变的妇女的HR乳腺上皮细胞在LEPs中的KRT 14表达水平显著高于AR,这在老年妇女和乳腺癌妇女中都有观察到。

HR上皮中大量的腔细胞

我们接下来确定HR和AR人乳腺上皮细胞(HMECs)中LEPs和MEPs的比例是否不同。采用流式细胞仪检测MEP标记物CD 271(神经生长因子受体)和LEP标记CD 227(sialomucin 1,MUC 1)在年龄相配的AR细胞上的相对表达。n=17岁以下、9岁中年人和10岁以上)和人力资源(n=15)妇女。Ar年轻菌株从0.2%到12%LEPs(中位数=2.5%),在老菌株中增加到9-39%(中位数=15.3%;Kruskal-Wallis试验,P=0.0008),与我们以前的调查结果一致6,7(无花果)2A,e)。我们观察到HR菌株之间的异质性:15株中有4株的LEPs小于5%(扩展数据图)。2),但在15株(73%)HR菌株中,有11株(73%)的LEPs比例明显高于我们根据年龄预测的比例(范围=0.1-90%,中位数=33%;图1)。2B,e)。LEP膨胀的最深刻的例子是在一个胚芽线上。PALB 2穆特达到91%LEPS的载流子(图1)。2C)。含有细菌的HMECsBRCA 1穆特LEP种群在1%到60%之间(中位数=41.7%)。2B);在HMECs中有一个种系。BRCA 2穆特LEPs在3%到28%之间(中位数=4.9%)。二维空间以及扩展数据图。2)。免疫荧光法检测培养的HMECs中KRT 14和KRT 19的表达。年轻的AR HMECs中的LEPs和MEP以相互排斥的方式表达KRT 19和KRT 14(例如,见图1)。2F),而在HR和较老的AR HMECs中,KRT 19+LEPs也表达了KRT 14(见图14)。2G-j)。HRHMECs表现出更大比例的LEPs,甚至在年轻时也有KRT 14表达增加。

图2:HR培养的乳腺上皮细胞呈基本表型的腔内扩张。

ad流式细胞术检测一例AR 19岁妇女和一例AR 66岁妇女CD 271和MUC 1表达。a)、不同年龄(31、35、40和53岁)的人力资源妇女窝藏BRCA 1突变(b),一位52岁的人力资源部女性窝藏着PALB 2突变(PALB 2穆特) (c)和一个33岁的人事部门妇女窝藏着BRCA 2穆特 (d). e从AR年轻妇女(≤35岁)获得的第4代上皮株的LEP群体所占百分比的点图。n17岁,AR中年妇女(36至55岁,n=9岁,老年妇女(>55岁,n=10)和人力资源妇女(n=15)。每个样本的中位数用一条水平线表示。这个P数值计算采用Kruskal-Wallis检验,调整后与邓恩的后特别试验进行多次比较。fj第4代培养的上皮细胞免疫荧光染色检测一例AR 19岁妇女的KRT 19(绿色)、KRT 14(红色)和Hoechst(蓝色)。f),一名66岁的妇女(g),一位24岁的人力资源部女性窝藏着BRCA 1穆特 (h),一位33岁的人力资源部女性窝藏着BRCA 2穆特 (i)和一个52岁的女人PALB 2穆特 (j)。每个面板右侧的图像是由合并图像中的白色矩形所勾画的区域的放大。标尺,50μ米。fj分别重复三次,结果相似。

HR祖细胞有分化缺陷和基本偏见。

为了研究HR上皮的上皮祖细胞是否存在分化偏向,我们对FACS富集的受体酪氨酸激酶cKit(CD 117)表达细胞进行了克隆分化试验。高表达ckit的乳腺上皮细胞具有多系分化能力,但存在腔内偏见。7,22。FACS富集后,cKit+在克隆密度条件下,细胞贴附盖膜,2d或7d后用免疫荧光法检测细胞的分化标志KRT 14和KRT 19。基于标记的分水岭分割在图像中鉴定单个细胞,然后测定与KRT 14或KRT 19表达相对应的平均荧光信号。CKit祖细胞的未分化状态由两种遗传标记的低水平双重表达来描述,通常导致细胞出现在点或等高线图的左下角,显示KRT强度。来自AR的ckit富集细胞(n=5)和人力资源(n=18:8BRCA 1穆特六号BRCA 2穆特PALB 2穆特)细胞检查。3A-d以及扩展数据图。3A-f)。的平均年龄BRCA 1穆特平均年龄为39.6岁(中位数=36岁)。BRCA 2穆特是52岁(中位数=52岁)和平均年龄PALB 2穆特平均54.5年(中位数=54.5年)。年轻AR ckit+细胞导致KRT 19的不同种群。+或KRT 14+细胞培养2d后(见图)。3A,e以及扩展数据图。3A)。较老的AR细胞有基本的分化偏向;大多数后代表达一些krt 14;AR株的年龄依赖性分化分布复制了我们先前的研究结果。7(无花果。3B,f)。HR cKit后代的分布+2d后的祖细胞与AR cKit的祖细胞有显着性差异。+祖细胞(χ)2测试,P < 0.0001); almost 50% of HR cKit+与29%的AR cKit相比,细胞仍未分化。+单元(扩展数据图。3A,b)。这种未区分状态是ckit的显著特征。+细胞BRCA 1突变(图1.3C,g以及扩展数据图。4A,c)。CKIT后代+细胞BRCA 2突变分化有一个基本的偏见,也就是说,他们都表达了一些kRT 14,但明显地有更多的krt 19的表达。BRCA 1穆特载体(图1.3D,h)。从质量上讲,BRCA 2穆特表型与AR旧的ckit有更大的相似之处。+细胞。Ckit+含有已知致病物质的细胞PALB 2变异体未能区分(图1)。3I),但作为PALB 2未知意义变异体(Vus)具有类似AR年轻细胞的分化模式,其后代表现出相互排斥的kt 19群体。+和KRT 14+细胞(图1.3J以及扩展数据图。4B).

图3:HR乳腺上皮祖细胞表现出分化缺陷和基础分化偏向。
figure3

ad,免疫荧光图像的cKit富集细胞染色KRT 19(绿色)和KRT 14(红色),固定在2天的培养,从一个年轻的AR妇女。a),一位年长的妇女(b),一位35岁的人力资源部女性窝藏着BRCA 1突变(BRCA 1穆特) (c)和一名44岁的人力资源部妇女窝藏着BRCA 2穆特 (d)。标尺,50μm。ej、KRT 14和KRT 19的密度等高线图,将AR年轻妇女培养2d后固定的cKit富集细胞中的平均荧光强度信号(e)、老年妇女(f)和携带生殖细胞突变的HR妇女BRCA 1 (g), BRCA 2 (h), PALB 2 (i)和PALB 2(Vus)+APC(Vus)(j)。实验ad分别重复三次,结果相似。拥有ckit的个人数量+来自于对每一组的代表,具体如下:a三个;b两个;c8只;d六号。

7天后,HR ckit+细胞产生了51%的KRT 14后代。+相对于34%的AR ckit+细胞后代(χ)2测试,P < 0.0001) (Extended Data Fig. 3C-f,我-我)。HR cKit的分化模式+第7天后,按突变分类的细胞在扩展的数据图中显示。3i-k4D。Ckit富集细胞BRCA 1BRCA 2突变主要分化为KRT 14+细胞。Ckit富集细胞PALB 2即使在第7天,突变也无法区分(扩展数据图)。3K)。然而,ckit+细胞内有PALB 2(Vus)的分布更接近AR年轻ckit的特征。+单元(扩展数据图。3L).

CKIT后代+来源于HR上皮的祖细胞表现出一种基础分化偏向的模式,似乎与特定的生殖细胞突变无关。然而,BRCA 2穆特后代最终产生了KRT 14。+也表达KRT 19的后代,而PALB 2穆特载体在分化过程中表现出明显的延迟;在本实验中,大多数细胞作为角蛋白双阳性细胞滞留了很长一段时间。

高危上皮细胞与衰老、炎症和癌症基因的关系

接下来我们比较了从HR女性中分离到的LEPs和MEPs的转录序列(n=11;6BRCA 1穆特,三BRCA 2穆特和两个PALB 2穆特)和年龄匹配的LEPs和MEP从AR妇女中分离出来(n=9)。总共有336个基因在HR LEPs和AR LEPs之间有差异表达(212个上调,124个下调;调整后)。P-值截止<0.05;图1。4A和补充表2)。利用分子标记数据库(MSigDB),对EMT和炎症的标志基因集进行了富集,其中包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因集通过核因子κ-活化B细胞轻链增强子(NF-κB)、白细胞介素-6-JAK-STAT 3和干扰素-γ信号转导(假发现率)<0.0 5;4B)。我们接下来评估AR上皮中年龄依赖性基因表达的变化是否也是HR上皮的一个特征。我们将上述HR转录组数据集与AR、LEPs和从年轻公司分离出来的MEP数据进行合并(n=16岁及以上(n减少乳腺增生症:HR和AR年轻LEPs之间的DE基因中共有452个基因,AR年龄大的LEPs和AR年轻的LEPs之间存在相同的方向,表明这些基因是共同的危险基因,无论是由于衰老还是潜在的遗传风险(图1)。4C和补充表3)。基因本体论(GO)术语被这些常见的危险基因过度表达,包括老化和蛋白质加工术语(图一)。4D)。为了研究人力资源组内部的潜在差异,我们从以下几个方面对LEPs进行了DE分析。BRCA 1穆特BRCA 2穆特航母。BRCA 1穆特MSigdb标记基因集的emt,补体,凝血,血管生成,干扰素-α和-γ反应。BRCA 2穆特LEPs在MYC靶区、版本1和2、E2F靶标和哺乳动物雷帕霉素复合物1(MTORC 1)信号传导靶点(图1)的标记基因集上富集。4E)。这些数据提供了证据,表明AR、老年妇女和HR妇女在LEPs中都有共同的基因表达,这些基因携带生殖细胞突变,增加了他们在任何年龄患乳腺癌的风险。

图4:HR LEPs的转录序列类似于老化的LEPs,并映射到炎症和与癌症相关的通路.

a、HR中DE基因的Volcano图与AR LEPs的比较。b,MSigDB标记基因集在HR LEPs中富集,与AR LEPs相比。转化生长因子-β,转化生长因子-β。c比较三组DE基因的Venn图:HR与AR年轻(≤35岁)、HR与AR年龄大于55岁(>55岁)和AR年龄对AR年轻LEPs。d,GO术语在HR和AR的早期LEPs中都被上调,在共同的基因中被过度表达。圆圈的大小反映了每个术语的基因数目。P调整一下。是调整后的P值用于多个比较。e,MSigDB标记基因集富集于含有LEPs的BRCA 1对决BRCA 2突变。f,g、几种比较之间重叠的基因矩阵。矩阵中的数字表示P值;颜色梯度是日志。2(或)重叠。这个P对每对基因列表,采用Fischer‘s精确测试,对每对基因列表进行单边比较(Alternative=更大)。L.HR.v.AR,与AR LEPs相比,HR LEPs中的基因上调;L.HR.v.AR.Y,HR LEPs中上调的基因与AR年轻LEPs(≤35岁)相比;L.BRCA1.v.non-.RM,携带LEPs的基因上调BRCA 1与不携带从减少乳腺增生症中收集到的任何突变的AR LEPs相比;L.BRCA2.v.non-.RM,在含有LEPs的LEPs中上调的基因BRCA 2与不含任何减少性乳腺增生症突变的AR LEPs相比,HR.v.AR.Y,HR MEPs中的基因比AR年轻的MEPs(≤35岁)高。

我们接下来要研究的是,年龄依赖性和世系特异性基因标记是否与HR上皮细胞中富集的基因集重叠。基因重叠用优势比分析(OR)评估,值<1表示两个基因集之间没有重叠,值>1表示强重叠。23。MEP-特异性基因(补充表)4)与HR LEPs中上调的基因重叠,与年龄匹配的AR LEPs相比,OR值为7.7(P < 0.0001), and with genes upregulated in HR LEps compared with AR younger LEps with an OR of 27.3 (P < 0.0001) (Fig. 4F和补充表5)。这也得到了基因的响应。BRCA 1穆特LEPS和BRCA 2穆特LEPs与来自还原性乳突的AR LEPs的比较(如图所示)。4F)。这表明HR LEPs表达MEP/基础家系的基因,提示谱系保真度的丧失。HR LEPs中上调的基因与MSigDB衰老标志基因重叠,OR为4.1(P=0.016;图1。4G)。此外,我们还通过选择在较老的LEPs中上调的基因与较年轻的LEPs(benamini-hochberg调整后的基因),在LEPs中建立了一个老化特征。P < 0.05; Supplementary Table 6)。我们同样在MEPs(补充表)中建立了一个老化签名。7)。HR LEPs中上调的基因与衰老的LEP基因信号重叠,OR为20(P < 0.0001; Fig. 4G和补充表8)。这表明HRLEPs具有加速衰老和丰富已知参与乳腺癌和炎症的基因通路的转录特征。

在MEPs中,HR细胞中有346个基因与AR细胞相比较(250个上调,96个下调)。5A和补充表9)。MSigDB标记基因具有炎症性(例如,TNF-α信号和干扰素-γ反应)和促进侵袭性生物学(例如,KRAS信号;图1),HR MEPs被丰富。5B)。在HR MEPs中过度表达的KEGG通路除了胰岛素抵抗外,还包括影响细胞外通讯的途径,如紧密连接和细胞因子(图1)。5C)。HR MEPs与AR老年MEPs之间仅有72个基因DE(图1)。5D和补充表10),表明它们在转录过程中有相似之处。HR MEPs中上调的基因与年龄匹配的AR MEPs和AR年轻MEPs与LEP特异性基因重叠(补充表)11),分别为25和12.3(P < 0.0001 for both; Fig. 5E和补充表12)。这表明HR MEPs在其转录序列中对某些LEP特异性基因进行了富集,这与谱系保真度的丧失是一致的。HR MEPs中上调的基因也与MSigDB衰老标志基因重叠,OR为3.3(P=0.063;图1。4G和补充表8)。我们建立的MEPs老化特征与HR MEPs中上调的基因重叠,OR为60(P < 0.0001; Fig. 4G和补充表8)。总之,HR上皮的转录序列在炎症和促癌途径中富集,并与衰老和衰老标志基因重叠。HR、LEPs和MEPs对具有相反上皮系特征的基因集有一定的富集作用,提示谱系忠诚缺失是HR上皮和老年上皮共同的特性。

图5:HR MEPs的转录序列类似于老年MEPs,并映射到炎症和与癌症相关的通路.
figure5

a、HR中DE基因的Volcano图与AR MEPs的比较。b,MSigDB标记基因集在HR MEPs中富集,与AR MEPs相比。c与AR MEPs相比,KEGG通路在HR MEPs中表达过高。圆圈的大小反映了每条通路的基因数目。d3种比较的DE基因的Venn图:HR与AR年轻(≤35岁)MEPs、HR与AR年龄大于55岁(>55岁)和AR年龄对AR年轻MEPs。e一个跨几个比较的基因重叠的矩阵。矩阵中的数字表示P值,而颜色梯度是日志。2(或)重叠。这个P对每对基因列表,采用Fischer‘s精确测试,对每对基因列表进行单边比较(Alternative=更大)。MHR.v.AR,HR MEPs中上调的基因与AR MEP相比;M.HR.v.AR.Y,HR MEPs中上调的基因与AR年轻的MEPs(≤35岁)相比;M.BRCA1.v.NO.RM,MHR.v.AR.Y中表达上调的基因BRCA 1与AR MEP相比,AR MEP不存在从减少乳腺增生症中收集到的任何突变。

讨论

在本研究中,我们报告了与病理正常乳腺上皮细胞加速生物老化相一致的组成、转录和功能特征,这些上皮细胞携带有害的生殖细胞突变,已知这些突变使妇女易患乳腺癌。加速老化的特征包括上皮细胞的保真度下降,表达典型与MEPs相关的蛋白质和基因的LEPs比例增加,以及cKit中的基本分化偏向。+祖先。据推测,携带乳腺癌的妇女的乳腺癌发病率增加了。BRCA 1, BRCA 2PALB 2生殖细胞突变是由于dna损伤修复方面的缺陷造成的。24,25。在修复各种dna损伤方面的不足可以加速DNA像差的积累,与AR个体的细胞相比,使生物老化的速度比时间增长的年龄快。3。因此,我们可以合理地假设加速衰老的特征是乳腺组织的一个特征,而乳腺组织中隐藏着这样的生殖细胞突变。的确,携带生殖线的女性BRCA 1突变表现为卵巢老化加速,如原始卵泡丢失和卵巢储备减少。25,26,27,据报道更年期早于AR妇女23。我们的HR HMEC菌株和乳腺组织切片来自绝经前和绝经后妇女,表明这些加速衰老的表型不一定依赖于激素的退出。我们认为,在LEPs中失去谱系保真度和获得基本特征可能是乳腺组织的一个特征,即更容易发生癌症,而不考虑潜在风险的具体来源。

从病理正常乳腺组织中获得LEPs的基础特性BRCA 1, BRCA 2PALB 2种系突变表现为MEP相关中间丝蛋白增加,MEP、衰老、EMT和衰老基因信号增加。以前与之相关的其他基本属性BRCA 1穆特上皮包括波形蛋白和整合素-α的表达增加。6-在三维培养中表达的腺泡上皮细胞和KRT 14-表达的腺病毒LEPs。28。MEPs被认为是通过产生基底膜成分和形成一个动态屏障来抑制肿瘤的,这种屏障阻止癌细胞从导管进入基质。29,30。至关重要的是,HR和老年LEPs似乎没有转化为MEPs,但他们可能获得一些MEP功能。也许LEPs能够进入分子程序,使MEP能够在细胞外基质丰富的微环境中进行业务,并在细胞间质中进出,在衰老和HR状态下是有害的。例如,与较年轻的AR HMECs相比,HR和较老的HMECs在塑料上培养时表现出丰富的LEPs。MEPs在组织培养塑料等刚性表面上的增殖速度快于LEPs。31因此,HR和较老的LEPs在培养中的成功表明,他们已经获得了成功所需的关键基因程序,在一个通常更为理想的基础细胞类型的微环境中。KRT 14在HR LEPs中的表达增加,可能表明他们参与了攻击生物学的分子程序。表达krt 14的乳腺癌细胞被证明领导了集体侵袭过程,并激活了一个基础基因程序,其中包括TP 63Krt 5,用于乳腺癌细胞转移的初始阶段。32。在肺癌发展的八个阶段,我们追踪到了家族特异性的丧失,导致了一个高可塑性的细胞亚群,这些细胞具有增殖性和耐药能力。33。我们推测,在HR和老年上皮中失去家族忠诚是失去家族特异性的前兆,这被认为是引发癌症的一个关键事件。34.

大多数人力资源工具包+先祖窝藏BRCA 1在我们的实验中,与AR对照相比,突变作为未分化的祖细胞存在很长的一段时间。当这些祖细胞最终分化时,就会产生一种基本的偏见。人力资源工具包中的偏差+细胞在概念上与描述起源于基底细胞为腔内祖细胞的报道相一致。9,10,11,12,它们被显示为在BRCA 1穆特载体9。单细胞RNA测序(rna-seq)还揭示了cKit腔前体细胞在肿瘤及癌旁组织中的扩展。BRCA 1穆特载体12。我们在HR ckit中观察到的分化缺陷+细胞也与在腔内祖细胞中报告的异常表型相一致。BRCA 1穆特前文所述9。然而,我们测量了基于分化标记的谱系偏差,Lim等人。以.的能力为特征的异常表型BRCA 1穆特祖细胞形成独立于B27补充剂的集落,其中含有正常祖细胞生长所需的孕酮9。除了BRCA 1穆特载流子,我们发现基本的分化偏倚是BRCA 2穆特还有旧的AR ckit+祖先。PALB 2穆特M87A培养基不含孕酮,支持AR和HR HMECs的稳健生长。M87A支持多系上皮细胞的生长,而我们先前证明了无血清培养基的定义,如Romijn等人所用的培养基。35,使正常的lep进入压力相关的早期衰老阶段。36。CKIT中的分化缺陷+祖细胞似乎是来自容易引发癌症的女性上皮细胞的共同属性,无论是衰老还是潜在的遗传风险。腔内癌被认为起源于成熟的腔细胞,而三阴性乳腺癌(Tnbcs)则被认为是由ckit引起的。+祖细胞9,10,11,12。我们推测,在HR和AR老年祖细胞中观察到的分化缺陷是癌症易感性和致癌途径上的一个共同的收敛点,它们后来会分化,产生不同的癌症亚型(例如,tnbc在BRCA 1穆特37,以及B在BRCA 2穆特PALB 2穆特37,38)。我们可以合理地推测,携带这些不同生殖细胞突变的上皮和间质产生的微环境有利于以亚型特异性的方式生长起源于癌细胞的细胞。

我们主要集中在理解LEPs的变化,因为它们显示出最显著的年龄和风险相关的变化。7,39。然而,我们也检测到HR MEPs的转录变化与谱系保真度的丧失相一致,但HR和AR MEPs之间的差异在质量上不如在LEPs中观察到的差异明显。这与我们以前的工作是一致的,在这项工作中,与年龄相关的MEPs变化很难被检测到。8,39。我们还显示,HR hmecs中的MEP群体也成比例地减少,这也是与年龄相关的变化平行的。7。MEP特异性转录因子p63和tcf 7在BRCA 1穆特MEP和DCIS,造成MEP谱系保真度下降和MEP比例下降40。我们观察到这两种转录因子在HR MEPs中均有减少,但没有达到统计学意义。我们的基因重叠分析显示,在HR MEPs中,LEP特异性基因明显富集(包括BRCA 1, BRCA 2PALB 2突变载体),这与丁氏等人所描述的MEP分化程序的扰动概念是一致的。40。随着年龄的变化,MEPs在LEPs中的表达受到了影响。8一个令人兴奋的可能性是,LEPs的保真度下降是由MEPs顶端表面的风险促进微环境驱动的。

加速衰老是高风险生物学的基础,这一前景值得进一步探索,因为它为基于衰老生物学的癌症预防策略概念化提供了新的、不可探索的途径。LEPS的谱线保真度损失与cKit中的区分缺陷+祖细胞似乎出现在多种不同的HR场景中:例如,老化和携带BRCA 1, BRCA 2PALB 2突变。然而,事实仍然是,不同的亚型癌症预计会出现在这四个样本组。因此,分化偏见和血统忠诚度的丧失可能只是诱人的红鲱鱼,或者这些固有的风险来源伴随着独特的微环境变化,赋予ckit一种适应性优势。+具有某些固有状态的细胞或其后代41。例如,尽管在体外,Lim等人。显示BRCA 1在高压力的培养环境中,上皮细胞似乎比正常人更有优势。9。EMT、NF-κB信号和JAK-STAT 3信号在HR、LEPs和MEPs中的富集可能提示早期局部微环境发生变化,从而创造适应性生态位,并增加乳腺癌从特定来源细胞分化的易感性。更详细地研究大DCIS和良性乳腺疾病患者的祖细胞分化缺陷和上皮丢失,并结合纵向文献,将确定相同的乳腺老化生物标记物是否是乳腺癌组织中普遍出现的特性,即使在散发的癌症中也是如此。Ckit+祖先和失去血统忠诚度可能是预防癌症的有价值的靶点。


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