您好,请问有什么可以帮到您的。 点击这里给我发消息
武汉新启迪生物科技有限公司
新启迪-您的生物科研好伙伴!2008-2021
Wuhan Xinqidi Biotech Co.Ltd
本企业通过iso9001质量体系认证

自我反应性控制幼稚CD8的功能多样性+补药Ⅰ型干扰素对T细胞的影响

 二维码
发表时间:2021-10-19 10:02作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

T细胞受体与自身配体相互作用的强度影响抗原特异性免疫应答.然而,确切的功能和潜在的机制尚不清楚。在这里,我们证明了天真的CD8+由于对Ⅰ型干扰素的反应不同,具有较高自我反应性的T细胞表现为异质性,因此产生了三种不同的亚群,即cd5。罗氏Ly6C、CD5Ly6C,和CD5Ly6C+细胞。CD5Ly6C+细胞与CD5不同罗氏Ly6C和CD5Ly6C细胞的基因表达谱和功能特性。此外,CD5Ly6C+细胞在病毒感染时表现出更广泛的抗原特异性扩张,增强分化为终末效应细胞,减少记忆细胞的产生。CD5的这些特征Ly6C+细胞在稳定状态下留下印记,即使是单克隆的CD8,也能观察到Ⅰ型干扰素的依赖性。+T细胞群这些发现表明,自我反应控制着幼稚CD8的功能多样性。+T细胞通过补药Ⅰ型干扰素信号传导。

导言

CD8+T细胞在小鼠和人的表型、功能和组织分布上存在差异。1,2,3。这些特征在效应者和记忆群体中特别明确,并进行了深入的研究,以阐明造成这种异质性的因素和机制。4,5。不像抗原启动的细胞,幼稚的CD8+T细胞通常被认为是一个同质种群,很少有人关注它们的复杂性。然而,最近的研究表明,这类细胞是不均匀的,并被分离成不同的亚群体,表现出不同的功能特性。6,7,8,9,10。T细胞受体(TCR)与自配体相互作用的强度是导致这种差异的主要因素。由于强度在单个TCRs之间变化很大,并且与CD5的表达成正比。11,12,13,许多研究集中在CD5低(CD5)的比较上。罗氏)和高(CD5))细胞。在这些研究中,CD5细胞对各种刺激表现出更好的功能反应,并对病原体感染表现出更广泛的抗原特异性扩展。7,8,9,支持当前的观点,即内在的自我反应决定了幼稚的CD8的免疫反应。+T细胞池

CD5之间差异反应的精确机制罗氏和CD5细胞不清楚。Tcr与同源异型抗原的亲和力与自配体之间的巧合正相关似乎解释了这一现象。8。因此,CD5具有较高自我反应性的细胞必须总是比cd5诱导更多的抗原特异性免疫反应。罗氏细胞8。虽然建立这种关系的机制尚未得到解决,但这一观点表明免疫系统会产生cd5。罗氏细胞不必要地随着CD5的逐渐积累而消失细胞8。或者,在其他研究中,基于cd5的研究结果提出了不同的解释。细胞在本质上比CD5更有功能。罗氏细胞6,9。因此,CD5细胞在佛波酯刺激下有较高的细胞外信号调节激酶活性和更多的IL-2生成。9用白细胞介素(IL)−2、IL-7、IL-15等细胞因子刺激细胞增殖率高于CD5。罗氏细胞6。CD5增强反应细胞也被证明与编码与细胞活化和分裂相关的基因的转录本的mRNA表达增加有关。7,10.

尽管自我反应性差异地影响了幼稚T细胞的固有功能特性并诱导了不同的免疫反应,但最近的研究表明cd5的发现使这些问题更加复杂。TCR结扎后细胞的反应性低于CD5。罗氏细胞14。虽然这一结果与cd5作为tcr信号负调控者最初定义的角色是一致的。13这一发现使人们很难理解自我反应对T细胞功能的上述积极作用。此外,与CD5不同罗氏细胞、CD5细胞有一小部分表达Ly6C和CD 183的亚群体7虽然这些子集的功能角色尚未确定。因此,不同的T细胞免疫反应可能不是由于TCR强度的不同而产生的,而是反映了其他几个因素(如生理相关细胞因子)在稳定状态下的间接作用。在这种情况下,CD5具有较高自我反应性的细胞比cd5有更大的优势。罗氏细胞对这些细胞因子的反应6,10,15。因此,哪些细胞因子参与其中,以及它们如何影响T细胞的固有功能和命运的问题,在胸腺和胸腺后阶段都需要澄清。

在此,我们发现相对较高的自我反应能力促进了幼稚CD8的表型和功能的多样性。+T细胞通过调节I型干扰素(IFN)信号的不同程度。这些发现为研究T细胞自身反应性与生理信号的协同作用机制提供了理论依据,从而影响了幼稚CD8细胞的功能适应度。+T细胞池,将I型IFN作为协调因子参与适应性T细胞免疫应答的复杂性和多样性。

结果

CD5幼稚CD8+T细胞由表型异质亚组组成。

幼稚的CD8+T细胞,CD5结果显示,与cd5相比,细胞表现出更复杂的表型,并能诱导更多的抗原特异性免疫应答。罗氏细胞7。为了探讨这种现象的机制,我们首先比较了CD5之间的表型差异。罗氏和CD5CD 44亚群罗氏幼稚CD8+C57BL/6(B6)小鼠T细胞。在被评估的各种标记中,Ly6C和CD 183(在较小程度上CD 103)表现出最显著的差异(CD5的~2-6倍)。比CD5罗氏细胞;附图1A)。事实上,CD 44的一小部分罗氏幼稚细胞表现出较高的Ly6C和CD 183的表达,而CD 103的表达较低,尽管这种特征在CD 44中是典型的。记忆表型(MP)细胞(图)。1A)。大约所有Ly6C+、CD 183+,CD 103CD 44亚群罗氏CD8+细胞来源于CD5细胞(~90%~95%)1B)。尽管表达了这些记忆标记,但这些细胞仍表现为表型和功能上的幼稚,表现为CD 44、CD 122、Ly6C和CD 183的表达明显低于MP细胞(或细胞因子、IL-7和IL-15),而PMA和离子霉素刺激5h后产生IFN-γ的能力低于MP细胞(附图)。1B-d).

图1:外周幼稚CD8+T细胞具有典型的异质性。
figure1

aLy6C、CD 183和CD 103在B6CD44上的表达罗氏和CD 44CD8+T细胞bLy6C百分比+、CD 183+,CD 103CD5细胞罗氏和CD5B6幼稚CD8+T细胞(n=12只Ly6C小鼠+和CD 183+, n=5只CD 103小鼠). c占CD 183的百分比+和CD 103Ly6C细胞和Ly6C+CD5B6幼稚CD8+T细胞(n=12只CD 183小鼠+, n=7只CD 103小鼠). d占CD 183的百分比+和Ly6C+CD 24细胞嗨,CD 24罗氏CD5罗氏,以及CD 24罗氏CD5B6CD4CD8+胸腺细胞(n=12只Ly6C小鼠+, n=6只CD 183小鼠+). e脾胸腺Ly6C+B6幼稚CD8+T细胞在出生后随时间变化(每组3只)。f脾胸腺Ly6C+B6幼稚CD8+青年和老年小鼠T细胞(n=每组3只)。两尾未配对学生的统计显着性得到证实t-测试。结果为平均±SD。数据代表2-3个独立实验。源数据作为源数据文件提供。

在分析Ly6C之间的血缘关系时+、CD 183+,CD 103CD5中的子集细胞,CD 183的大部分+和CD 103在Ly6C中观察到的亚群(80~85%)。+细胞(图1.1C)。同样,在胸腺里,几乎所有的Ly6C+CD5细胞成熟CD 24细胞罗氏(但不是不成熟的CD 24)CD4CD8+单阳性(SP)胸腺细胞(图)。1D)。在这些CD 24中罗氏SP胸腺细胞CD 103细胞主要见于CD5。细胞(~85-90%);附图。1E)。CD 183+细胞,不像Ly6C+和CD 103细胞,很少在胸腺中观察到(如图所示)。1D),意味着胸腺后世代。

接下来,我们检查了外周Ly6C的程度。+子集来自胸腺对应体。在新生和幼龄B6小鼠中,胸腺Ly6C所占比例+细胞保持不变,约占CD4总数的5-10%。CD8+SP胸腺细胞,直到出生后第40天(图1.1E,左)。然而,脾Ly6C+细胞占CD 44总数的20%罗氏CD8+T细胞在出生后立即上升到30%,在第5天增加到30%,在第7天略有下降,随后保持在20-30%(如图所示)。1E,左)。因此,脾Ly6C+细胞数量在新生儿时期(1-7天)仅略有增加。但在第40天,其数量显著增加(~6倍于胸腺Ly6C)。+细胞1E,右)。脾脏CD 183异常高频率+细胞(约占幼稚CD8总数的40%)+细胞在第1天开始观察到,第3天(~10%-20%)和第40天(<10%)细胞数急剧下降,但在此期间细胞数逐渐增加(补充图1)。1F)。这些数据表明外围天真的Ly6C+子集来自胸腺和周围(分别为33%和67%),其中CD 183部分。+细胞来源于周围。

外周血Ly6C比例+(CD 183)+)子集随着时间的推移(>1年)保持相对不变,尽管由于胸腺退化,老年小鼠的实际细胞数量减少(如图所示)。1F和补充图。1g)。值得注意的是,脾脏幼稚的Ly6C+CD5与Ly6C相比,细胞在tcr、α-和β-链的多样性上没有明显的偏差。CD5细胞(甚至在Ly6C中)CD5罗氏细胞;附图)。这些结果表明外周幼稚的CD8+T细胞表现为典型的异质性,尤其是在CD5方面。细胞,主要分为三个不同的子集,CD5。罗氏Ly6C、CD5Ly6C,和CD5Ly6C+细胞(以下简称CD5)罗氏、Ly6C,和Ly6C+(分别为细胞)。

幼稚CD8+T细胞持续接触Ⅰ型干扰素,处于稳定状态。

考虑到外围天真的Ly6C+细胞处于稳定的维持状态,我们研究了影响细胞稳态的因素。证明I型干扰素能影响CD4中Ly6C的表达+和CD8+T细胞群16,17。事实上,Ly6C的百分比和数量+幼稚CD8+缺乏Ⅰ型干扰素受体的小鼠T细胞显著降低(伊夫纳−/−)或Ⅰ型干扰素和干扰素-γ(伊夫纳−/−.Ifngr−/−)和缺乏STAT 1的小鼠(STAT 1−/−),这是IFN信号的重要组成部分,比野生型(WT)小鼠更重要。2A)。这种减少在脾脏,甚至在胸腺中观察到(分别减少4~5倍和20倍),如图所示。2B)。不像Ly6C+细胞,CD 183+这些小鼠的细胞百分比和数量保持不变(补充图)。2A)。Ly6C也需要Ⅰ型IFN信号+新生小鼠的细胞生成(附图。2B),显示他们一生中持续接触I型干扰素。此外,用干扰素-β体外培养,但不与其他细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IL-23和TGF-β)共同诱导纯化的Ly6C表达。幼稚CD8+T细胞(图1.2C和补充图。2C)。此外,很大一部分WT,但不是伊夫纳−/−、Ly6C幼稚CD8+T细胞能转化为Ly6C+细胞在过继转移到B6宿主后的第7天(见图)。二维空间)。相反,CD 183+虽然细胞水平较低,但在WT和伊夫纳−/−供体细胞,两个捐助者仍保留CD 44罗氏幼稚表型(附图)2D,e).

图2:Ⅰ型干扰素和自身TCR对诱导Ly6C的发生至关重要。+幼稚CD8+T细胞
figure2

aB6 Ly6C百分比+幼稚CD8+不同I型IFN缺乏小鼠脾脏T细胞。bB6 Ly6C的百分比和绝对数+幼稚CD8+不同I型IFN信号缺乏小鼠脾脏和胸腺T细胞n=6对于WT,n=6伊夫纳−/−, n=4STAT 1−/−, n=3伊夫纳−/−Ifngr−/−老鼠)。c诱导Ly6C百分比+B6Ly6C细胞幼稚CD8+T细胞体外(n=每组3只)。d诱导Ly6C的百分比和绝对数+来自WT和伊夫纳−/−B6 Ly6C幼稚CD8+体内T细胞(n=每组4只)。E, f诱导Ly6C百分比+CD5细胞罗氏和Ly6CB6幼稚CD8+用干扰素-β培养的T细胞(n=每组6只)。gMRNA表达Ly6c1来自CD5罗氏和Ly6CB6幼稚CD8+用干扰素-β培养的T细胞(n=3只,每组3只)。hCD5中STAT 1和STAT 2的磷酸化罗氏和Ly6C用干扰素-β培养的细胞。i诱导Ly6C百分比+B6Ly6C细胞及Ly6C MFI幼稚CD8+T细胞转移到WT或TAP 1−/−寄主(n=每组4只)。j诱导Ly6C百分比+B6,P14或OT-I Ly6C的细胞幼稚CD8+T细胞转移至B6或P14宿主(n=每组4只)。两尾未配对学生的统计显着性得到证实t-测试。结果为平均±SD。数据代表2-3个独立实验。源数据作为源数据文件提供。

Ⅰ型干扰素诱导的幼稚CD8中的Ly6C+T细胞依赖于tcr自相互作用

Ⅰ型干扰素对Ly6C选择性影响的原因分析+细胞生成,仅限于CD5而不是CD5罗氏细胞,不清楚。鉴于自身反应性与细胞因子反应性之间的已知相关性6我们假设涉及两个参数,即TCR自身相互作用的强度和对Ⅰ型干扰素的相对敏感性。为了研究这个,纯化的Ly6CCD5罗氏和CD5幼稚CD8+T细胞在不同剂量的干扰素-β存在下培养。2e-h和补充图。2F)。CD5细胞对Ⅰ型干扰素的敏感性明显高于CD5。罗氏细胞,导致Ly6C在蛋白和mRNA水平的表达(见图)。2e-g)。这种不同的敏感性并不归因于IFNAR的不同水平(IFNAR 1和IFNAR 2;补充图)。2G)而是下游信号程度的变化,如rn-β诱导的cd5中较强的STAT 1/2磷酸化所证明的那样。比CD5罗氏细胞(图1.2H).

考虑到cd5的自我反应能力更强细胞(NURE 77);补充图。2H)18,我们接下来研究了自身TCR信号是否确实影响T细胞对I型干扰素的敏感性。以下三项意见证实了这一现象。第一,用可溶性抗CD3(补充图)治疗后,IFN-β诱导的Ly6C表达水平显著升高。2I)。第二,Ly6C+细胞合成不良TAP 1−/−通过Ly6C进行传输的主机CD8+供体细胞(图1.2I)。第三,最重要的是,当Ly6CB6,P14和OT-I CD8+T细胞共转染B6宿主,Ly6C。+细胞发生与供体细胞的内在自我反应性成正比(即B6<P14<OT-I)。2J,左)。然而,当共同转移到p14宿主时,p14供体显示出~2-3倍的Ly6C。+细胞发生(可能是由于供体和宿主P14细胞之间对同一自配体的强烈的克隆内TCR竞争而减少的自我相互作用),而OT-I和B6供体要么保持不变,甚至增加(图一)。2J)。与这些发现一致的是,OT-i供体细胞被移植到TAP 1−/−宿主或OT-Ⅰ宿主显示Ly6C显著降低。+细胞产生和干扰素-β-诱导STAT 1磷酸化(附图)。2J,k)。这些结果强烈地提示,自tcr信号对于促进Ⅰ型干扰素的敏感性是至关重要的,并且是Ⅰ型干扰素诱导的Ly6c的正调节因子。+细胞生成。

由于Ⅰ型干扰素是病原体感染过程中产生的一种促炎细胞因子,即使在稳态状态下,诱导Ⅰ型干扰素产生的刺激类型仍未确定。Ly6C+幼稚CD8+在无菌(GF)和无抗原(AF)条件下饲养的小鼠,在常规的无病原体(SPF)小鼠中也能看到类似的T细胞(补充图)。2L),暗示一个自我的角色,而不是一个外来的成分。总的来说,我们建议天真的CD8+T细胞池持续接收I型干扰素和自配体的补强信号.这一机制可归因于CD5。对这些提示可能比CD5更敏感的细胞。罗氏细胞和作为Ly6C的主要生产者+子集。

Ⅰ型干扰素对幼稚CD8转录体的影响+T细胞处于稳定状态

为了进一步了解补药Ⅰ型干扰素的作用,我们纯化了b6幼稚CD8。+CD5罗氏、Ly6C,和Ly6C+细胞(附图)3A)并通过RNA-Seq分析比较了它们的基因表达谱。许多基因在cd5中要么上调要么下调。细胞与CD5比较罗氏细胞(图1.3A)。在Ly6C中,大约56-75%的基因受到了类似程度的调控。和Ly6C+而~15%的细胞在Ly6C中受到更多的调控。+比Ly6C在Ly6C细胞中,有9~30%的细胞受到较多的调控。比Ly6C+细胞(图1.3B)。在微阵列分析中也观察到了类似的结果(补充图)。3B,c)。特别是,Tbx 21, 埃梅斯, Il18RAP,和CCL 5已知在CD5中有较高表达的基因比CD5罗氏细胞7,10,在Ly6C中的表达水平是Ly6C的2-5倍。+比Ly6C中的子集子集(图)3C)。胸腺Ly6C也有类似的增加。+与Ly6C比较的子集子集(来自CD5)CD 24罗氏CD4CD8+SP胸腺细胞;附图三维空间)。这些数据表明Ly6C+子集容易获得独特的转录,从胸腺发育的SP期开始。

图3:Ⅰ型干扰素对幼稚CD8转录的影响+T细胞处于稳定状态。
figure3

a被上调的基因的热图(n=328个基因)(左面板)或下调(n=225个基因)(右面板)在FACS中-纯化的B6幼稚CD5(Ly6C)和Ly6C+)CD8+T细胞与CD5细胞的比较罗氏细胞。颜色标度是基于Z-得分从-1.2(绿色)上升到1.2(红色)。b饼图展示了Ly6C中受到类似或不同调控的基因和Ly6C+细胞上(左)或下调(右)基因。cRT-PCR结果Tbx 21,Eomes,Il18 RAPCCL 5CD5基因罗氏、Ly6C和Ly6C+细胞。Y轴代表相对mRNA的表达(n=每组3只)。两尾未配对学生的统计显着性得到证实t-测试。结果为平均±SD。代表两个独立实验的数据。d, eCD5之间的GSEA结果罗氏和Ly6C,或Ly6C和Ly6C+细胞通路:调节细胞因子介导的信号通路(GO:0001959)d)和调节I型干扰素介导的信号通路(GO:0060338)e). fCD5中上调或下调基因间的Venn图细胞和干扰素-β调节基因。g用或不加干扰素-β培养的细胞间的谷胱甘肽能产生上(右)或下调(左)基因。h在CD5之间进行GSEA。罗氏和Ly6C、CD5罗氏,和Ly6C+,或Ly6C和Ly6C+为指明的路径。GSEA浓缩分数(ES)代表最小或最大运行浓缩分数的绝对值。颜色标度是基于ES,从0(白色)到1.0(红色)。源数据作为源数据文件提供。

接下来,我们研究了Ly6C的不同转录序列和Ly6C+亚群是由于对Ⅰ型干扰素的不同敏感性而产生的。由基因集富集分析(GSEA)确定,Ly6C。+与调节细胞因子反应相关的基因,特别是Ⅰ型干扰素反应,细胞的富集分数高于Ly6C。细胞,含CD5罗氏细胞的浓缩分数最低(图)。3D,e和补充图。3E-g)。因此,有些基因,而不是所有基因,在Ly6C中受到不同的调控。+(相对于Ly6C)细胞对I型强直性干扰素信号反应相对较高。为了检验这个假设,天真的CD8+T细胞经干扰素-β培养1d后,进行RNA-Seq检测.随后,与图中所示的RNA-Seq数据进行了再分析.3A。约30%的基因在cd5中上调或下调。细胞(包括Ly6C)和Ly6C+)与CD5中的比较罗氏细胞与干扰素-β治疗所调控的基因重叠(如图所示)。3F)。这些重叠的基因确实表现出较高的富集分数,这些基因被IFN-β以类似的方式调控(如图所示)。第三代).

了解上述转录数据与cd5功能特性的关系。罗氏、Ly6C,和Ly6C+细胞及其对Ⅰ型干扰素的反应,我们利用公共GO和IMMGEN RNA-Seq数据库连接各种T细胞功能反应。10,19。Ly6C+与cd5相比,Go和IMMGEN定义的功能反应使细胞表现出更高的基因富集分数。罗氏细胞甚至Ly6C细胞(图1.3H)。其中,第一组和第三组(与效应反应、细胞分裂和增殖有关)受到Ⅰ型干扰素(表)的显著影响。1和补充表1;Eq.1还有Eq。2)。这些数据共同强化了天真的CD8的观点。+T细胞对补药Ⅰ型干扰素的反应取决于其内在的自我反应性,不仅影响其表面表型,而且影响转录,可能导致不同的功能特性。

表1干扰素-β对CD5间异基因簇核心富集基因的影响罗氏和CD5幼稚CD8+T细胞

Ly6C+细胞以一种依赖于干扰素的方式表现出增强的功能特性。

考虑到Ⅰ型干扰素对转录的不同影响,我们研究了CD5罗氏、Ly6C,和Ly6C+细胞的功能特性确实不同。为此,我们研究了幼稚CD8的先天功能。+T细胞20。用IL-12和IL-18(±IL-2)培养B6脾细胞12-24 h,检测CD5中IFN-γ的产生。罗氏、Ly6C,和Ly6C+细胞(图1.4A、顶部)。Ly6C+细胞产生的干扰素-γ量高于CD5。罗氏细胞甚至Ly6C细胞(图1.4A),虽然Ly6C的这种反应水平+细胞数远低于CD 44细胞。MP细胞(附图)4A)。在P14 CD8中也有类似的结果。+对应方(附图)4B)。然而,胸腺Ly6C+白细胞介素-12/白细胞介素-18不能产生干扰素-γ(补充图).4C),建议与此属性相关的胸腺后编程。

图4:Ⅰ型干扰素对Ly6C功能的影响+幼稚CD8+T细胞
figure4

a干扰素-γ分泌CD5的研究罗氏、Ly6C,和Ly6C+B6幼稚CD8+T细胞(n=每组3只)。b干扰素-γ分泌CD5的研究罗氏和CD5幼稚CD8+T细胞来自WT或伊夫纳−/−老鼠(n=每组6只)。c相对IFN-γ分泌CD5的研究罗氏、Ly6C,诱导的Ly6C+(InLy6C)+)供体细胞和宿主Ly6C+细胞(n=每组4只)。d干扰素-γ分泌CD5的研究罗氏、Ly6C,和Ly6C+B6幼稚CD8+用对照抗体或抗IFNAR1Ab在体内处理T细胞。n=每组6只)。两尾未配对学生的统计显着性得到证实t-测试。结果为平均±SD。数据代表2-3个独立实验。源数据作为源数据文件提供。

接下来,我们研究了Ly6C的增强反应+细胞依赖于I型IFN,WT和伊夫纳−/−用IL-12/IL-18培养脾细胞,分析其产生干扰素-γ的情况。4B、顶部)。值得注意的是CD5罗氏细胞与CD5比较细胞,如Ly6C+幼稚CD8+细胞缺失伊夫纳−/−老鼠。WT和伊夫纳−/−CD5罗氏细胞对IFN-γ的产生无明显影响。4B)。然而,在CD5中细胞内,干扰素-γ的产生明显降低。伊夫纳−/−细胞比WT细胞减少了26%-50%;如图所示。4B).

降低干扰素-γ产生能力伊夫纳−/−CD5细胞提出的问题是,这些细胞需要多长时间暴露在I型干扰素中才能完全发挥作用。因为Ly6C的一小部分细胞转化为Ly6C+细胞在一周内在周围(图)。二维空间),我们检查了Ⅰ型干扰素是否是新诱导的(In)Ly6C。+细胞(InLy6C)+)还获得增强的功能能力。为此,纯化了Ly6C幼稚CD8+将细胞转移到B6宿主,7d后用IL-12/IL-18处理脾细胞,进行干扰素-γ的产生分析。4C、顶部)。Ⅰ型干扰素诱导供体来源Ly6C+细胞(InLy6C)+)证实的干扰素-γ的产量可与先前存在的宿主来源的Ly6C相当(或略低)。+细胞(宿主Ly6C)+),两者的γ产量均高于cd5。罗氏和Ly6C捐献者(图1.4C).

为进一步证实上述发现,用抗IFNAR治疗小鼠体内失去Ⅰ型干扰素信号的小鼠B6脾细胞,用IL-12/IL-18进行培养,并进行IFN-γ产生分析(图一)。4D、顶部)。抗IFNAR治疗Ly6C+(但不是CD5罗氏或Ly6C)细胞与对照组相比,干扰素-γ的产生减少了18~47%。+细胞(图1.4D)。此外,与发现自tcr信号是一种正调节的补药Ⅰ型干扰素反应,幼稚的cd8的发现是一致的。+T细胞转移到TAP 1−/−与转移到B6宿主的细胞相比,宿主细胞IL-12/IL-18诱导的IFN-γ产生显著降低(附图)。4D)。这些数据表明Ly6C增强的功能适应度+细胞是自我驱动和获得后胸腺,至少在一定程度上,通过一种机制依赖于长期持续接触紧张型干扰素在一个稳定的状态。

Ly6C+细胞比Ly6C诱导更多的抗原特异性扩增。细胞对LCMV感染的反应

考虑到明显不同的功能能力,我们测试了对病原体感染的实际免疫反应。为此,B6幼稚的CD5罗氏、Ly6C,和Ly6C+CD8+T细胞共转染B6宿主(第1组,CD5)。罗氏+Ly6C;第2组,CD5罗氏+Ly6C+第3组,Ly6C+Ly6C+按1:1比例,其次为淋巴细胞性脉络膜脑炎病毒(LCMV)感染,并于感染后第7天(7 Dpi)分析供体扩张情况(图7)。5A、顶部)。总体来看,CD8+供体细胞,同时涉及Ly6C和Ly6C+细胞,显示出比CD5更多的膨胀罗氏共同转移的细胞(如图所示)。5A(第1组和第2组),这与先前使用未分馏的CD5进行的研究结果一致。细胞7。令人惊讶的是,当比较被分割的CD5的反应时Ly6C和Ly6C+Ly6C细胞+细胞比Ly6C表现出更多的膨胀细胞(图1.5A,第3组)。LCMV GP 33-和NP 396特异性CD8也有类似的结果。+供体细胞(图1.5A、1~3组及附图。5A).

图5:Ly6C+细胞在LCMV感染后表现出更大的扩张能力。
figure5

aCD 44中每个捐助方子集的比例CD8+(上)或CD 44CD8+GP 33-四聚体+B6供体细胞(下)n=组1的12只小鼠,n=11只小鼠(第2组和第3组)。b共转P14亚群的百分比和捐助者回收率(n=21只小鼠,第1/2/3组,n=7只小鼠(1组、2组和3组)。c捐助方恢复P14 CD5相对于P14 CD5的子集罗氏细胞(n=21只小鼠CD5(共计)n=7只Ly6C小鼠、Ly6C+CD 183,和Ly6C+CD 183+). d单独转移的P14子集的百分比和捐助者回收(n=20只CD5小鼠罗氏, n=21只Ly6C小鼠, n=25只Ly6C小鼠+). e占P14 CD 44的百分比CD8+BrdU+供体细胞(n=每组7只)。f先前停泊在B6主机上的P14亚群的百分比和捐助者回收(n=8只小鼠CD5罗氏, n=8只Ly6C小鼠, n=4只小鼠为inLy6C+(D7)和InLy6C+(D21)n=8只小鼠为FreshLy6C+)。两尾未配对学生的统计显着性得到证实t-测试。结果为平均±SD。数据代表2-3个独立实验。源数据作为源数据文件提供。

Ly6C的高膨胀率+细胞与Ly6C的比较和CD5罗氏细胞并不是由于同源肽的TCR亲和力不同所致,几乎相同的TCR与GP 33-或NP 396-MHC四聚体的结合证明了这一点(补充图1)。5B)。进一步排除多克隆B6CD8在TCR特异性和前体频率上的细微差异+捐献者,我们使用了P14 CD8+细胞。P14(A)Rag1−/−背景)幼稚的CD5罗氏、Ly6C,和Ly6C+(CD 183)或CD 183+)亚群共同转移到B6宿主(第1组,CD5)。罗氏+Ly6C;第2组,CD5罗氏+Ly6C+CD 183第3组,CD5罗氏+Ly6C+CD 183+在1:1的比例下,接着是LCMV感染,并在8dpi进行分析(见图)。5B、顶部)。尽管TCR特异性和输入细胞数相同,但P14 CD5罗氏细胞恢复的程度比他们的P14 CD5要小得多对应方(图1.5B,1/2/3组)。然而,并非所有CD5子集显示了这种增长(图)。5B,c,(第1、2和3组);与CD5比较罗氏Ly6C细胞+(均为CD 183)和CD 183+)细胞数量显著增加,而Ly6C细胞则显著增加。子集没有。

为了避免捐献者之间不必要的竞争,p14幼稚的cd5。罗氏、Ly6C,和Ly6C+将细胞分别转移到B6宿主,7dpi时进行LCMV感染和分析(见图)。5D、顶部)。再说一遍,Ly6C+细胞比CD5表现出更大的膨胀。罗氏细胞甚至Ly6C细胞,而Ly6C细胞没有(如图所示)。5D和补充图。5C)。Ly6C的扩大+细胞分裂增强与BrdU摄取增加有关,在6 dpi时,BrdU在体内作用2h后摄取增加(如图1所示)。5E),Ki-67表达增强(附图)。5D),并增加细胞微量紫(CTV)染料稀释(补充图。5E)。这些数据表明,尽管TCR和前体频率相同,Ly6C+子集不同于Ly6C与诱导抗原特异性扩增有关的子集,作为cd5的主要应答者。整体细胞。

Ly6C+Ⅰ型干扰素诱导的细胞在LCMV感染过程中抗原特异性扩增增强。

Ly6C反应增强+细胞相对于Ly6C细胞是有趣的,因为它们是相同的p14衍生的cd5。细胞。在GP33肽/MHC四聚体结合方面,两者均无明显差异(附图)。5F,g)。因此,Ly6C的更大扩展+细胞与Ly6C的比较细胞对于同源异物(和自身)肽在TCR亲和力上的差异可能不能完全解释。

另外,我们测试了iIFN的作用,这是因为Ly6C有很好的反应性。+该细胞因子的子集,并检测了Ⅰ型干扰素驱动的新诱导的Ly6C。+细胞在体内具有较好的扩张能力。Ly6C将p14细胞转移到B6宿主中,并在B6宿主中停留7天和21天,产生Ⅰ型IFN诱导的Ly6C细胞。+细胞(d7-和D21-在Ly6C)+分别;图1.5F、顶部)。供体来源的CD5罗氏、Ly6C,D7-和D21-在Ly6C中+细胞,作为对照,预先存在的Ly6C+新鲜分离的P14小鼠细胞(新鲜Ly6C)+)纯化,转移到B6宿主,感染LCMV,并在7 dpi时进行供体扩增分析(图1)。5F、顶部)。而CD5罗氏和Ly6C捐助者表现出类似的反应,如Ly6C+细胞表现出不同的反应取决于体内暴露时间(如图所示)。5F、底部)。因此,D21-inLy6C+供体细胞,但不是d7-inLy6C+与Ly6C相比,细胞的抗原特异性扩增明显增强。供体,可与宿主来源的已存在的新Ly6C相媲美。+细胞(图1.5F,表明Ly6C的响应较高。+子集与Ly6C的表达本身并不直接相关,而是反映了其在体内停留的时间。这些数据表明Ly6C的扩展能力增强了+细胞是在胸腺后以一种时间依赖的方式获得的,可能需要长时间暴露于强直性Ⅰ型干扰素信号中。

CD5罗氏、Ly6C,和Ly6C+细胞对LCMV感染有独特的分化命运。

根据不同的扩张反应,我们在lcmv特异性免疫反应高峰时,观察了效应细胞(如短命效应细胞(Slecs)与记忆前效应细胞(Mpecs)的命运)。21。P14幼稚CD5罗氏、Ly6C,和Ly6C+将亚群转移到B6宿主,然后感染LCMV,7 dpi分析供体分化情况(见图)。6A)。SLEC的百分比(CD 127)罗氏KLRG 1)是CD5中最低的罗氏Ly6C中间体细胞细胞,在Ly6C最高+细胞(图1.6B)。相反,MPECs的百分比(CD 127)KLRG 1罗氏)是CD5中最高的罗氏Ly6C中间体细胞细胞,Ly6C最低+细胞(图1.6B)。基于CD 27和CX3CR1的表达也观察到类似的结果。22(无花果)6C);CD 27的百分比CX3CR1(SLEC偏斜)和CD 27+CX3CR1罗氏(MPEC偏斜)在Ly6C中最高。+细胞和CD5罗氏细胞分别。B6CD8的实验也证实了这一现象。+作为捐献者,KLRG 1所占比例最高和最低Ly6C细胞+细胞和CD5罗氏细胞,分别在7 dpi(补充图)。6A).

图6:CD5罗氏、Ly6C,和Ly6C+细胞在LCMV感染过程中表现出明显的效应。
figure6

a实验方案bf). b占CD 127的百分比KLRG 1+和CD 127+KLRG 1P14 CD 44供体细胞(n=6只小鼠CD5罗氏, n=7只Ly6C小鼠和Ly6C+). c占CD 27的百分比+CX3CR1罗氏、CD 27+CX3CR1INT,以及CD 27CX3CR1P14 CD 44供体细胞(n=每组5只)。d, eSLEC的GSEA概况(d)和MPEC(e)P14CD5的标记基因罗氏和P14 Ly6C+供体细胞或P14 Ly6C和P14 Ly6C+供体细胞。fP14 CD 44的百分比和捐助者回收率120 dpi供体细胞(n=5只CD5小鼠罗氏, n=6只Ly6C小鼠和Ly6C+). g占CD 44的百分比CD62L和CD 44CD62L罗氏P14供体细胞在120 dpi(n=5只CD5小鼠罗氏和Ly6C, n=6只Ly6C小鼠+). h占P14 CD 44的百分比BrdU+35 dpi供体细胞(n=9只T小鼠、T厘米,和T埃姆, n=5只CD5小鼠罗氏, n=6只Ly6C小鼠和Ly6C+)。数据是至少两个独立实验的累积值(bi)。两尾未配对学生的统计显着性得到证实t-测试。结果为平均±SD。数据代表2-3个独立实验。源数据作为源数据文件提供。

为了获得更多支持这种不同命运的证据,rna-seq在p14供体子集(7 Dpi)上进行了测试,并与对slecs和mpecs进行分析的公共rna-seq数据集进行了比较。23,24继续进行GSEA(如图所示)。6d,e)。Ly6C+与CD5相比,细胞表现出更多的SLEC特征基因富集。罗氏和Ly6C细胞(图1.6d)。相反,CD5罗氏MPEG标记基因比Ly6C富集得多。和Ly6C+细胞(图1.6E)。这些数据强烈表明,尽管对同一同源抗原Ly6C表现出相同的P14 TCR反应+和CD5罗氏亚群经历了明显不同的分化程序,即SLECs与MPEC,分别。

为了进一步研究记忆细胞的产生,P14幼稚CD5罗氏、Ly6C,和Ly6C+将细胞转移到B6宿主,然后在120 dpi处进行LCMV感染和分析(见图)。6f、顶部)。符合增强的MPEC倾斜,CD5罗氏细胞数和百分率均高于Ly6C。和Ly6C+细胞(图1.6f),与7 dpi时观察到的峰值反应形成鲜明对比(图1)。5D)。此外,CD5罗氏和Ly6C+120 dpi供体细胞CD 44较高。CD62L中央存储器(T)厘米)和CD 44CD62L罗氏效应器存储器(T)埃姆)表型。6g)。CD5增强能力罗氏细胞分化为T细胞厘米上T埃姆与它们较高的自我更新能力有关,如p14 cd5的Brdu吸收量增加就证明了这一点。罗氏供体源性记忆细胞35 dpi与Ly6C的比较和Ly6C+对应方(图1.六小时和补充图。6B)。综合来看,这些数据表明个体幼稚CD8的分化命运。+T细胞本质上是预先决定的,不管它们的抗原特异性如何,而不是在免疫应答过程中随机选择。

补药Ⅰ型干扰素天生形成高SLEC但低MPEG偏斜的Ly6C+细胞

鉴于固有的不同命运,我们检查了其他内在性质,如凋亡,细胞因子的产生和代谢。为此,P14 CD5罗氏、Ly6C,和Ly6C+将细胞转移到B6宿主,7dpi后进行LCMV感染和分析(见图)。7A)。活性半胱氨酸天冬氨酸酶3,CD5的测定罗氏细胞死亡率低于Ly6C和Ly6C+细胞(图1.7b)。肽体外再刺激5h,CD5后细胞因子的产生罗氏细胞比Ly6C具有更高的IL-2生成能力。和Ly6C+细胞,虽然干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α的产生保持不变(图)。7C和补充图。7A)。颗粒酶B和CD107a的表达无显着性差异(附图)。7b)。测定耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR),CD5罗氏细胞的ECAR低于Ly6C,OCR高于Ly6C。和Ly6C+细胞,随着CD5中OCR:eCar比值的增加罗氏细胞(图1.7D)。与降低的糖酵解活性(ECAR)相一致,CD5罗氏细胞对mTOR信号通路的基因集富集评分明显低于Ly6C。和Ly6C+细胞(附图)7C)。因此,在CD5中观察到的上述特征罗氏与低分化MPECs相似的细胞25,26.

图7:补药Ⅰ型干扰素塑造Ly6C的固有能力+LCMV感染细胞可获得高SLEC而低MPEC。
figure7

a实验方案bd). bCaspase 3切割百分率+供体细胞(n=每组3只)。cIL-2(左)和IFN-γ(右)产生P14 CD 44供体细胞(每组6只)。dP14 CD 44的OCR和ECAR谱供体细胞(n=5只小鼠OCR(SRC)和最大OCR/最大ECAR,n=6只小鼠进行ECAR(GR)。e实验方案f, g)。F, g占P14 CD 44的百分比供体细胞(f)和CD 127的百分比KLRG 1+或CD 127+KLRG 1供体细胞(g)以前用控制抗体或IFNAR抗体在体内(n=每组6只)。两尾未配对学生的统计显着性得到证实t-测试。结果为平均±SD。数据代表2-3个独立实验。源数据作为源数据文件提供。

为了研究稳定状态下的补药Ⅰ型干扰素是否与不同命运的形成有关,我们在体内进行了抗IFNAR治疗的体内阻断实验。P14小鼠注射对照或抗IFNAR抗体,10天后,cd5。罗氏和Ly6C+细胞被分离并共同转移到b6宿主(以1:1的比例混合对照抗体和抗IFNAR处理的CD5)。罗氏或Ly6C+其次是LCMV感染,并在7 dpi进行分析(见图)。7E)。Ly6C+,但不是CD5罗氏抗IFNAR处理的细胞与对照组相比,抗原特异性扩增明显减少(图1)。7F)。同样,早期Ⅰ型IFN阻断10天后,SLEC减少,而Ly6C的mpeg偏斜增加。+细胞,而CD5的命运罗氏细胞保持不变(图)。7g)。CD 27和CX3CR1表达的分析结果相似(补充图)。7D)。与外周P14Ly6C形成鲜明对比+胸腺细胞Ly6C+细胞(相对于胸腺CD5)罗氏和Ly6C在LCMV感染时,效应细胞的扩张或分化命运无明显差异(附图)。7E)。综上所述,这些数据表明,在周围连续照射I型干扰素对形成幼稚细胞,特别是Ly6C细胞的独特分化特性有着深远的影响。+CD8+T细胞

讨论

内禀自我反应的作用在幼稚的T细胞中得到了很好的证明,这突出了cd5的免疫反应增强。细胞与CD5比较罗氏细胞6,7,8,9。虽然巧合的是,TCR对同源抗原的亲和力较高,或内在TCR信号能力较高,但可能是CD5反应增强的原因之一。细胞,其潜在机制尚不完全清楚。在本研究中,我们描述了朴素CD8的表型异质性。+T细胞根据其内在自我反应性的相对差异,将其分离成CD5。罗氏Ly6C、CD5Ly6C,和CD5Ly6C+子集。这些亚群在不同的体外和体内条件下表现出不同的反应。重要的是,不同的CD5与Ly6C不同的是,它们的功能适应度与第Ⅰ型干扰素依赖的方式有本质上的不同。+细胞比Ly6C更显着地表现出IFN-γ的产生、抗原特异性增殖和效应分化。细胞。因此,我们得出的结论是,自身的反应性在不同程度上印证了幼稚CD8的独特免疫特性。+辅助性I型干扰素信号转导T细胞。这个胸腺后规划过程对于激发CD8的多种免疫反应也是必要的。+T细胞池超出其TCR特异性。

外周幼稚CD8+T细胞一生中都与自我配体不断接触,这对它们的生存是必不可少的。27。此外,这种接触的相对强度在单个幼稚T细胞之间是可变的,并且与它们的抗原特异性扩展有关。7,8。自我反应性和免疫之间的这种关系提出了一个重要的问题,即自我TCR信号何时以及如何影响T细胞功能和随后的免疫反应。这种现象可能发生在胸腺或胸腺后,也可能依赖于某些生理线索,如细胞因子。在这方面,在本研究中观察到的Ⅰ型干扰素的生理作用是相当出乎意料的,因为这种促炎细胞因子是由于对病原体感染的先天免疫反应而产生的。28,29。我们的研究表明,即使在稳定状态下,幼稚的CD8+T细胞持续暴露于Ⅰ型干扰素中,这对Ly6C的产生至关重要。+CD5子集细胞。

考虑到CD5的高灵敏度细胞转化为Ⅰ型干扰素,它可能是通过一个涉及自tcr信号的过程来驱动的,例如调节膜微区(例如脂筏)。6以及内在信号通路9,这些细胞比CD5更容易受到影响。罗氏从而产生更复杂的表型,包括Ly6C、CD 183和CD 103的表达。在这些异构子集中,Ly6C+细胞是对I型干扰素最重要的应答者,因此表达最多的Ⅰ型干扰素调控基因转录子,尤其是与细胞分裂/增殖相关的基因。因此,来自补药Ⅰ型干扰素的信号显然是诱导CD5异质表型甚至转录的关键因素。细胞。至于Ⅰ型干扰素,类似的现象可能会发生在其他生理细胞因子上,例如白细胞介素-7和白细胞介素-15,因为它们对T细胞稳态是至关重要的。30,31。因此,未来的研究将需要解决这些额外的提示在塑造T细胞功能特性中的作用。

Ly6C的增强功能+细胞对LCMV感染的反应被进一步强调,从而导致抗原特异性的扩展和SLEC(而不是MPEC)的分化。这种现象与TCR的特异性无关,但依赖于Ⅰ型IFN。因此,出现了以下问题:Ly6C何时出现?+细胞获得这一特性,这些细胞需要多长时间暴露在I型干扰素中才能被完全编程?我们的数据表明,仅在外围的Ly6C中,增强的扩展和SLEC偏斜是显著的。+细胞而非胸腺Ly6C+或Ly6C+Ly6C新诱导的细胞细胞。因此,Ly6C独特的免疫应答+细胞本身不依赖Ly6C的表达,而依赖于对强直性I型IFN信号的强烈持续反应。因为这种对Ⅰ型干扰素的反应是一个自我驱动的过程,需要相对较强的自我反应能力,无论是Ly6C。+被剥夺自配体的细胞表现出抗原特异性扩张减少和SLEC分化将是一个有趣的探索。

Ly6C细胞固有功能增强(即IL-12/IL-18诱导的IFN-γ产生)与细胞分化+细胞与虚拟内存(Vm)细胞非常相似。32,33。VM细胞在表型和功能上有别于幼稚细胞和抗原经验丰富的记忆细胞,是由细胞因子(如IL-15和IL-4)以不依赖抗原的方式诱导的稳态增殖(HP)所致。10,34,35。最近的一项研究表明,vm细胞与抗原经验丰富的真记忆细胞不同,它表达转录因子Eomes的增强水平,并以一种依赖于Ⅰ型干扰素的方式产生。36。因此,我们推测Ly6C+细胞可以作为幼稚的前体转化为VM细胞。事实上,我们的研究结果很好地支持了这一假设,即Ly6C+单元格表示最高级别的埃梅斯基因和依赖于Ⅰ型干扰素的产生,先天功能,和SLEC分化,所有这些都是VM细胞的主要特征。10,20,36。然而,必须强调的是,尽管Ly6C+这些细胞表现出“VM样”的特征,根据检测的各种参数,包括CD 44和CD 122的表达降低,抗CD3/28(或细胞因子)驱动的增殖,以及PMA/ionomycin(或IL-12/IL-18)诱导的干扰素-γ的产生,这些细胞仍表现为表型和功能上的幼稚。

Ly6C的时间和方式+细胞转换成VM细胞仍有疑问。最近的一项研究表明CD8+T细胞在生命早期产生并在成人中持续存在,在其表型和功能方面表现出独特的特征。20。这项研究的一个关键发现表明,几乎所有这些新生儿来源的CD8。+T细胞转化为CD 44CD62LCD 122CD49d成年小鼠VM种群20。此外,这些新生的VM细胞在细菌感染后比成人来源的VM细胞表现出更高的抗原特异性效应扩展和SLEC的分化。这些不同的命运是否依赖于I型干扰素,并且仅限于Ly6C+新生儿源性CD8亚群+T细胞在本研究中未见报道。因此,我们在Ly6C上的结果是可能的。+成年小鼠的细胞(b6和p14)可能反映了新生的Ly6C的一小部分。+可以存活很长时间的细胞,尽管非常罕见,在成年小鼠的周围。因此,通过在Ly6C中进行一个实验来探索这种可能性将是很有趣的。+用成年B6(或P14)骨髓细胞重组B6小鼠,对B6小鼠骨髓细胞进行检测。

CD5增强能力罗氏细胞对于MPEC的分化和记忆细胞的形成是一个有趣的意外结果。CD5的这一独特性质罗氏即使在体内短期阻断强直性Ⅰ型干扰素信号,细胞仍保持不变,这与Ly6C形成了鲜明的对比。+细胞。虽然目前还不清楚这种稳定的Ⅰ型干扰素暴露是如何影响幼稚的CD8的命运的。+T细胞,CD5的反应性降低罗氏细胞对这种非经典的稳态细胞因子可能促进MPEC的命运简单地抵消SLEC的命运。在这方面,结合转录分析,检查生理Ⅰ型干扰素信号是否对每个幼稚的CD8的表观遗传谱产生不同的影响。+T细胞子集将是有趣的。这些额外的研究和我们的CD5数据罗氏细胞可以洞察为什么胸腺选择过程没有进化到只产生高度自我反应的cd5。细胞表现出更好的功能适应和能够诱导更好的免疫反应。在这里,我们提出了一个更广泛的理解,CD5罗氏还必须选择细胞作为一个有用的参与者,有助于平衡CD5的SLEC偏倚。细胞,导致MPECs增加,从而形成记忆细胞(特别是T细胞)。厘米)对病原体感染的反应。

一例TCR TG幼稚CD8+T细胞已被证明可分化为多种效应器(SLEC和MPEC)和存储器(T)。厘米、T埃姆,和T雷姆)子集37,38。这强烈地表明,这种不同的命运是由病原体感染期间在激活和扩展阶段发生的随机事件决定的。然而,在目前的研究中,我们的数据进一步扩展了这一流行的概念,强调单个幼稚T细胞分化为多个命运的潜力在所有幼稚的CD8中并不相同。+T细胞,但在不同的子集之间有明显的差异。每个子集的这种独特性质似乎是独立于单个T细胞的TCR多样性和特异性来调节的。重要的是,它被编程,至少在一定程度上,通过持续接触补药I型干扰素。因此,先前报道的单个幼稚CD8的多重分化潜能+T细胞可以反映单个T细胞克隆在稳定状态下被不同印记的独特特性的集合。

总之,幼稚的CD8+T细胞持续辅助性I型IFN信号,其敏感性取决于它们与自身抗原接触的相对强度,而TCR与自身抗原的接触又决定了它们独特的功能特性。这些影响的结果是扩大和增加了幼稚CD8的复杂性。+T细胞池的免疫反应超出了TCR的特异性和多样性。虽然补药Ⅰ型干扰素的重要性,特别是对Ly6C+细胞,主要是强调在本研究中,它仍然不排除其他可溶性因子的作用,在一个稳定的状态下可用。因此,未来的研究预计将进一步阐明个人幼稚CD8的功能多样性。+T细胞具有尚未确定的稳态信号。


武汉新启迪生物科技有限公司联系邮箱:
service@qidibio.com  techsupport@qidibio.com  
武汉新启迪生物科技有限公司咨询客服:周一至周五8:30-17:30
联系我们
服务保障                        支付方式
武汉新启迪生物科技有限公司联系电话:
027-87610298
027-87610297