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Fbxl 2对抗Grp 94破坏EGFR的稳定性,抑制EGFR驱动的NSCLC生长

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发表时间:2021-10-19 10:39作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

表皮生长因子受体(EGFR)的异常激活促进了非小细胞肺癌(NSCLC)的发展。EGFR突变介导的对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的耐药性是NSCLC治疗的主要障碍。在此,我们发现F盒蛋白Fbxl 2靶向EGFR和EGFR TKI抗性突变体进行蛋白酶体介导的降解,从而抑制EGFR驱动的非小细胞肺癌的生长。非小细胞肺癌患者Fbxl 2表达降低与临床预后不良有关。此外,我们还发现葡萄糖调节蛋白94(Grp 94)通过阻断与EGFR结合的Fbxl 2来保护EGFR不被降解。此外,我们还发现了Nbivolol,一种临床使用的小分子抑制剂,它可以上调Fbxl 2的表达,从而抑制EGFR驱动的NSCLC的生长。Nebivolol联合Osimertinib或Grp 94抑制剂-1对Osimertinib耐药的NSCLC有较强的抑制作用。同时,本研究表明Fbxl2-Grp94-EGFR轴在非小细胞肺癌的发生发展中起着关键作用,并提示靶向Fbxl2-Grp 94来破坏EGFR的稳定性可能是TKI耐药NSCLC的一种可能的治疗策略。

导言

表皮生长因子受体(EGFR)在包括肺癌、头颈部、结肠癌和脑癌在内的各种癌症中被过度表达或异常激活。1,2,3。EGFR蛋白稳定性失调是导致EGFR信号异常和肿瘤发展的关键因素。4,5,6。因此,阐明EGFR蛋白稳定性的分子机制是至关重要的。结果表明,EGF对EGFR的稳定性有很强的调节作用。E3泛素连接酶c-cbl可诱导EGFR单泛素化、内吞和溶酶体介导的降解,导致表皮生长因子(EGF)刺激后EGFR信号的减弱。7,8。尽管蛋白酶体途径也参与了EGFR的降解9,蛋白酶体依赖性EGFR降解的确切机制尚不清楚.

激活EGFR信号,包括EGFR基因扩增和激活突变,如l858r和外显子19缺失,是非小细胞肺癌(NSCLC)的主要推动力,约占所有肺癌病例的85%。10,11。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Tkis)的靶向治疗,如erlotinib或geifinib,已被广泛用于治疗EGFR激活突变,大大改善了患者的预后。12。然而,绝大多数非小细胞肺癌患者对EGFR-TKIs产生了耐药性,其中EGFR。T790M突变约占所有第一代耐药病例的50%。13。Osimertinib(AZD 9291)是用来克服EGFR的。T790M-介导的TKI抗性。然而,新获得的EGFR对osimertinib的耐药突变也不断出现,包括EGFR。C797S和EGFRL718Q14,15。因此,迫切需要新的策略来对抗耐TKI的非小细胞肺癌.

葡萄糖调节蛋白94(Grp 94)是参与蛋白质稳态的热休克蛋白90(Hsp 90)家族的内质网(ER)成员。16。Grp 94作为伴侣直接折叠和/或组装几种分泌和膜蛋白,包括免疫球蛋白(Ig)家族、胆盐依赖性脂肪酶(Bsdl)、Toll样受体和整合素。17。Grp 94在肺癌、黑色素瘤、卵巢癌和多发性骨髓瘤等多种癌症的生长和转移中发挥着重要作用。18,19。临床上,Grp 94在晚期癌症中表达过高,生存率差。20,21。然而,Grp 94在EGFR蛋白稳态中的作用目前尚不清楚。

E3泛素连接酶Fbxl 2是决定SCF泛素连接酶复合物特异性的保守F-box家族蛋白的成员。22。Fbxl 2拥有一个独特的CAAX基序,在C-端,它是进行杀菌和膜靶向所必需的。23。Fbxl 2可促进细胞周期蛋白D2、cyclinD3、Aurora B、IP3R3或P85β的降解,从而抑制细胞增殖或抑制凋亡/自噬。24,25,26,27,28。Fbxl 2还可以针对TRAF蛋白进行降解,调节炎症反应。26。在本研究中,我们证明Fbxl 2是一种E3泛素连接酶,针对EGFR和EGFR TKI抗性突变体,通过蛋白酶体介导的降解来抑制EGFR驱动的NSCLC生长。值得注意的是,Fbxl 2可以与Grp 94竞争EGFR结合。本研究以nebivolol为例,结合Grp 94抑制剂对Osimertinib耐药非小细胞肺癌(NSCLC)表现出较强的抑制作用。

结果

Fbxl 2以不依赖EGF的方式与多聚泛素和蛋白酶体介导的EGFR结合并促进其降解。

EGFR蛋白在EGF刺激下可通过c-cbl介导的溶酶体途径迅速失稳。7,8。由于EGFR蛋白水平在肿瘤发生中至关重要,我们认为EGFR蛋白的稳定性应该在多个水平上受到严格控制。因此,我们研究了蛋白酶体介导的EGFR蛋白降解对EGF诱导或不诱导的影响.如附图所示。1A,EGF诱导的EGFR降解被蛋白酶体抑制剂(MG 132)或溶酶体抑制剂(氯喹,clq)在nSCLC H 1299(野生型EGFR)或h 1975(EGFR)中阻断。L858R/T790M)细胞。相反,在没有EGF诱导的情况下,EGFR蛋白的降解主要是通过蛋白酶体途径进行的,说明蛋白酶体介导的降解在调节EGFR蛋白稳定性中起着至关重要的作用。因此,我们的目的是利用一个针对E3泛素连接酶的慢病毒shRNA文库,筛选针对EGFR的E3泛素连接酶。

在筛选出的22个F-box蛋白家族候选基因中,Fbxl 2基因明显沉默,野生型EGFR、EGFR 19 del或EGFR的蛋白表达上调。L858R/T790M在H 1299,PC-9或H 1975细胞,分别(补充图.)1B,c还有无花果。1A)。TRAF 3,已知的Fbxl 2底物26,进行并行分析。相反,Fbxl 2的异位表达导致EGFR蛋白表达下调(附图)。1D)。相比之下,包括Fbxl 2在内的E3泛素连接酶活性中Fbxl 2突变体的表达有缺陷。ΔF(删除F-box结构域)或Fbxl 24A(F盒结构域的四点突变)27,没有这样做(附图)。3E和补充图。4B)。提示Fbxl 2可抑制EGFR的表达,EGFR的表达依赖于其E3泛素连接酶的活性。

图1:Fbxl 2以不依赖EGF的方式作用于多聚泛素和蛋白酶体介导的降解。

a对稳定表达不同shRNAs的H 1299、PC-9或H 1975细胞进行Westernblot分析,结果表明,H 1299、PC-9和H 1975细胞对Fbxl 2(shFBXL2-#1或shFBXL2-#2)或GFP(ShCtrl)均有不同表达。bPC-9细胞在无血清培养基中稳定表达HA-Fbxl 2,培养12h,加入或不加100 ng/mL EGF作用10 min。细胞裂解物进行westernblot分析。c, dH1975细胞在无血清(10%)或血清存在下稳定表达Ha-Fbxl 2,在50μg/mL环己酰亚胺(CHX)作用下培养12h。细胞裂解物进行westernblot分析。进行了三个独立的实验。量化EGFR蛋白水平,并以均值±SD表示蛋白质半衰期图。e将稳定表达HA-Fbxl 2的H 292或H 1975细胞用MG 132处理6h后,进行Westernblot分析。f将Fbxl 2与EGFR表达质粒共转染HEK 293 T细胞。隔夜培养细胞,用20 MMG 132处理4h,免疫沉淀(IP)-Western分析。g将稳定表达FLAG-EGFR的H 1299细胞用MG 132处理4h,收获后进行IP-Western分析。h用MG 132处理H 1975细胞4h,用特异性抗体Fbxl 2或正常兔IgG免疫沉淀内源性Fbxl 2蛋白,然后免疫印迹。i将稳定表达HA-Fbxl 2的H 1299细胞用MG 132处理4h,收获后进行IP-Western分析。j用指示表达质粒转染HEK 293 T细胞。隔夜培养细胞,用MG 132处理4h,然后进行IP-Western分析.kHEK 293 T细胞共转染Fd-EGFR、Fbxl 2和HA-泛素野生型(Lys 48)或只表达Lys 63的质粒。隔夜培养细胞,用MG 132处理4h,然后进行IP-Western分析.l体外泛素化反应混合物采用免疫印迹法,免疫印迹法检测血清和HA抗体。实验被独立地重复了三次,得到了相似的结果。a, b, el)。源数据作为源数据文件提供。

然后我们研究了表皮生长因子(EGF)在Fbxl 2介导的EGFR降解中是否需要刺激。如图所示。1BFbxl 2在PC-9细胞中,在EGF存在或不存在的情况下,均能有效降解EGFR。在H 1299和H 1975细胞中也观察到类似的作用(附图)。1E)。此外,fbxl 2显著缩短了EGFR的半衰期。L858R/T790M蛋白质,不管是否有血清(如图所示)。1C,d)。因此,Fbxl 2介导的EGFR蛋白降解与EGF刺激无关。

接下来我们研究Fbxl 2是否是EGFR的真正E3泛素连接酶。如图所示。1E和补充图1F,g,Fbxl 2介导的EGFR蛋白水平的降低被蛋白酶体抑制剂MG 132有效地逆转,而不被溶酶体抑制剂氯喹所逆转。此外,fbxl 2与野生型EGFR、EGFR相互作用。L 858R,或EGFRT790M蛋白质和Fbxl 2与EGFR、Skp 1和Cullin 1形成稳定的复合物(图1)。1F−I),建议SCFFbxl 2复合物是EGFR蛋白降解的主要原因。此外,Fbxl 2的沉默导致EGFR蛋白的多聚泛素链减少,而Fbxl 2的异位表达促进了Lys 48-连锁,而不是Lys 63连接的EGFR蛋白多聚泛素链(图1)。1J,k)。免疫修饰Fbxl 2,而不免疫Fbxl 2ΔF,促进EGFR的体外泛素化。1L)。因此,Fbxl 2结合并促进EGFR的多聚泛素,导致蛋白酶体介导的EGFR降解。

Fbxl 2在膜上靶向,并与EGFR激酶结构域结合,促进EGFR蛋白降解。

接下来,我们将Fbxl 2结合域映射到EGFR上。如图所示。2A,b,Fbxl 2(AA 269-401)的9−13亮氨酸丰富重复序列(LRR)与EGFR结合.此外,EGFR的激酶结构域(AA 688-957)是必需的,足以与Fbxl 2相互作用。2C,d)。重要的是,纯化的Fbxl2-Skp 1蛋白复合物能够在体外直接结合EGFR的激酶结构域,生物层干涉法证明了这一点。2E和补充图。2A).

图2:Fbxl 2与EGFR的激酶结构域相互作用,其膜靶向功能对EGFR蛋白的失稳至关重要。

a本研究中使用的Fbxl 2缺失突变体的示意图表示。bHEK 293 T细胞共转染Flat-EGFR和HA-Fbxl 2表达质粒。培养一夜后,用MG 132处理细胞4h,收获后进行IP-Western分析。c本研究构建了EGFR缺失突变体的示意图表达。dHEK 293 T细胞共转染Fbxl 2和指示的表达Fbxl 2的Fbxl 2质粒。培养一夜后,用MG 132处理细胞4h,收获后进行IP-Western分析。e用生物层干涉法(BLI)检测重组Fbxl 2/Skp 1蛋白与EGFR激酶部分的结合亲和力。这个KD所显示的值。f用HA-Fbxl 2共转染HEK293T细胞,并检测其表达质粒。隔夜培养细胞,用MG 132处理4h,然后进行IP-Western分析.g, hHEK293T细胞共转染野生型标志-EGFR或标志-EGFRE931A在HA-Fbxl 2或载体对照的作用下36h,用50g/mL的环己酮(CHX)处理细胞,每隔一段时间。细胞裂解物进行westernblot分析。对EGFR蛋白水平进行量化,并给出一份代表蛋白质半衰期的图表.i稳定表达HA-Fbxl 2或Ha-Fbxl 2的H 292或H 1975细胞C420S进行Westernblot分析。j稳定表达HA-Fbxl 2,HA-Fbxl 2的H 1299或H 1975细胞C420S在收获前用MG 132处理4h,进行IP-Western分析。k稳定表达HA-Fbxl 2或Ha-Fbxl 2的H 1299或H 1975细胞C420S采用细胞质(Cyto)和质膜(PM)分馏,Westernblot分析。l稳定表达Fg-Fbxl 2或Fbxl2的H 1299细胞C420SMG 132在免疫组化染色前用MG 132处理6h,免疫组化染色标记红旗(Red)和内源性EGFR(Green),DAPI染色。标度棒=25m,实验分别重复三次,结果相似。b, d, f, g,和il)。源数据作为源数据文件提供。

然后我们解剖了EGFR激酶结构域中潜在的Fbxl 2结合位点。我们采用ZDOCK 3.0.2(Https://zdock.umassmed.edu/),一种常用的蛋白质−相互作用预测工具。如附图所示。2BEGFR激酶结构域上存在7个潜在的氨基酸残基(Ser720、Lys 806、Asp807、Lys 875、Ser921、Glu922和Glu931),它们可能通过氢键与Fbxl 2相互作用。然后我们检测了EGFR突变蛋白在这七个残基上的Fbxl 2结合能力。有趣的是,除了EGFRE931A这不能结合Fbxl 2,其他与Fbxl 2结合的突变蛋白类似于野生型EGFR(补充图)。2C)。值得注意的是,据报道EGFRE931G在体外对包括erlotinib在内的EGFR-TKI耐药29。经检测,EGFRE931G也无法绑定Fbxl 2(图2)。2F)。事实上,fbxl 2与野生型egr形成鲜明对比,对egr的表达和稳定性几乎没有影响。E931A或EGFRE931G蛋白质(附图)二维空间还有无花果。2G,h)。这些结果表明,EGFR激酶结构域的Glu931与Fbxl 2的相互作用是不可缺少的。

据记载,Fbxl 2可以通过C-端CAAX基序中的geranyl-geranylated cys 420靶向到膜上。27,28。然后我们询问Fbxl 2的膜靶向是否是其对EGFR表达影响的先决条件。如图所示。2i,j,与野生型fbxl 2、fbxl 2不同。C420S,一种在靶向膜方面存在缺陷的突变蛋白27,不能结合和抑制EGFR蛋白在各种非小细胞肺癌细胞中的表达。此外,细胞分馏实验表明,质膜相关的fbxl 2,而不是胞浆fbxl 2。C420S,诱导细胞膜相关EGFR降解。2K)。此外,免疫荧光和流式细胞仪分析表明,Fbxl 2与EGFR共定位,EGFR在质膜上的表达降低。2L和补充图。2E)。有趣的是,EGFR和fbxl 2也共同定位于内质网(Erf),这一点通过对ER跟踪器或葡萄糖调节蛋白78(Grp 78)的染色进一步证实,这是一个常用的err标记。30(无花果)2L和补充图。2F)。与此一致的是,Fbxl 2,而不是Fbxl 2。C420S,显著降低血浆膜相关EGFR和ER相关EGFR(补充图)。2G,h)。因此,Fbxl 2的膜靶向功能对EGFR蛋白在质膜和ER上的不稳定性是必不可少的。

Fbxl 2抑制EGFR过表达或EGFRL858R/T790M-促进非小细胞肺癌的生长,并与EGFR在非小细胞肺癌中的表达呈负相关。

我们的结果促使我们验证Fbxl 2和EGFR在NSCLC中的临床相关性。如图所示。3A对TCGA数据库的分析表明,Fbxl 2在NSCLC中的表达明显降低,即使在含有EGFR基因突变的癌组织中也是如此。此外,组织微阵列(TMA)分析显示,66.67%(50/75)的人肺鳞状细胞癌(LUSC)组织中Fbxl 2的表达水平低于癌旁组织(图1)。3B)。同样,fbxl 2在rosa26-lsl-EGFR肺癌组织中的表达也降低了。L858R/T790M老鼠(n=8,附图。3A)。我们进一步研究了Fbxl 2在人肺腺癌(LUAD)不同阶段的表达情况。如图所示。3CTMA分析表明,Fbxl 2在肺腺癌发展过程中逐渐减少。此外,Fbxl 2与EGFR蛋白在肺腺癌和肺鳞状细胞癌中的表达呈负相关。3D,e和补充图。3B)。在本研究中,Fbxl 2的低表达与EGFR的高表达呈负相关(补充图)。3C)。此外,对Kaplan−Meier生存数据集的分析表明,Fbxl 2的低表达与总体生存率(OS)差有关。3F).

图3:fbxl 2抑制EGFR过表达或EGFRL858R/T790M-驱动的NSCLC生长与Fbxl 2和EGFR的表达呈负相关。
figure3

a非小细胞肺癌组织中Fbxl 2 mRNA的表达n=1022)或具有EGFR突变的非小细胞肺癌(n=225)和正常肺组织(n用TCGA数据库(LUAD和LUSC)进行分析。b来自LUSC的组织微阵列幻灯片(n对75对肿瘤及癌旁标本进行IHC分析。显示IHC染色的典型图像。c由LUAD衍生的组织微阵列幻灯片(n进行IHC分析。显示IHC染色的典型图像。AOD染色。d, e采用IHC法检测LUSC组织中EGFR和Fbxl 2的表达,并进行Pearson相关分析。AOD染色。f根据患者肿瘤标本中Fbxl2mRNA水平,将肺癌患者总体生存(OS)的Kaplan、−、Meier图进行分层。H 292细胞对Fbxl 2稳定表达shRNAs的作用gWesternblot分析,hMTS检测,或i菌落形成试验。进行了三个独立的实验。H 292稳定细胞jWesternblot分析k异种移植物肿瘤生长测定(n=5/组)。给出肿瘤和生长曲线的照片。**p=0.0063,*p=0.00025。H 1975细胞对Fbxl 2稳定表达shRNAs的作用lWesternblot分析,mMTS检测,或n菌落形成试验。进行了三个独立的实验。orRosa26-LSL-EGFRL858R/T790M用小鼠观察Fbxl 2对EGFR的影响T790M-介导的TKI抗性(n=4或6/组)。o显示了具有代表性的微CT图像和肺部照片。卡其色、绿色或紫红色分别代表心脏、肺或肿瘤.p显示肺表面可见结节的数目。石蜡包埋肺qH&E染色或rIHC分析数据用AOD量化。数据表示为平均值±SD(a, c, hi,和m, n)或表示±SEM(k, p,和r). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; by two-tailed Student’s t-测试。源数据作为源数据文件提供。

上述结果表明,fbxl 2是EGFR的关键负调节因子,因此,我们利用高表达野生型EGFR的H 292细胞研究了fbxl 2对细胞增殖和肿瘤生长的影响。31。如图所示。3G−I和补充图。三维空间Fbxl 2沉默后,EGFR表达上调,AKT/ERK蛋白磷酸化增加,细胞增殖增加。相反,野生型fbxl 2的异位表达,而不是fbxl 2的异位表达。C420S,Fbxl 2ΔF,或Fbxl 24A,可明显降低EGFR蛋白水平,降低AKT/ERK蛋白磷酸化,抑制细胞增殖。3J和补充图。3E)。此外,野生型fbxl 2,而不是fbxl 2。C420S,对H 292异种移植小鼠模型的肿瘤生长有明显的抑制作用。3K)。这些结果表明,Fbxl 2能抑制EGFR过表达的NSCLC的生长。

EGFR的表达L858R/T790M在肺癌患者中经常发现突变蛋白,我们随后研究了Fbxl 2对EGFR生长的影响。L858R/T790M-体外和体内驱动的非小细胞肺癌。如图所示。3L−n和补充图。4A,Fbxl 2的沉默显著上调了EGFR的表达L858R/T790M表达,激活EGFR下游通路,促进H 1975细胞增殖。相反,野生型fbxl 2的异位表达,而不是fbxl 2的异位表达。ΔF或Fbxl 24A突变体,减少的EGFRL858R/T790M蛋白表达及抑制EGFR下游通路,同时抑制H 1975细胞增殖和集落形成(附图)。4B−d)。进一步证实Fbxl 2对EGFR生长的抑制作用L858R/T790M-驱动非小细胞肺癌在体内,我们产生了cre-诱导rosa26-lsl-eGFR。L858R/T790M肺肿瘤小鼠模型(附图)4E)。如图所示。3o−Q,Ade-CRE诱导的EGFR表达L858R/T790MHA-Fbxl 2的慢病毒表达能有效地抑制肺癌的形成,如微CT扫描、肺肿瘤数目的测定、肿瘤切片的H&E染色等。此外,来自HA-Fbxl2表达小鼠的肺损伤显示EGFR和p-EGFR的表达显著降低(如图所示)。3R和补充图。4F)。此外,Ki 67显著减少。+细胞对caspase-3的切割无显着性差异(P>0.05)。+(CC3)+)凋亡细胞(补充图。4F,g),提示Fbxl 2主要通过抑制肿瘤细胞增殖而抑制肿瘤生长。这些结果表明,Fbxl 2可以抑制EGFR。L858R/T790M-驱动肺肿瘤生长。

Fbxl 2通过下调EGFR表达抑制NSCLC生长

为了探讨EGFR下调是否与Fbxl 2诱导的NSCLC生长抑制有关,我们进行了挽救实验。如图所示。4A−d在细胞水平上,EGFR的同时沉默完全挽救了Fbxl 2基因敲除诱导的EGFR下游通路的激活和H 292或H 1975细胞增殖的增强。此外,EGFR的沉默明显地挽救了H 292异种移植小鼠模型中Fbxl2基因敲除诱导的肿瘤生长。4E,f),提示Fbxl 2沉默通过上调EGFR表达促进NSCLC细胞增殖和肿瘤生长。为了证实这一结论,我们进一步研究了EGFR异位表达的影响。E931A拯救Fbxl 2介导的抑制NSCLC生长的研究。我们的结果表明,虽然EGFRE931A不能结合Fbxl 2,它保留野生型EGFR激酶活性(补充图)。5A)。EGFR的异位表达E931AFbxl 2的异位表达抑制细胞增殖和肿瘤生长(图2)。4G−l)。这些结果表明,Fbxl 2通过下调EGFR的表达而抑制细胞增殖和NSCLC的生长。为了保持这一细胞系,我们研究了Fbxl 2对A 549和H 1299细胞生长的影响,这两种细胞都含有一个突变型RAS,这是EGFR信号转导的关键下游效应。如附图所示。5B,cFbxl 2能有效抑制EGFR的表达,但对A 549或H 1299细胞的ERK活化或增殖无明显影响,提示EGFR信号通路参与了Fbxl 2对NSCLC生长的影响。

图4:Fbxl 2通过下调EGFR表达抑制NSCLC生长。

稳定表达shFBXL2或shEGFR的H 292或H 1975细胞aWesternblot分析,bMTS检测,或c, d菌落形成试验。进行了三个独立的实验。数据以均值±SD表示。e, fH 292细胞稳定表达shFBXL2或shEGFR,或两者均接受异种移植瘤生长试验。n=5/组)。接种后第21天处死小鼠,对肿瘤进行解剖和拍照。以肿瘤生长曲线和肿瘤重量为手段±SEM。H 292或H 1975细胞稳定表达Ha-Fbxl2或Fag-EGFRE931A,或者两者都受到gWesternblot分析,hMTS检测,或i, j菌落形成试验。进行了三个独立的实验。数据以均值±SD表示。k, lH 292细胞稳定表达HA-Fbxl 2或Fag-EGFRE931A,或两者均接受异种移植肿瘤生长试验(n=5/组)。接种后第19天处死小鼠,对肿瘤进行解剖和拍照。以肿瘤生长曲线和肿瘤重量为手段±SEM。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; all by two-tailed Student’s t-测试。源数据作为源数据文件提供。

Grp 94与Fbxl 2竞争EGFR结合和抑制Grp 94增强Fbxl 2介导的对TKI耐药NSCLC生长的抑制作用

由于Fbxl 2在内质网上也与EGFR共存,我们推测内质网可能参与了Fbxl 2介导的EGFR蛋白稳定性调控。因此,我们调查了hsp 90家族的ER成员Grp 94是否与蛋白质稳态密切相关。32,在调节EGFR蛋白稳定性中起着重要作用。如图所示。5A在PC-9或H 1975细胞中,Grp 94明显下调EGFR的表达。Grp 94能结合EGFR的JX结构域,但不能结合Fbxl 2(图1)。5B和补充图。6A)。值得注意的是,Grp 94以剂量依赖性的方式干扰Fbxl 2与EGFR的结合。相反,Fbxl 2以剂量依赖性的方式干扰Grp 94与EGFR的结合。5C)。这些结果提示Fbxl 2和Grp 94相互竞争以获得EGFR结合。一直以来,EGFRE931A,一个无法与Fbxl 2相互作用的突变体,结合更多Grp 94,而EGFR∆JX,一个突变体在与Grp 94的相互作用中存在缺陷,与Fbxl 2结合较多。5D,e)。此外,无论是沉默Grp 94,还是被小分子抑制剂ganetespib抑制Grp 94,都显著增强了Fbxl 2与EGFR之间的相互作用。T790M,导致Fbxl 2介导的EGFR降解加速。L858R/T790M蛋白质(图1.5F−j)。此外,TCGA数据库的临床分析显示Fbxl 2在肺腺癌(LUAD)或肺鳞状细胞癌(LUSC)中低表达,Grp 94高表达(附图)。6B,c).

图5:Grp 94与Fbxl 2竞争EGFR结合,抑制Grp 94促进Fbxl 2介导的EGFR降解,抑制TKI抵抗的肺癌生长。

a对稳定表达shGrp 94的PC-9或H 1975细胞进行westernblot分析。b, c用指示表达质粒共转染HEK293T细胞36h,然后用MG 132处理4h,再进行IP-Western分析。d, e将HA-Fbxl 2、Myc-Grp 94共转染HEK293T细胞36h,用MG 132处理细胞4h,经IP-Western分析后,检测HA-Fbxl2、Myc-Grp 94在HEK293T细胞中的表达情况。FLAG-EGFR共转染HEK293T细胞T790M、ha-Fbxl 2和shCtrl或shGrp 94在夜间表达质粒(f);或将FLAG-EGFR共转染HEK293T细胞。T790MHA-Fbxl 2在一夜之间表达,然后用或不加加尼替比(8 NM)处理12h(g)。细胞经MG 132处理4h后,进行IP-Western分析。将EGFR与Fbxl 2结合的亲和力量化为均值±SD。iH 1975细胞稳定表达HA-Fbxl 2或shGrp 94,或两者同时表达,经westernblot分析。jH1975细胞稳定表达Ha-Fbxl 2,在Westernblot分析前,分别用或不加甘露司比(8NM)处理24h。稳定表达shFBXL2或shGrp 94的pc-9细胞kWesternblot分析ln异种移植物肿瘤生长测定(n=5/组)。给出肿瘤的照片、生长曲线和肿瘤重量。o, pH 1975细胞稳定表达HA-Fbxl 2或shGrp 94,或同时表达Ha-Fbxl 2或shGrp 94,均接受异种移植瘤生长试验(n=5/组)。给出肿瘤的照片、生长曲线和肿瘤重量。q, rH 1975细胞(5×10)5稳定表达HA-Fbxl 2或载体的人接受异种移植瘤生长试验(n=5/组)。小鼠用erlotinib或ganetespib治疗。给出了典型的生物发光成像、生长曲线和肿瘤重量。实验被独立地重复了三次,得到了相似的结果。agik)。数据显示为平均值±扫描电镜(m, n, p,和r). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; all by two-tailed Student’s t-测试。源数据作为源数据文件提供。

接下来我们研究了Grp 94对细胞增殖和NSCLC肿瘤生长的影响是否依赖于Fbxl 2。如附图所示。6d沉默Grp 94对H 1975细胞EGFR表达和增殖均有抑制作用,EGFR的异位表达很好地挽救了H 1975细胞的增殖。T790M。同时沉默Fbxl 2还能很好地挽救Grp 94基因敲除诱导的PC-9异种移植小鼠模型中EGFR的抑制和肿瘤生长,提示Grp 94通过Fbxl 2影响EGFR的表达和肿瘤的生长。5K−n)。相反,GRP 94的异位表达明显恢复了EGFR和PC-9异种移植瘤的生长,而异位表达Fbxl 2(补充图2)对两者均有抑制作用。6E−h)。此外,Grp 94的异位表达或Fbxl 2的沉默也能很好地挽救甘尼替布对EGFR和细胞增殖的抑制作用(附图)。6i,j),表明灵芝对EGFR表达和细胞增殖的抑制作用依赖于Grp 94和Fbxl 2。

其次,我们研究了联合靶向Grp 94和Fbxl 2对异种移植肺肿瘤生长的影响。如图所示。5o,p沉默Grp 94可显著增强Fbxl 2介导的抑制H 1975异种移植瘤生长的作用。同样,灵芝也能显著增强Fbxl 2介导的抑制细胞增殖和H 1975异种移植瘤生长的作用。5q,r和补充图。7A),伴随着EGFR总蛋白和磷酸化EGFR蛋白水平的降低和Ki 67的降低。+细胞(附图)7b−d)。此外,灵芝可显著增加凋亡细胞(CC3)。+)(附图。7D)。因此,灵芝对Grp 94的抑制通过抑制细胞增殖和促进凋亡细胞死亡而增强Fbxl 2对TKI耐药肺肿瘤生长的抑制作用。

Nebivolol是Fbxl 2的激活剂,在促进EGFR降解和抑制NSCLC生长方面起着重要作用。

考虑到Fbxl 2介导的EGFR的重要作用T790M在抑制耐TKI非小细胞肺癌的生长过程中,我们认为靶向Fbxl 2对TKI耐药的NSCLC的治疗是有益的。为了在临床前证明这一概念,我们的目的是鉴定Fbxl 2的激活剂。据报道,fbxl 2被E3泛素连接酶Fbxo 3靶向并降解,fbxo 3-apag结构域是fbxl 2相互作用所必需的。26,33。因此,我们筛选了小分子抑制剂的化学文库,这些抑制剂可以与Fbxo 3-apag结构域结合,干扰Fbxo 3−Fbxl 2的相互作用,从而使Fbxl 2蛋白稳定,从而促进Fbxo 3蛋白降解。在这方面,我们首先研究了Fbxo 3的抑制是否会导致EGFR表达的降低。事实上,Fbxo 3的沉默导致Fbxl 2蛋白水平增加,EGFR降低。L858R/T790MH1975细胞中EGFR下游信号传导受到抑制,同时通过Fbxl 2的沉默,均能很好地挽救H1975细胞的EGFR下游信号(如图2所示)。6A和补充图。8A).

图6:Nebivolol上调Fbxl 2,促进EGFR降解,抑制肿瘤生长。
figure6

aH 1975稳定细胞进行Westernblot分析。bNebivolol的化学结构和nebivolol与Fbxo3-apag结构域的分子对接模型。cLigPlot投影相互作用示意图65在Fbxo 3-apag结构域的指示残基与nebivolol之间。氢键或静电相互作用分别在绿色或蓝色的破折号线中突出显示。疏水作用被认为是短的辐射红线。转染所述表达质粒的HEK293T细胞不含.d)或与(e10 mnebivolol处理36h,在IP-Western分析前用MG 132处理细胞。f在Westernblot分析之前,对H 1975细胞进行Nebivolol处理,并给予一定的剂量和时间间隔。g在Westernblot分析前,用10μm nebivolol处理PC-9稳定细胞48 h。h集成电路50在PC-9或H 1975细胞中,用nebivolol或BC-1215进行MTS检测。数据以均值±SD表示。i, j异种移植物肿瘤生长试验对PC-9稳定细胞的影响(n=5/组)。给出肿瘤的照片、生长曲线和肿瘤重量。kn转基因小鼠(rosa26-LSL-EGFR)L858R/T790M)使用(n=5/组)。k显示有代表性的荧光图像和肺部照片。红色荧光显示EGFR高表达。典型的EGFR高表达肿瘤出现在折线上。l显示肺表面可见结节的数目。石蜡包埋肺mH&E染色或nIHC分析从杭州华安生物技术有限公司(杭州)定制了一种抗小鼠Fbxl 2的特异性多克隆抗体。oH 1975细胞(5×10)5)接受异种移植肿瘤生长试验(n=5/组)。给出生长曲线和肿瘤重量。实验被独立地重复了三次,得到了相似的结果。adh)。数据显示为平均值±扫描电镜(j, n,和o). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; by two-tailed Student’s t-测试。源数据作为源数据文件提供。

通过虚拟筛选由2,373份FDA批准的药物组成的DrugBank数据库34,对能够与Fbxo 3-apag结构域结合的小化合物进行了评分(附图)。8B)。获得了三种顶级药物,nebivolol、flibanserin和raltegrar(附图)。8C还有无花果。6B)。值得注意的是,nebivolol,一种用于治疗高血压或心力衰竭患者的β-阻滞剂。35,被确定为最佳命中的证据,如初步生物试验(补充图)。8D)。对接结果表明,Nebivolol可以在apag区域形成哑铃状腔。空腔中心有5个氨基酸残基(I 331、E 341、T 367、T 368和F 369)。T 367和T 368与Nebivolol形成氢键,而E 341与Nebivolol的正电荷胺非常接近,说明它们之间存在着很强的电荷−电荷静电相互作用。预测了Nebivolol两翼的杂环基团与疏水相互作用在形状互补腔中的分布(图1)。6B,c)。与此模型相一致的是,Fbxo 3蛋白与内源性Fbxl 2的结合亲和力明显降低。6d)。综上所述,这些结果表明,Nebivolol是一个潜在的小分子,可以破坏Fbxo 3−Fbxl 2的相互作用。

然后,我们研究了尼比洛尔是否能干扰Fbxo 3−Fbxl 2的相互作用,并抑制EGFR的表达。如图所示。6E,Nebivolol能干扰Fbxl 2与Fbxo 3的结合。此外,nebivolol在PC-9或H 1975细胞中明显上调了Fbxl 2的表达,并以时间和剂量依赖性的方式下调了EGFR的表达(如图1所示)。6f和补充图。8E)。值得注意的是,nebivolol既不能增加Fbxl 2的表达,也不能在Fbxo 3沉默后降低EGFR蛋白水平(补充图3)。8F)。另外,nebivolol在Fbxl 2沉默后不能抑制EGFR的表达(图1)。6gNbivolol对EGFR表达的影响是Fbxo 3/Fbxl 2-依赖性的。与此相一致的是,nebivolol诱导的EGFR减少被MG 132所挽救,但没有被氯喹所挽救,其方式类似于异位表达的Fbxl 2(补充图2)。8g)。这些结果表明,nebivolol可以破坏Fbxo 3−Fbxl 2的相互作用,导致Fbxl 2的上调,促进Fbxl 2的降解。

此外,nebivolol以剂量依赖性的方式对NSCLC细胞的活性有很强的抑制作用(图1)。六小时)。Bc-1215,一种已知的fbxo 3−fbxl 2相互作用抑制剂26,并行使用。值得注意的是,nebivolol对携带野生型ras的pc-9细胞的增殖有明显的抑制作用,但对具有K-ras的A 549细胞的抑制作用不大。G12S(补充图。8H表明EGFR信号转导通路主要参与nebivolol对NSCLC细胞增殖的抑制作用。此外,nebivolol对PC-9异种移植小鼠模型中的细胞增殖和肿瘤生长有明显的抑制作用,但在Fbxl 2(补充图2)沉默后未见明显的抑制作用。8I还有无花果。6i,j)。这些结果表明,nebivolol对Fbxl 2的上调作用与其抑制生长有关。

接下来,我们用EGFR来评估尼比伏洛尔的治疗潜力。L858R/T790M-驱动型NSCLC小鼠模型。如图所示。6k−m,nebivolol强烈抑制EGFR的表达,并抑制EGFR的表达。L858R/T790M-肺部肿瘤的形成,表现为肺癌数量和肿瘤大小的显著减少。此外,ihc对nebivolol处理的小鼠肺损伤的分析显示,fbxl 2的表达明显上调,EGFR和cyclind3的表达显著降低,而cyclind3是fbxl 2的已知底物。25,与未治疗的小鼠进行比较(图1)。6N和补充图。9a,b)。值得注意的是,nebivolol治疗导致Ki 67大幅度下降。+细胞,对caspase-3的切割无明显影响。+(CC3)+)凋亡细胞(补充图。9B)。此外,甘露司比对Grp 94的抑制显著增强了nebivolol介导的两种EGFR的降低作用。L858R/T790M肿瘤生长的表达和抑制。6O和补充图。9C−h)。同时,这些结果也证明了nebivolol是一种Fbxl 2激活剂,能抑制耐TKI的肿瘤生长,而甘露司比能增强肿瘤的生长。

活化Fbxl 2克服非小细胞肺癌对Osimertinib的耐药性

耐EGFR-TKIs是非小细胞肺癌治疗的主要障碍,目前还没有批准的新一代耐奥西美提尼非小细胞肺癌的TKI。因此,我们研究了Fbxl 2对非小细胞肺癌Osimertinib耐药的影响。为此,我们首先研究了Fbxl 2对耐Osimertinib的EGFR突变蛋白表达的影响。如附图所示。10A,Fbxl 2明显抑制EGFR L792H、G796D、C797S和L718Q突变蛋白的表达,这些蛋白均介导了对Osimertinib的抗性。14,15,36,37。此外,fbxl 2还显著抑制了EGFR e709k、l798i和l844v的表达,这些基因均来自非小细胞肺癌患者对wz 4002和co 1686的耐药,这是临床前研究中潜在的第三代tkis。38,39(补充图。10A)。特别是,fbxl 2抑制了EGFR的表达,缩短了其半衰期。T790M/C797S蛋白质,使所有现有的EGFR-TKIs都具有抵抗力。40(无花果)7A−c)。此外,Fbxl 2能够与EGFR结合。C797S或EGFRT790M/C797S蛋白质(附图)10b)。这些结果表明,Fbxl 2可抑制对Osimertinib抗性的EGFR突变蛋白的表达。

图7:Fbxl 2的激活克服了非小细胞肺癌的Osimertinib耐药性。

a用指示表达质粒共转染HEK293T细胞36h,Westernblot分析。数据是具有代表性的三种独立试验的免疫印迹。b, cFLAG-EGFR共转染HEK293T细胞T790M/C797S在HA-Fbxl 2或载体对照存在下36h,用50 g/mL环己酮(CHX)处理,在Westernblot分析前有一个指定的时间间隔。对EGFR蛋白水平进行量化,并给出一份代表蛋白质半衰期的图表.Pc-9-旗帜-EGFRT790M/C797S稳定表达HA-Fbxl 2或Ha-Fbxl 2的细胞C420SdWesternblot分析eg异种移植物肿瘤生长测定(n=6/组)。给出肿瘤的照片、生长曲线和肿瘤重量。石蜡包埋肿瘤进行IHC分析。数据用AOD量化。数据为均值±扫描电镜。h稳定表达EGFR的PC-9细胞T790M/C797S用编码HA-Fbxl 2的慢病毒感染PC-9/AZDR。在MTS分析前,用一定剂量的Osimertinib处理细胞72h。从三个独立实验中得到的数据作为均值±SD。***p < 0.001. iPC-9/AZDR细胞稳定表达shFBXL2,在5μM nebivolol不存在或存在下,给予一定剂量的Osimertinib处理48h,然后进行MTS检测。三个独立实验的数据作为均值±SD。j, kPC-9/AZDR稳定细胞(2×10)5)接受异种移植肿瘤生长试验(n=5/组)。小鼠单独或联合给药。图像显示肿瘤及肿瘤生长曲线。数据为均值±扫描电镜。l一个工作模式。E3泛素连接酶Fbxl 2靶向EGFR和EGFR突变体进行蛋白酶体降解,从而抑制NSCLC的肿瘤生长和TKI耐药。Grp 94结合并保护EGFR免受Fbxl 2介导的降解。Fda批准的药物nebivolol可以破坏fbxo 3−fbxl 2的相互作用,稳定fbxl 2并降低EGFR,从而抑制非小细胞肺癌的生长和耐TKI。p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; all by two-tailed Student’s t-测试。源数据作为源数据文件提供。

为了进一步研究fbxl 2激活对耐药非小细胞肺癌生长的影响,我们建立了稳定表达EGFR的pc-9细胞。T790M/C797S(PC-9/AZDR),抗Osimertinib(附图)。10C)。如图所示。7D和补充图。10d,e、nebivolol治疗或异位表达Fbxl 2降低的EGFRT790M/C797S蛋白质的表达,伴随着细胞增殖的抑制。此外,nebivolol诱导的细胞增殖抑制作用也被Grp 94特异性抑制剂(Grp 94-1,iGrp 94-1)显著增强。41)(附图。10F)。此外,野生型fbxl 2,而不是fbxl 2。C420S,显著抑制pc-9/azdr异种移植瘤的生长,同时显著降低EGFR和Ki 67的表达。+细胞(图1.7E−g和补充图。10g)。这些结果表明,激活Fbxl 2可有效抑制Osimertinib耐药NSCLC的生长。

在体外和体内研究了Fbxl 2和osimertinib对耐TKI非小细胞肺癌生长的影响。集成电路50结果表明,无论是异位Fbxl 2表达还是nebivolol均能显著降低对erlotinib、geifinib或osimertinib的抗性。7H,i和补充图。11A,b)。另外,尼比洛尔和奥西美替尼联合应用可显著抑制pc-9/AZDR异种移植小鼠对Osimertinib耐药非小细胞肺癌的生长(图1)。7J,k),没有明显的肝损伤或体重改变(补充图。11C)。值得注意的是,nebivolol不能降低fbxl 2沉默时对osimertinib的抗性(图1)。7i−k)。与此一致,异位Fbxl 2的表达或nebivolol对EGFR的影响不大。E931G突变诱导的erlotinib或osimertinib抗性(附图)。11d,e)。这些结果共同表明,尼比洛尔和奥西美替尼联合使用可以有效地克服EGFR。T790M/C797S-诱导非小细胞肺癌Osimertinib在Fbxl 2依赖性中的耐药。

讨论

肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因.主要的基于EGFR-TKI的非小细胞肺癌治疗机制已经从吉非替尼(2003年)、埃罗替尼(2004年)、阿法蒂尼(2013年)发展到奥西美尔替尼(2015年),所有这些都大大改善了患者的生存结果和预后。然而,几乎所有患者最终在使用这些EGFR-TKIs治疗后都会出现获得性耐药.伴随着基因的扩增相见HER 2以及RAS, BRAF,或PIK3CA、EGFRT790M是对第1代和第2代EGFR-TKIs最常见的突变(geifinib、erlotinib和afatinib)。42。第三代的EGFR-TKI,Osimertinib,已经被开发出来来克服EGFR。T790M-介导TKI耐药,作为EGFR突变型NSCLC的一线治疗方法.不幸的是,对osimertinib耐药的新突变以EGFR为例。C797S,早在2015年就出现了14。因此,制定克服EGFR-TKI耐药的新策略具有重要意义。

在本研究中,我们提出了临床前证据,证明了靶向Fbxl 2/Grp 94促进EGFR蛋白转换可能是治疗TKI耐药NSCLC的一种新的治疗策略。我们证明Fbxl 2是一种针对野生型EGFR、EGFR激活突变体(L 858R或19del)和耐EGFR TKI突变体(包括EGFR T790M或T790M/C797S)的E3泛素连接酶,在体外和体内均能抑制肿瘤生长和TKI抗性。临床分析也证实了Fbxl 2与EGFR的关系,Fbxl 2在NSCLC中的表达与EGFR呈负相关,Fbxl 2在NSCLC中的表达降低,与临床预后不良有关。重要的是,我们已经确认了一种由美国食品药品管理局批准的药物--尼比沃洛35,是Fbxl 2的激活剂。Nebivolol对Osimertinib耐药NSCLC生长有较强的抑制作用.尼比洛尔与奥西美替尼联合应用,有效地克服了体内奥西美尔替尼的抗药性。结果表明,在体内,nebivolol能干扰Fbxl 2与Fbxo 3的相互作用。为了验证nebivolol与Fbxo 3-apag的直接相互作用,我们采用重组Fbxo 3-apag蛋白进行体外结合试验。这个问题值得进一步研究。

Fbxl 2的生物学功能似乎与癌症的发展有关。而一些研究表明,Fbxl 2能促进游离P85β或IP3R3的降解,抑制自噬和凋亡。27,28,Fbxl 2还可以靶向多种癌蛋白,包括cyclinD 2、cyclinD3或Aurora B,从而抑制细胞增殖和肿瘤生长。24,25,43。我们的结果强烈支持Fbxl 2通过靶向和促进EGFR降解从而抑制EGFR下游信号和抑制肿瘤生长的观点。重要的是,我们的结果表明,Fbxl 2对细胞增殖和NSCLC生长的抑制作用主要依赖于EGFR信号转导。首先,Fbxl 2介导的抑制细胞增殖和肿瘤生长的作用可以通过恢复EGFR的表达而完全恢复。其次,fbxl 2抑制h 292、pc 9或h 1975细胞的增殖,这些细胞均带有野生型ras等位基因,而对携带活化ras的A 549或H 1299细胞无明显影响,这符合基于EGFR-tki的非小细胞肺癌治疗不适用于活化ras患者的临床指南。44,45。此外,Fbxl 2或nebivolol都能有效地克服eGFR介导的erlotinib或osimertinib耐药性。T790M或EGFRC797S,但不是由fbxl 2-不敏感的EGFR介导的。E931G。这些结果共同提供了强有力的证据,证明Fbxl 2介导的抑制NSCLC生长和TKI抵抗依赖于Fbxl 2诱导的EGFR蛋白降解。然而,本研究并不排除Fbxl 2介导的对其他信号分子(如cyclinD 3)的调控在NSCLC生长中的作用。值得注意的是,据报道,长春瑞滨,一种临床使用的化疗药物,可以靶向微管蛋白,使耐EGFR的tki细胞敏感。46。证明长春瑞滨能增加Fbxl 2的表达,下调细胞周期素D3的表达,诱导细胞凋亡。25。因此,长春瑞滨介导的Fbxl 2上调在EGFR失稳中的作用值得进一步研究。此外,还可以探讨长春瑞滨和尼比沃尔联合应用是否能更好地抑制肿瘤生长和TKI抗性。

EGFR蛋白稳态在各种不同的生物过程中至关重要,它的破坏会导致各种人类疾病。47。在本研究中,我们发现EGFR蛋白稳态是通过参与溶酶体和蛋白酶体降解途径的配体依赖性和不依赖配体的方式来维持的。EGFR的表达在EGF的刺激下受到严格的调控。E3泛素连接酶c-cbl通过溶酶体与表皮生长因子(EGF)相互作用,促进EGFR降解。48。值得注意的是,去泛素化酶(Dub)USP2a和uchl 1可以去泛素,稳定EGFR蛋白。49,50。另一方面,USP9X可以调节EGFR蛋白的内化和转运,从而影响EGFR蛋白的周转。5。结果表明,Fbxl 2是一种重要的E3泛素连接酶,与EGF刺激无关,可促进EGFR蛋白酶体降解。在生理条件下,c-cbl可促进表皮生长因子(EGF)诱导的EGFR蛋白溶酶体降解,从而为抑制质膜相关的EGFR信号提供重要机制。48。为了保持适当的蛋白质稳态,必须考虑ER中新合成的EGFR蛋白水平。芯片/HSP 70和Hsp 90可调控新合成的EGFR蛋白稳定性51,52,53。在本研究中,我们发现Grp 94可以与Fbxl 2竞争,保护EGFR免受Fbxl 2介导的降解。由于Fbxl 2和Grp 94与EGFR中的不同片段结合,因此Grp 94与EGFR的结合可能改变了蛋白的确认,从而阻止了Fbxl 2与EGFR的稳定相互作用,反之亦然。因此,EGFR蛋白稳定性受多种复杂调控水平的控制,包括特定的E3连接酶、D配体、蛋白酶、蛋白酶体和溶酶体的组成,以及影响这些酶的表达和活性的修饰因素。在本研究中,我们证明Fbxl 2是EGFR关键的E3泛素连接酶,因为Fbxl 2的表达改变深刻地影响了EGFR蛋白的稳定性。

值得注意的是,新的证据表明选择性抑制Grp 94可能是治疗癌症的有效方法。18,54。本研究表明,甘露醇通过抑制Grp 94抑制NSCLC细胞增殖,Fbxl 2活化与Grp 94抑制联合作用对EGFR突变型NSCLC具有较强的生长抑制作用。同时,靶向Fbxl 2,如nebivolol,结合EGFR-TKI或Grp 94特异性抑制剂,可能代表了一种对NSCLC,特别是Osimertinib耐药的非小细胞肺癌(NSCLC)进行EGFR靶向治疗的策略。


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