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软脑膜转移瘤微环境中免疫治疗反应的基因组和转录相关性

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发表时间:2021-10-19 10:16作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

细脑膜病(LMD)是一种恶性实体肿瘤的严重并发症,预后极差,没有有效的全身治疗方案。在过去的十年中,LMD的发病率一直在稳步上升,这是因为治疗方法延长了癌症患者的存活率,突出表明需要新的干预措施。为了研究免疫检查点抑制剂(ICI)在LMD患者中的疗效,我们完成了两期临床试验。在这里,我们通过将单细胞RNA和无细胞dna分析应用于登记患者的纵向脑脊液(Csf),来研究这些试验中观察到的患者轨迹的细胞和分子特征。我们在脑脊液中恢复免疫和恶性细胞类型,描述ICI后细胞行为的变化,并确定与相关临床现象相关的基因组特征。总之,我们的研究描述了液体lmd肿瘤治疗前后的微环境,并演示了无细胞和单细胞基因组测量用于lmd研究的临床应用。

导言

LMD??肿瘤细胞浸润到软脑膜和脑脊液中,是实体性恶性肿瘤的一种特别严重的并发症,因为它通常是快速致死的,中位生存期约为4-6周。1。大约有5-8%的癌症患者患有lmd。1,2,3,具有常见的组织学特征,包括乳腺癌、肺癌和黑色素瘤。2,3。此外,在过去十年里,由于更好的耐受性和更有效的治疗策略提高了患者的生存率,LMD的发病率有所上升。因此,迫切需要对LMD进行有效的系统治疗,因为目前的措施(如颅脊髓放射和鞘内治疗)的益处不确定,副作用也很大。4.

免疫检查点抑制剂(Ici)已经彻底改变了肿瘤学领域,并在各种转移性、化疗难治性实体肿瘤中表现出了显著的疗效。5,6,7。最近,ICI已经成为中枢神经系统(CNS)转移的一种很有前途的选择。临床前资料显示T细胞浸润及程序性死亡配体1(pd-l1)在脑转移瘤组织中的表达。8,9表明ICI在中枢神经系统中是有效的。与此相关的是,转移性黑色素瘤和非小细胞肺癌实质脑转移的ici已显示出与全身疾病相似的客观颅内反应。10,11。然而,据我们所知,ICI作为治疗LMD的方法还没有在前瞻性临床试验中得到评估。

为了解决这一未满足的需求,我们在任何组织学的LMD患者中启动了两期ICI临床试验(NCT 02886585,NCT 02939300;见方法)。一项试验(NCT 02886585)评价了一种针对程序性细胞死亡蛋白1(PD-1,药物名pbrolizumab)的抗体的疗效,另一项试验(NCT 02939300)评价了针对PD-1(药物名Nivolumab)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4,药物名称ipilimumab)的疗效。这两种治疗方法都是静脉注射(IV),在临床指示的每一剂量之前抽取血液和脑脊液(见方法),并进行基因组分析。值得注意的是,这两项试验均达到了一级终点(分别有60%和44%的患者在注册后3个月内存活,分别为ipilimumab和ipilimumab/nivolumab试验),并且与历史对照组相比,总体中位生存期(分别为3.6个月和2.9个月)有所改善(分别为ipilimumab和ipilimumab/nivolumab试验)。12,13。尽管NCT 02886585和NCT 02939300显示出了希望,但ICI治疗LMD的效用和长期疗效仍然存在问题。例如,目前尚不清楚在这些患者中观察到的临床效益是否完全是ICI给药的系统效应的结果,或者这些效应是否延伸到中枢神经系统(CNS)。此外,作为病人反应基础的细胞和分子特征还有待阐明。

在此,我们将单细胞RNA测序(scRNA-Seq)和无细胞DNA测序(cfDNA-seq)与常规临床检测相结合,应用于连续的脑脊液和外周血白细胞(PBL)样本,用于这两个ICI试验:(1)描述LMD肿瘤微环境(TME)的细胞组成;(2)评估CSF内的炎症免疫反应;(3)确定潜在因素,为观察到的个别患者的临床过程提供依据。

结果

LMD TME的scRNA-Seq

我们做了纵向高通量的scRNA-Seq(如图所示)。1A治疗前13例,治疗后低输入脑脊液24例,共19例纳入NCT 02886585和NCT 02939300,多时间点采集9例。在过滤低质量的细胞后,我们从现有的临床试验样本中保留了34,742个单细胞(补充图)。1),我们利用主成分分析(PCA)的降维方法对其进行了进一步的分类和可视化。14以及一致流形逼近和投影(UMAP;方法)14,15。我们的分析揭示了17个不同的聚类,我们通过差异基因表达(补充数据)进行了鉴定。2)作为适应性免疫细胞(包括T细胞、免疫球蛋白表达B细胞)、天然免疫细胞(包括树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞)和非免疫细胞(如图所示)。1B,c)。非免疫细胞簇(n=11)表现出较强的患者特异性代表,而免疫集群(n=5)按表型而非病人分组(附图)。2),与以前通过scrna-seq对人类肿瘤的观测结果一致。16,17.

图1:ICI治疗前后纵向取样脑脊液标本中的scRNA/cfDNA管道的研制。
figure1

a本研究中对患者进行纵向取样的示意图。b在每项研究中对患者进行纵向抽样,包括试验的主要终点(虚线),以及已知的病人死亡日期。cUMAP的单细胞转录从所有捕获的CSF细胞在这两个试验,颜色由病人,与细胞类型的来源。

通过非监督聚类对非免疫簇进行初步识别后,通过推断每个细胞的拷贝数变异(Cnv)曲线,并与基于dna的分析结果相匹配,确定了nct 02886585样本的恶性状态。17,18,19。从脑脊液中提取无细胞DNA(CfDNA),通过全外显子测序(WES)获得CNV图谱。利用这些数据,我们证实了患者特异性的非免疫簇共享他们的时间点匹配的cfdna对应物(方法,补充图)推断的cnv谱(如前所述)。3B)。Seq-well捕获的肿瘤细胞的比例,以获得可用的时间点(见补充数据)1对于所有可用的细胞学报告)都有显著的相关性(kendall‘sт相关性=0.62,p皮尔森相关系数=0.89,p=1.8×10−5用脑脊液中的细胞旋蛋白检测肿瘤细胞比例(补充图)。3C)。此外,我们还从试验NCT 02886585的患者P 010、P 043、P 046和P 073获得了来自810个细胞的PBL衍生scRNA数据(补充图)。4).

静脉注射ICI后脑脊液中CD8+T细胞的变化

我们发现,在免疫检查点抑制剂处理的样本中,CD8+T细胞(NCT 02886585)和增殖性T细胞(两个试验)相对于未治疗的样本更为丰富。我们首先对T/NK集群进行了非监督分析(见图)。2A,b),并根据基因表达相似性对scrna-seq数据进行高水平分析时,计算了CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞(可与T细胞共分离)的比例。20)在我们的数据集中的每个样本中(补充数据)3-4)。NCT 02886585治疗后脑脊液中CD8+T细胞比例明显高于治疗前可评价标本(Cohen‘s)。d=0.87,双边Wilcoxon秩和p=0.03,N=24例,治疗前11例,NCT 02886585后13例,见方法,而NCT 02939300治疗后脑脊液中CD8+T细胞比例与治疗前比较无显着性差异(图二)。2C)。对T细胞的非监督分析还发现,与增殖相关的基因表达增加,其中包括MKI 67, BIRC 5,和TOP2A,除其他外16,18,21。在接受全身治疗的患者的外周血中,ICI给药后增殖增加。19,22,23,24。我们计算每个样本的CD8+T细胞增殖率。与可评价样本相比,ICIS处理的样本中CD8+T细胞的增殖率明显高于未处理的样本(Cohen‘sd=0.62,0.60;双边Wilcoxon秩和p=0.02,N=21,19,9预处理,12后NCT 02886585,10后NCT 02939300;二维空间,见方法。在补充图中对患者纵向匹配样本的伴随分析。5)。这些数据表明,治疗后脑脊液中T细胞的丰度和增殖率增加。

图2:脑脊液中的t细胞在ICI后干扰素诱导、细胞毒性和耗竭基因的表达上表现出很强的差异。
figure2

a, bUMAP计算了所有T/NK细胞(n=16,954),由队列(a)和规范单元格类型(b)通过迭代子聚类(见方法)识别。cCD8+T细胞在治疗前、治疗后第1组和治疗后第2组中的百分比;仅考虑超过20个T细胞的样本。dCD8+T细胞循环在治疗前、治疗后第1组和治疗后第2组中的比例;仅考虑10例CD8+T细胞以上的样本。e治疗前、治疗后早期(治疗后<30天)和治疗后晚期(治疗后30天≥)CD8+T细胞的效应基因表达N=6133个CD8+T细胞。f治疗前、治疗后早期(治疗后<30天)和治疗后晚期(治疗后30d)CD8+T细胞均有干扰素-γ反应.g肿瘤细胞与CD8+T细胞IFN-γ反应中位数。在c-d数据中,中线为中间线,下铰链和上铰链对应于第一和第三四分位数,上晶须从铰链延伸到最大值不超过1.5×IQR(其中IQR为中间四分位数范围),下晶须从铰链延伸到铰链的最小值,最多为1.5×IQR。在……里面cf,指示p-值是双面的,由Wilcoxon秩和检验计算,在图g中,p-肯德尔-头关联的值是双面的(见方法).

ICI处理的CD8+T细胞相对于未处理的细胞,表现出较高水平的效应功能和干扰素-γ信号相关基因水平,这些基因表达水平较高,更具有幼稚性。主成分分析表明,前两个主成分分别是治疗后早期(治疗后<30天)和治疗前样品(补充图)。6)。这些主成分的负载是由与干扰素-γ信号相关的基因以及CD8+T细胞的效应/幼稚表型驱动的。25,26,27。事实上,我们检测到与效应样功能和干扰素-γ信号相关的基因显著增加(如图所示)。2E,f补充数据中的基因列表5CD8+T细胞中CD8+T细胞与NCT 02886585(Cohen‘s)的治疗前比较(<30天)d=0.91和0.65,p < 0.001 for both IFN-γ and effector/naïve signatures respectively) and NCT02939300 (Cohen’s d=0.75和1.07,p < 0.001 for both IFN-γ and effector/naïve signatures, N=6133个CD8+T细胞)。此外,我们还发现,T细胞中IFN-γ信号的平均水平与肿瘤细胞的平均IFN-γ反应密切相关(肯德尔的τ相关系数=0.6 7,P<0.0 1,P<0.0 1)。p=0.003,图1。2G),表明同一脑脊液样本中不同细胞类型的炎症反应是一致的。

纵向scrna-seq显示ici给药后的瞬时γ反应和抗原呈递特征。

干扰素-γ反应(图.3A-c)和抗原表达(补充图。7A-c)ICI给药后即刻出现短暂的上调,在多个细胞类型的患者中都能观察到。我们发现两种签名的模块评分暂时升高,最大出现在早期时间点(给药后<30天);p淋巴区、固有区和肿瘤区IFN-γ反应分别为0.00405、0.00262、0.0774;p淋巴区、先天区和肿瘤区的抗原表达分别为0.00406、0.00871、0.0938;双侧Wilcoxon秩和检验,并在以后的时间点(首次给药后30天≥)显著减少;p淋巴区、固有区和肿瘤区IFN-γ反应分别为0.03212、0.16491、0.08648;p淋巴区、先天区和肿瘤区的抗原表达分别为0.022271、0.049141、0.032125;N=12预处理,N=治疗后7 0至30天,N=6 36+天后治疗淋巴组织,N=12预处理,N=治疗后8至30天,N=7 36+天后治疗先天,N=11预处理和N=治疗后7 0至30天,N=6 36+天后治疗肿瘤,见方法)。综上所述,这些结果表明,无论是脑脊液内对静脉注射ici的急性炎症反应,还是ici激活的免疫细胞对此室的浸润,这都有可能解释静脉注射ici对nCT 02886585和nct 02939300抗lmd的临床疗效。12,13,28.

图3:静脉注射ICI后脑脊液中的急性免疫反应及其与生存的关系。
figure3

ac淋巴细胞在不同时间点样本中干扰素-γ反应的平均模块评分(a)、髓系(b)、肿瘤细胞(c)。一个病人的样本与虚线相连。标记的大小与样本中相关细胞的数量成正比,只考虑对应类型超过5个细胞的样本。与ICI给药相比,0天点为治疗前。d肿瘤细胞干扰素-γ反应的小提琴图(试验时间),用于首次给药后<30天的样本。中音和上下四分位数在每个小提琴情节中用虚线表示。

给药后不久(<30天)恶性细胞内的干扰素-γ反应和抗原表达与试验时间有关。

为了观察先前描述的ICI反应是否对这个患者群体有预后价值,我们比较了干扰素-γ反应和抗原在细胞类型中的表现,并与试验时间进行了比较。共采集了6个样本,这些样本来自于我们知道死亡日期的初始ICI剂量<30天的个体。我们观察到,在恶性细胞中,超过初级终点的存活与干扰素-γ反应的平均模块评分有关。p=0.0526,单边Wilcoxon秩和检验29无花果。三维空间)。这种关系不适用于非恶性细胞(补充图)。8).

炎性信号在脑脊液中比在血液中更明显。

在治疗后的时间点匹配样本中,我们观察到脑脊液中的炎症特征(抗原提呈和干扰素-γ反应)明显高于外周血淋巴细胞和髓系细胞(p-补充数据中的数值6)同时使用下采样程序(方法)来调整细胞质量的差异。此外,我们观察到治疗后即刻P 043细胞的抗原提呈和干扰素-γ反应明显增加,而PBL来源的先天免疫细胞和淋巴免疫细胞则未见此变化。p-补充数据中提供的数值6)。此外,我们观察到m1样表型显著增加。30,31脑脊液衍生髓系细胞在P 043中随时间的变化(p-补充数据中的数值6),我们观察到患者PBL衍生髓系细胞中相同的信号减少(p-补充数据中的数值6)。这表明,LMD患者的ICI后炎症在中枢神经系统中可能特别升高,体内不同的部位可能表达不同水平或阶段的整体免疫反应,值得在多个地点和时间点进行进一步研究,以充分描述患者对治疗的总体反应。补充数据中提供了PBL和CSF来源的淋巴组织和髓系细胞之间的差异表达排名(方法)。7.

免疫原性较低的亚克隆的自适应选择与一例患者的瞬时反应相一致。

我们研究了特定患者P 043治疗反应背后的细胞行为,他们在治疗过程中表现出独特的临床、表型,并推断出CNV的动态变化。三周后,初步给药,P 043显示肿瘤负担下降,根据细胞学和塞克井(图)。4A)。在最初的ICI给药后6周,从那时起,据报道的肿瘤细胞比例逐渐增加,直到病人结束研究,Seq井和细胞学都显示肿瘤负担增加(见图)。4A)。在治疗后6周,伴随着LMD相关增强的患者脑部MRI的间隔增加。12周时,根据细胞学检查,恶性细胞学分数高于治疗前水平,MRI扫描显示12周时LMD进一步进展,再次表明LMD进展(图1)。4A,b).

图4:P 043的纵向scRNA和cfDNA表明,相对于较高免疫原性的亚克隆,应选择较低的免疫原性。
figure4

a用Seq-well和细胞学的方法测定脑脊液中肿瘤的比例,用cfdna上的绝对运行推断肿瘤的纯度。bMRI图像在0,6和12周相对于治疗;LMD-指示性增强显示为红色箭头。c无监督聚类推断的拷贝数剖面(左,见方法)和表达(右)揭示细胞间的异质性,可能可以解释存在亚克隆。d亚克隆的相对比例随时间的变化。深紫色和浅紫色分别表示后代和上升子克隆。e干扰素-γ在亚克隆中的表达(*)p=0.001,**p=0.01,Wilcoxon排序-sum检验,Cohen‘sd=1.4,N=52为后裔,19为上升,P 043-3;Cohen‘sd=1.4,N=14为后裔,31为上升,P 043-4)。深紫色和浅紫色分别表示后代和上升子克隆。

来自P 043的肿瘤细胞的无监督分析显示基因表达和推断拷贝数(rWME,见方法)的异质性,提示适应性选择导致获得性ICI耐药(见图)。4C)。对于所有患者,我们评估了亚克隆性肿瘤异质性的可能性。32,33,34,35,36通过推断单细胞CNV谱16,17,37通过窗口平均表达式(WME,见方法)空间中的聚类。在15例可评价的患者中,我们发现14例患者的CNV异质性很小(补充图8)。例如,在P 029中,我们观察到基因表达空间的聚类(主要归因于循环状态),但在推断的CNV空间中没有;在其他患者(P 014,P 050,P 061)中,推测的CNV变异有限,仅限于少数几个位点,或仅在一个时间点取样。在P 043中,我们检测到两个不同的拷贝数剖面簇的存在,这表明肿瘤亚克隆的存在(如图所示)。4C、方法)。此外,这两个亚克隆的部分丰度随着时间的推移而移动,其中一个克隆低丰度的预处理和单调增加的代价另一个(图)。4D)。因此,我们假设,在P 043中,由于ICI的作用,一个少数亚克隆被适应性地选择了。

我们注意到,推测的cnv在簇间的高度差异区域对应于焦点基因组扩增,区分治疗前后cfDNA衍生的拷贝数剖面(补充图)。9)。值得注意的是,CNV相关簇与基因表达源簇高度一致,表明P 043肿瘤细胞的遗传和表型异质性是一致的。4C).

我们在P 043测量的三个时间点绘制了每个簇的干扰素-γ反应评分图(见图)。4E)。这些数据表明,在p 043-3处,后代克隆呈现出较高的IFN-γ应答基因。p < 2 × 10−3对于治疗后的时间点,双侧Wilcoxon秩和检验)--治疗后的时间点(如图所示)。4E)。与此形成对照的是,在此过程中,方兴未艾的克隆始终表现出较低的干扰素-γ反应,最终在最后一个时间点起主导作用(P 043-4)。亚克隆间抗原表达的差异(p=0.01,P 043-3,p=0.0015,P 043-4;N=52为后裔,19为上升,P 043-3;N在P 043-4中,后裔为14,上升为31),详见附图。第11d.

为了支持亚克隆假说,而不依赖于推断的CNV谱或其非监督聚类,我们在每个时间点对单个细胞表达谱进行了监督比较,并与早期和晚期cfDNA衍生的wes拷贝率进行了比较(补充图)。11C)。结果表明,P 043-4细胞的基因表达谱与从P 043-4获得的cfDNA的拷贝数谱更加一致,而P 043-2细胞的基因表达谱与P 043-2获得的cfDNA拷贝数谱更为一致。在治疗后的时间点,基因表达谱与后期cfDNA(P 043-4)拷贝数谱相关的细胞倾向于低表达干扰素-γ反应相关基因,而与早期cfDNA拷贝数谱(P 043-2)相关的基因表达谱相关的细胞(P 043-2)的IFN-γ反应相关基因表达水平较高(P043-3和−8.79-IFN-γ反应/相关差异分别为−15.9IFN-γ应答/相关差异)。

CfDNA衍生CNV时间点P 043-2(为后代亚克隆富集)和P 043-4(为优势亚克隆富集)之间存在较大的cfDNA-源CNV差异,这是亚克隆间免疫原性差异观察到的假设驱动因素。补充数据8其中在P 043-2和P 043-4处,cfDNA的拷贝率变化最大(分别最小)的最高基因,以及这些基因在上、后代亚克隆中的平均表达量;RAD 21,例如,据报道,它可以预测不良的预后。38,39,在P 043~4处,在cfDNA中复制约5倍,在控制时间点(即P 043-3)时,在优势亚克隆中的高表达量约为3倍。

讨论

在这里,我们使用低输入的剖面技术来对人LMD TME的液体组分中的细胞类型进行scRNA-Seq表征。我们对肿瘤细胞、淋巴样细胞和髓样细胞的存在进行分类,并结合两项ICI疗效的临床试验,检查其丰度和表型的变化。这些高分辨率的数据使人们能够进一步研究LMD和治疗相关的现象,这些现象是CSF在患者内部和患者之间所特有的。

我们计算了与NCT 02886585治疗前相比,ICI治疗后脑脊液中CD8+T细胞丰度和生长的显著增加。此外,我们检测到更高水平的干扰素-γ信号和细胞毒性CD8+T细胞治疗后,在这两个试验。这些结果提示在这些临床试验中,静脉注射ICI可以调节一部分患者脑脊液中的免疫微环境,这可能与观察到的临床益处有关。

我们发现有提示性证据表明,恶性细胞间初始炎症反应的大小可能具有预后价值,值得进一步研究。研究干扰素-γ反应和抗原处理特征的患者在这些试验显示,明显增加后,在第一次ICI剂量后,随着时间的推移,稳步下降的病人。而这一观察结果与外周血中抗pd-1治疗的报道是一致的。40,41同时也说明了LMD在ICI疗效上的潜在局限性。此外,这些结果强调了采样时间的重要性,以及纵向剖面的价值,在scRNA-seq对治疗反应的研究中,因为这些反应容易表现出短暂的转录效应;可能需要更多的时间分辨取样来正确地描述这里呈现的动态表型过程。

最后,在一个特定的病人中,我们注意到有证据表明存在亚克隆,这些亚克隆可能是该个体对ICI的瞬时反应的基础。我们利用这一证据提出了增强或降低免疫原性的假设驱动因素。42.

这些结果共同支持Brestianos等人的研究结果。12布拉西亚诺斯等人,13-即ICI对LMD患者的临床疗效。此外,我们观察到在治疗后TME的炎症特征有很强的室间和时间上的变化,这对LMD和其他癌症类型的未来研究设计有重要的意义。

由于临床脑脊液样本输入量有限,无法在所有时间点获得所有患者的纵向数据。此外,包括原始组织学和组织学亚型在内的队列多样性的多样性建议后续研究控制这些因素,以确认上述反应的生物标志物是否具有临床应用价值。未来更大的队列规模和更频繁的纵向和多点取样将使LMD的ICI反应中的基因型因素具有特征性,支持对多种药物治疗效果的比较,并进一步测试和完善这项工作中提出的预后生物标记物。


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