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单细胞RNA测序与大颗粒淋巴细胞白血病T细胞的TCR分析相结合

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发表时间:2022-04-15 13:46作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

T细胞大颗粒淋巴细胞白血病(T-LGLL)是一种淋巴增生性疾病和骨髓衰竭综合征,对免疫抑制疗法有反应。我们显示单细胞TCR与CD3的RNA测序相结合+来自13名患者的t细胞,在阿仑珠单抗治疗前后取样。效应记忆T细胞和T细胞受体(TCR)多样性缺失在LGLL霸王龙中普遍存在。共享的TCRA和TCRB克隆型不存在。细胞存活和凋亡基因程序失调,CD8细胞凋亡基因明显下调+克隆是LGLL T细胞的显著特征。阿仑珠单抗治疗后凋亡基因上调,尤其是有反应者比无反应者;凋亡基因的基线表达水平可预测血液学反应。阿仑单抗不能减弱TCR克隆性,治疗后TCR多样性进一步偏斜。从单细胞数据分析中得出的推论有助于理解LGLL霸王龙克隆扩增和持续的病理生理学机制。

介绍

T细胞大颗粒淋巴细胞白血病(T-LGLL)是一种淋巴增生性疾病,通常表现为血细胞减少,典型特征是终末分化的效应记忆细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的克隆性扩增。已经假设T-LGLL是由慢性抗原暴露、对Fas-FasL介导的凋亡的抗性以及Janus激酶(JAK)和其他存活途径中信号蛋白的组成型激活所驱动的1,2,3。JAK-STAT通路激活几乎存在于所有病例中,功能获得性突变存在于所有病例中。STAT3STAT5B已经在大约一半的患者中被确认3。抗原结合区(互补决定区3,CDR3)的测序和流式细胞仪对T细胞受体(TCR)可变β链(Vβ)的测量提供了LGLL T细胞克隆扩增的临床证据4,5。Vβ流式细胞术和TCRγ-聚合酶链反应(PCR)分析具有很好的相关性,但是目前的单克隆抗体组仅包括大约75%的Vβ谱4。下一代测序(NGS)在Vβ和Vα链上的应用并不常见,成对的链信息在大量细胞群体的测序中丢失,只能使用统计算法进行配对6,7。因此,缺乏LGLL T-区TCR谱的高分辨率分析。由于患者之间的异质性,使用全外周血或在通过流式细胞术富集特定克隆后表征克隆CTL转录组的努力没有提供令人满意的分辨率和规模。

用各种免疫抑制药物(主要是环孢菌素)和淋巴细胞毒性剂(如氨甲喋呤)成功地治疗了t-LGLL;JAK-STAT信号的抑制在初步试验中也有效1。虽然针对T-LGLL细胞群的治疗是有效的,但是在某些情况下应答和无应答的基础是未知的。特别是,血细胞计数的改善可以在不根除CTL克隆的情况下发生,CTL克隆在停止治疗后经常持续存在,正如我们最近在难治性T-LGLL患者中对阿仑珠单抗(一种单克隆抗淋巴细胞抗体)的研究1.

单细胞TCR V(D)J测序结合RNA测序能够在高通量下以单细胞分辨率分析成对的TCRα和TCRβ链7,8以及同一细胞中偶联的全局基因表达,使得有可能表征稳定状态和疾病中的T细胞克隆扩增,并追踪同一克隆在疾病过程中和治疗中的转录组变化7,9,10,11,12,13。采用单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析的研究有助于确定肿瘤和检查点抑制剂治疗中的免疫细胞亚群14,15,16,17,以及自身免疫性疾病18,但是在LGLL霸王龙中没有进行过这样的研究。

我们将单细胞TCR测序(scTCR-seq)与scRNA-seq结合应用于CD3+从相对较大的T-LGLL患者队列中获得的T细胞,这些患者已经在临床上得到很好的表征,并通过常规实验室检测作为阿仑珠单抗在难治性疾病中的前瞻性试验治疗的临床方案的一部分。我们试图描述TCR的特征,并在单细胞水平上定义病理生理学机制。此外,我们希望确定免疫疗法在这种疾病中的作用机制。我们的方法应该适用于以T细胞病理生理学为特征的其他综合征,但更微妙的克隆扩增。

结果

T-LGLL患者T细胞的scRNA-seq显示CD8的扩增+效应T细胞

为了描述T-LGLL患者T细胞的表型、功能状态和克隆能力,我们构建了一个包含约500,000 CD3的图谱+13例患者的t细胞(男/女,7/6;中位年龄51岁,范围26-85 ),其血液样本在阿仑珠单抗治疗3-6个月前后采集,并来自7名匹配的健康对照者捐献的血液(补充表1).我们的研究用图表表示在图中。1a。补充数据中显示了排序指标1.

图1:T-LGLL患者的T细胞景观。
figure 1

a实验研究设计方案。b所有患者和健康供体中T细胞的单细胞基因表达的T分布随机邻近嵌入(t-SNE)图,用CD4着色+和CD8+t细胞群。c使用scRNA-seq结果生成的T细胞中CD4和CD8A表达的密度散点图。x-轴,CD4基因表达;y-轴,CD8A基因表达;点由细胞密度着色。d一辆CD8+/CD4+比较患者之间的t细胞比率(n= 13)和健康供体(n= 6).数据以平均值SEM表示;双侧不成对曼恩-惠特尼检验。P值= 0.0092。e同样的t-SNE图在(b),CD4的颜色编码+和CD8+t细胞亚群。f显示个体患者和健康供体中T细胞亚群百分比的饼图;配色方案如在(e). g将效应记忆T细胞的百分比与患者(n= 13)和健康供体(n= 6).数据以平均值SEM表示;双侧不成对曼恩-惠特尼检验,P值= 0.0167。

为了对患者治疗前后进行系统比较,我们合并了所有个体和不同时间点的数据19(补充方法和结果)。sva包纠正了批次效应20如基于高熵的样品混合量化指标所示。我们通过CD4中特征基因的表达进一步验证了细胞注释和样品混合+和CD8+t细胞21(图。1b和补充图。1).CD4抗艾滋病药(Cluster of Differentiation 4)+和CD8+预期t细胞构成富集的CD3的大部分+t细胞群体,他们聚集在一起。我们观察到个体间CD4/CD8组成有很大程度的差异:CD8+接受阿仑珠单抗治疗前患者的亚群范围为32.6–87.5%,CD8普遍升高+T-LGLL患者的亚群(图。1c,d).然后,我们使用表型聚类验证了每个患者的主要T细胞亚群是可识别的11。我们通过聚类平均表达和先前分类的大量数据集的特征转录谱之间的全基因组相关性来注释聚类(GSE93777在GEO)22,并鉴定了幼稚、中枢记忆和效应记忆T细胞群(图。1e).使用规范标记的表达来确认和提炼注释(补充图。2).患者亚组的组成各不相同,效应记忆T细胞在患者中更为普遍(图。1f,g),与表型效应记忆T细胞的已知扩增一致23.

T-LGLL TCR曲目多样性的丧失

在流式细胞术和CDR3测序中使用TCRβ单克隆抗体已经测量了TCR克隆性4,24。我们首先研究了scTCR-seq在鉴定LGLL霸王龙的克隆性时的分辨率。在所有患者样本中,我们在27–89%(中位数61%)的细胞中检测到至少一条生产性α链,在79–98%(中位数95%)的细胞中检测到至少一条生产性β链,其中27–80%(中位数58%)的细胞只有一条生产性α链,60–95%(中位数87%)的细胞只有一条生产性β链。有6–73%(中位数为45%)的细胞具有成对的生产性αβ链,一些细胞具有多个TCRα和/或β链(补充表2).这些数据类似于先前基于TCR序列的单细胞结果7。目前所有的TCR测序方法都不太可能检测到α链7,部分是由于较低的表达崔凡克基因比可变区基因(补充图。3a).

这里,我们将“扩增克隆”定义为≥10个具有相同TCRα-和β-链的T细胞25。前三个扩增的TCR克隆包含高达70%的测序CD3+患者的t细胞群,但病例之间存在差异(图。2a).在当前的研究中,scTCR-seq显示出与流式细胞术和CDR3测序在相同情况下确定顶级克隆的结果一致,但提供了高得多的分辨率(图。2b).存在正相关(R= 0.503),匹配Jβ/Jα(定义见)www.imgt.org)并用流式细胞仪测定数值。通过绘制每个V和J基因匹配的细胞数,患者显示克隆扩增(图。2c和补充图。45)4。与健康供体的多克隆T细胞库不同,患者的结果图显示一个或几个特定的CDR3序列占优势,表明LGLL T细胞中CTL的预期克隆扩增。基尼指数衡量分配的平等程度26,27;对于TCR多样性,基尼指数在0到1之间,并且与T细胞克隆性正相关。患者样本的TCR基尼系数(0.340±0.217)明显高于健康供体样本(图。2d;0.091 0.043,P= 0.014,t-测试)。我们还计算了香农熵(H)指数,以评估每个样本的TCR库的多样性27。与T细胞多样性正相关的H指数在患者中显著低于健康供体(图。2e).这些结果表明,LGLL霸王龙的TCR种类明显较少。CDR3的异常大小分布和克隆大小的更大规模幂律分布也证明了TCR多样性的损失(图。2f–h和补充图。69).

图2:T-LGLL患者TCR多样性的丧失。
figure 2

a显示单个患者和健康供体中前3个克隆总数的频率的点图。点的大小与前3个克隆的频率成比例。右边的饼图显示了患者(顶部)和健康供体(底部)中前3个克隆(红色部分)总和的中等百分比。双边不成对t-测试。P值= 0.0008。b显示通过流式细胞术检测到的21 TRVB的频率的高度相关性的三维点图(x-轴)、scTCR-seq(y-轴)和免疫序列(z-轴),平均相关系数为0.503。c摩天大楼图显示健康供体1 (HD1)和代表性患者(UPN10和UPN13)的Vβ/Vα和匹配的Jβ/Jα。基尼指数(d)和香农指数(e)的TCR克隆性进行了比较n= 13)和健康供体(n= 7).数据以平均值SEM表示;双侧不成对曼恩-惠特尼检验。P值= 0.0167(d)和P值= 0.0047(e). f绘制了代表性HD1和患者UPN10的CDR3长度,在x-轴和频率(CDR3尺寸)y-轴(重叠曲线显示CD8+和CD4+分别为红色和蓝色的t细胞)。g克隆大小绘制在HD1和UPN10中,对数克隆大小绘制在x-轴和对数累积频率y-轴。h在所有患者中比较幂律拟合曲线的斜率值(n= 13)和健康供体(n= 7);所有个体的图见补充图。67。数据以平均值SEM表示;双侧不成对曼恩-惠特尼检验。P值= 0.0018。

T-LGLL患者中缺乏常见的TCRA和TCRB克隆型

克隆性T-LGLL扩增被假设来源于慢性抗原刺激,我们检测了可能暗示潜在共同抗原的CDR3同源性的证据。我们使用了circlize包(https://cran.r-project.org/web/packages/circlize)可视化受试者之间共享的TCR使用情况24,28,并观察到电路图中的连接在低水平的受试者之间是共享的,类似于健康供体(图。3a,b; P= 0.41,t-测试)。两个样品共享具有相同核苷酸CDR3序列的TCR克隆,如圆图中的弧线所示。患者中的优势克隆在少数其他患者中以低水平表达,但它们也存在于健康供体中(包括个体中前200、前500和前1000克隆;图。3c和补充图。1011).与三个独立的数据集相比6,24,29在我们的患者中,TCR的使用与优势序列重叠,在健康供体中也存在;显性TCR克隆仅在最近报道的20名LGLL霸王龙患者中以低水平共享(补充图。1213和补充数据2).总的来说,这些结果意味着CD8+t细胞克隆扩增是受试者特异性的,或对个体患者是“私有的”, TCR的使用不是疾病特异性的。这种在T-LGLL患者中缺乏共同TCR克隆型的现象以前已经被观察到5.

图3:在T-LGLL患者中缺乏常见的TCRA和TCRB克隆型。
figure 3

a显示了Circos图:圆圈中的片段代表产生重排TCR序列的单个细胞。黑线连接的克隆在个体间共享相同的CDR3序列。左边显示了六个健康供体(HD1-HD6)之间相同CDR3序列的共享;右侧患者(UPNs 1、8、12、13、14和15)和患者(UPNs 4、10、17、18、19和24)共享相同的CDR3序列。红色和蓝色曲线与克隆大小成比例。b连接患者中具有相同CDR3序列的细胞的弧线计数(n= 13)和健康供体(n= 7)进行成对比较,没有显著差异。数据以平均值SEM表示;双侧不成对曼恩-惠特尼检验。c热图显示了患者和健康供体的前200个TCR克隆中共享的CDR3序列。两者都有x表示“对象”: analysandy-轴列出了患者和健康供体的样本,相邻的网格显示了相同患者的成对样本(治疗前和治疗后)。显示了样品间共享的相同TCR克隆的计数。颜色方案,范围从深橙色到深蓝色,表示共享的TCR CDR3序列的数量,从高到低。

同源T-LGLL特异性CDR3及其对转录表型的影响

由于在LGLL霸王龙患者中缺乏共同的克隆型,我们对富集的cdr进行分组,以识别存在于许多不同样本中的TCR聚类组,这些聚类组可能被选择用于结合潜在的共同抗原。为了更全面地评估CDR3基序,对前500个组合的TCRB CDR3序列进行了详细的计算机分析。我们使用GLIPH(通过副表位热点对淋巴细胞相互作用进行分组)来识别“TCR特异性组”:不同TCR序列的群集,它们可能通过CDR3序列中的共有基序识别共同抗原30。我们鉴定了49个具有5个以上不同CDR序列的TCR特异性组(图。4b补充图。1415和补充表格3).最高TCR特异性组在t-SNE投影中占据了一个有限的区域(图。4a).与具有相似转录表型的给定克隆型(共享相同的TCR序列)的T细胞相似,与那些随机分组的TCR相比,表达不同TCR但在TCR特异性组内的T细胞倾向于具有更多的转录组相似性(t-SNE图中较短的距离)(图。4c; P < 0.0002, unpaired t-测试)。t-SNE图中细胞的成对距离(基于转录组)与TCR序列相异度正相关(Damerau-Levenshtein距离;补充图16a).这些结果表明克隆扩增的T细胞与转录表型高度相关。

图4: TCR的使用和活化阶段决定了T细胞的表型。
figure 4

a图3中同样的t-SNE曲线。1b用来自所有患者和健康供体的单个T细胞,通过GLIPH鉴定的TCR特异性组染色。b具有超过五个不同cdr的前八个TCR特异性组的序列和相应的网络日志。在每个面板中,右侧的饼图显示了该TCR特异性组在前5名患者(黑色数字)和所有其他患者中的百分比。在数字A中;在CRG序列之后,A表示包含在CRG中的克隆数,B表示该CRG在所有细胞中的频率。c将同一TCR特异性组内细胞的距离与t-SNE图中任何随机细胞的置换距离进行比较;双侧不成对曼恩-惠特尼检验。P值= 0.0188。d扩散图显示CD8的成分+所有患者和健康供体的t细胞表型变异。每个点代表一个CD8+t细胞。t细胞活化、TCR表达和所有其他细胞分别以红色、粉色和蓝色着色,维度1为开x-轴和尺寸2打开y-轴。扩散图显示了T细胞活化在第1维(左侧,红色)和TCR表达在第2维(右侧,粉红色)的动态变化。e曲线表明T细胞活化和TCR表达分别沿扩散图上显示的1维和2维的动态变化。x-轴,扩散图上的尺寸;y-轴,T细胞活化的估算表达(顶部,红色)和TCR表达(底部,粉红色)成分。红色和粉色实线代表5–95%的区间,用阴影区域表示;蓝线表示中等。fCD8扩散图+第1维和第2维上的t细胞,并通过克隆扩增着色(红色代表扩增的克隆)。在扩增的克隆中比在非扩增的克隆中观察到更高的活化(右边的小提琴图)。g基尼指数与T细胞活化呈正相关(左),但与TCR表达无关(右)。每个点代表一个样本。皮尔逊相关检验。

我们寻找受试者共有的聚合群(crg ),因此更有可能反映潜在共同抗原的选择。在单个CRG中,我们绘制了TCR占CRG大部分的前五名患者(仅在治疗前获得的样本中)的细胞百分比。具有最高细胞数的前八个crg富含效应记忆和CD45RO+CD8+集群(图4a和补充图。16b,c和17).在UPN15细胞中,from卡斯PGTNYGYTF序列占优势;在CRG-卡斯拉格特夫中有73%的细胞是由这五位患者贡献的,并且它们显示出TRBV5-6和TRBJ2-2的高使用率;在剩余的顶部crg中,来自5名患者的细胞贡献了最多的细胞数量,占个体crg的74-90%。从这些发现中,我们推断CD8+LGLL霸王龙体内的T细胞扩增可能是由一些患者身上的相似抗原驱动的,但不是大多数患者31。为了了解每个CRGs中克隆扩增T细胞的共同转录特征,我们比较了特定CRG中T细胞的基因表达与所有其他细胞的基因表达,并绘制了这49个TCR特异性组中CRG特异性最高的基因(补充图。18a和补充数据3),接着是基因本体(GO)术语富集每个CRGs中的差异表达基因。t细胞活化和免疫反应基因以及细胞周期基因在大多数crg中上调。我们推断,由于细胞周期和免疫反应基因的上调,扩增的克隆被激活,并可能具有获得性生长、存活和功能优势(补充图。18b和补充数据4).

在顶级的CRG中,在患者中而不是在健康供体中富集的前四个CRG是CRG-caspgtnygytf、CRG-CASIVGSYNEQFF、CRG-CASRAGETEAFF和CRG-CASSLVGGSYEQYF(补充图。19a).CRG-卡斯维格斯奈夫和CRG-卡斯拉格特夫组中的一些CDR3s出现在10倍供体3中大小大于10的克隆中(包括在10倍基因组学样品VDJdb数据集中,并且是CMV血清阳性)32。与我们队列中的其他患者相比,这些crg在巨细胞病毒血清阳性的T-LGLL患者中的比例过高。最近的一项研究30已经在具有HLA*0201的CMV血清阳性个体中鉴定了CDR3s的五个CMVpp65氨基酸基序(TGT、ATN、FQ、SSA和QTG)。在我们的样本中,HLA-A*0201,CMV+CDR3s在CMV的扩增克隆中更多地出现+科目比在CMV病例(费希尔检验;P= 0.033).这些结果增加了我们当前分析的有效性,并增加了慢性CMV抗原刺激是T细胞克隆扩增的潜在驱动力的假设33.

我们将T-LGLL患者的β链CDR3序列输入TCRmatch34,35以便鉴定表位和相关抗原。在来自T-LGLL患者的扩展TCR序列中,有四个来自常见病毒病原体的表位:EBV、CMV和甲型流感病毒(补充图。19b和补充数据5-1).我们使用TCRmatch(补充数据)专门检测了LGLL霸王龙患者中优势克隆(前10个克隆)的推定抗原5-2).然而,在这些非常顶级的克隆中,大多数TCR序列不能被定位到任何抗原的任何表位。此外,具有单克隆扩增的患者中的大多数顶级克隆不能被定位到TCRmatch中的任何表位。然而,我们的分析并不全面,因为与潜在的大量TCR相比,不可避免地受到参考数据库中受试者和表位数量较少的限制。此外,将我们的CDR3序列与第二个数据库VDJdb中的病毒特异性CDR3序列进行匹配32显示大多数CDR3s来源于CMV和其他常见病毒。患者和健康供体中CDR3组成(按病毒分组)的良好相关性表明克隆扩增不能用暴露于普通病毒来解释(补充图。20并在补充结果中详述)。

TCR的使用和激活状态有助于T细胞表型

我们的数据(图。4a)表明,至少部分地,TCR利用影响T细胞表型。使用来自所有个体和所有时间点的综合数据,我们使用扩散图11,12可视化T细胞表型变异,并强调与T细胞活化和T细胞终末分化相关的成分的表达,以便使用回归分析检查它们对T细胞表型的贡献11。我们观察到T细胞活化是第一个维度上最具信息性的组成部分,并且有一个连续的改变T细胞活化的模式(图。4d,e).其他组成部分,包括T细胞终末分化、促炎和溶细胞效应物途径,在第一维上与T细胞激活方向相同,这可能是由于每个途径中基因的适度重叠,但也可能来自相关功能基因的协调(补充图。21a–d).当用CD8中T细胞亚群标记基因的颜色表示时+T细胞,分化轨迹出现从幼稚T细胞到中枢和效应记忆T细胞(补充图。21e,f).通过相关性分析,22%的T细胞表型变异归因于TCR表达,TCR表达在扩散图的第2维显示持续增加(图。4e)8,12。总之,这些结果表明T细胞表型是由抗原TCR刺激和环境刺激共同作用的结果。在具有扩展和非扩展克隆的颜色编码的相同扩散图上,扩展克隆聚集在维度1的左侧,表明克隆扩展对T-LGLL中转录组的影响(图。4f).在患者和健康供体中,TCR多样性与T细胞活化呈正相关,但与TCR表达无关(图。第四代移动通信技术).总之,T-LGLL中CTL扩增与TCR多样性降低和T细胞活化增加相关。

LGLL霸王龙细胞存活和凋亡基因程序的失调

为了了解LGLL霸王龙中解除管制的基因程序,我们首先比较了接受阿仑单抗治疗前的患者和健康供体的基因表达,并利用基因集合富集分析来探索LGLL霸王龙中基因程序的整体变化3,36,37。患者中上调的基因高度富集于免疫反应和细胞存活的信号通路(标志性基因集包括干扰素反应、PI3K_AKT_MTOR和IL6_JAK_STAT3信号)和细胞增殖(有丝分裂纺锤体),而在T-LGLL中表达较少的基因富集于凋亡通路(wnt连环蛋白信号、MYC_targets和凋亡)(图)。5a和补充数据6).凋亡基因组的下调在CD8中特别明显+t细胞。这些结果与早期的出版物一致,表明了T-LGLL中免疫激活、细胞存活和细胞凋亡基因程序的不平衡2,3。然后我们利用基因本体论38研究LGLL霸王龙顶部差异表达基因的丰富功能术语。上调的基因在免疫反应和细胞活化方面高度富集(补充图。2223).我们的研究小组先前通过RT-qPCR测量了JAK-STAT途径中84个基因在患者中的表达,包括但不限于当前的患者队列,我们再次观察到这些基因在T-LGLL患者中的激活;scRNA-seq和qPCR的结果显示了良好的相关性(R= 0.31,P < 0.0001; Supplementary Fig. 24).细胞凋亡基因包括TNF, CASP10,以及异步传输模式下调(GO:0006915凋亡过程,GO:0008219细胞死亡和GO:0012501程序性细胞死亡),抗凋亡基因(凋亡基因, JAK2,以及BCL2L1)都上调了,虽然federation of american scientists 美国科学家联合会florida association of school librarians 佛罗里达学校图书管理员协会在患者中过度表达(图。5b).这些结果支持了先前提出的LGLL霸王龙细胞凋亡失调和存活通路组成性激活的机制3,23。我们使用字符串数据将最高差异表达基因映射到蛋白质相互作用网络39,后面是jActiveModulesTopo40,41为了识别生物学上有意义的基因子网络(图。5c).在这个子网络中,CD8A是最独特的中枢基因,指示细胞毒性T细胞和免疫反应的激活。

图5:LGLL霸王龙中失调的基因程序。
figure 5

a与健康供体相比,T-LGLL患者差异表达基因的基因集富集分析(GSEA)图。GESA基于Kolmogorov Smirnov测试。b显示T-LGLL患者中促凋亡和抗凋亡基因表达的箱线图(n= 13)与健康供体(n= 7).显示的是25–75%的响应范围(顶部和底部方框线)以及最小值和最大值(条形)。双边不成对t-测试。cT-LGLL患者中参与免疫反应和细胞存活的上调基因和参与凋亡的下调基因的网络。d显示在T-LGLL氏精确检验中,与非扩增克隆相比,扩增克隆中富含上调基因的热门GO术语的条形图。e与健康供体相比,T-LGLL患者的T细胞衰竭基因的GSEA图。患者的t细胞始终表达较高水平的衰竭标记,基因列表来自两个以前的出版物42,43。GESA是基于Kolmogorov Smirnov测试。f患者的t细胞并不总是表达较高水平的共刺激因子或较低水平的共抑制因子。

为了理解LGLL霸王龙中扩增克隆的生物学,我们在个体中以成对的方式比较了扩增克隆与个体中剩余细胞的基因表达,并且通过Genomatix将顶部差异表达的基因用于途径分析36。扩增克隆中较高表达的基因在免疫反应和细胞活化方面显著富集(图。5d),并且凋亡途径的失调是明显的,因为凋亡级联中的几个关键基因(轮船上交货(free on steamer), BCL2,以及BIRC3)在扩大的无性系中代表不足。总之,扩增的克隆是高度活化的,并且可能获得了生长、存活和功能优势,部分是由于细胞凋亡的失调。扩增克隆的表达特征提示了新疗法的目标。

我们特别检测了T-LGLL样本中T细胞衰竭基因的表达和T细胞共抑制受体的表达,因为这些途径在癌症中经常是异常的。我们使用两种不同的参考基因列表,在LGLL霸王龙中持续观察到增强的T细胞衰竭42,43,但T细胞中的共抑制和共刺激受体的变化不定(图。5e,f)2,9,44.

免疫抑制治疗调节LGLL霸王龙的克隆能力和基因表达

通过比较单克隆抗体阿仑单抗治疗前后(3个月和6个月)的T细胞亚群,我们观察到CD8优势或效应T细胞占优势的T细胞扩增没有减弱。阿仑单抗没有显著改变T细胞亚群比例和炎症细胞因子;CD45RO的比例+CD8+t细胞增加(补充图。25).我们检测了阿仑珠单抗治疗后T细胞克隆能力的变化。在治疗前后,许多重排的CDR3连接主要在受试者中共享,但在受试者之间不共享。较大的克隆似乎更有可能在处理后继续存在(图。6a和补充图。26).免疫抑制没有削弱TCR克隆性;与治疗前相比,治疗进一步扭曲了TCR多样性,表现为较低的H多样性指数。6b).

图6:免疫抑制治疗调节LGLL霸王龙的克隆能力和基因表达。
figure 6

a显示的是circos图,其中圆圈中的片段代表在患者之间或患者两次就诊之间产生重排TCR序列的单个细胞。黑线表示连接共享相同CDR3序列的细胞的弧线。左边和右边的图分别显示了UPNs 1、8和12以及UPNs 13、14和15之间相同CDR3序列的共享。红色和蓝色曲线分别与处理前后样品中的克隆大小成比例。b比较了患者(治疗前和治疗后)和健康供体TCR克隆性的基尼指数和香农指数。基尼系数仍然很高(0.547±0.215,P < 0.001) and Shannon index significantly lower (5.21 ± 2.25, P= 0.002)。治疗前后患者样本之间的双边Wilcoxon检验(n= 12);患者之间双边不成对的Mann-Whitney(n= 13)和健康供体(n= 7);P数值如图所示。c治疗后LGLL霸王龙患者中jActiveModulesTopo发现的一个下调基因模块,包括STAT3;表达水平的动态变化STAT3和凋亡基因(GO: 006915)在T-LGLL患者治疗前后(n= 12).显示的是25–75%的响应范围(顶部和底部方框线)以及最小值和最大值(条形)。P图中显示了双侧配对t检验的值。d显示的是不同时间点的治疗前和治疗后样品中前十位TCR克隆型的百分比。黑线表示预处理的前十个克隆;蓝线表示处理后的前十个克隆,它们不在处理前的前十个中。e阿仑珠单抗后增加、减少和稳定克隆的免疫激活基因和细胞周期基因的表达变化。f左,阿仑珠单抗治疗后有反应和无反应的凋亡基因表达变化(平均)。x-轴,两个时间点,治疗前和治疗后;y-轴,调节凋亡基因的表达水平,以将应答者和非应答者的凋亡基因表达的治疗前值设置为零。右,治疗前有反应者(Resp)和无反应者(Non-resp)的凋亡基因表达水平;双边不成对t-测试;P < 0.0001 [as software generated P < 0.0001, exact P值不可用]。

我们通过基因表达的成对比较来探索阿仑珠单抗后转录组的变化。在全球范围内,我们观察到一些免疫基因表达下降,包括TNF, 核因子, 喀斯特地貌, IL2STAT5,而真菌学和细胞周期(G2M检查点,DNA修复和有丝分裂纺锤体)基因上调(补充图。27a).然而,顶级差异表达基因的途径分析显示许多免疫途径上调(补充图。27b). STAT3是治疗后显著下调的基因之一,亚网络中的枢纽基因(由jActiveModulesTopo鉴定)是在阿仑珠单抗治疗后下调的基因。它的几个邻近基因,包括TNFRSF10A,CDKN1B,CXCR4,IL6ST,IL2RA,以及福克斯1(都参与细胞凋亡)也下调,但细胞凋亡基因(GO: 006915)的平均表达在治疗后上调(图。6c).参与T细胞分化和蛋白酶体活性的基因在治疗后下调。除了抗体依赖性细胞毒性和淋巴细胞耗竭,阿仑珠单抗治疗似乎调节STAT3途径并抑制T细胞分化;所有这些都可能有助于限制残留淋巴细胞的扩张和活化。

为了进一步表征阿仑珠单抗后的克隆动力学,我们根据克隆的比例变化将T细胞库模式的动力学大致分为三组:增加(克隆大小增加> 20%)、不变(克隆大小保持20%)和减少(克隆大小减少> 20%)。在12名有配对数据的LGLL霸王龙患者中,我们观察到26个克隆增加(大小变化范围11-3104),7个克隆不变,24个克隆减少(大小变化范围31-4950)。在有反应和无反应的情况下,大多数扩增的克隆在治疗后仍然存在。单个患者中顶级克隆的动态变化(图。6d和补充图。2832)在处理后显示四种一般模式:(I)顶端克隆增加或减少,出现新的优势克隆(UPNs 1、13和17);(II)顶级克隆被新的优势克隆(UPNs 8、14、19和24)取代;(III)优势克隆的细微变化(UPNs 4和10);(IV)优势克隆进一步扩大(UPNs 12、15和18)。这些模式都与治疗反应无关1.

为了理解处理如何改变CTL克隆的行为,我们以成对的方式比较了相同克隆处理前后的基因表达,克隆遵循三种动态模式。随着治疗的进行,增加的克隆显示出富含免疫反应和细胞激活(IFNγ、KRAS、MTOCR、IFNα和JAK/STAT3途径)的基因上调,但是在未改变和减少的克隆中,涉及免疫反应、淋巴细胞激活和细胞代谢(翻译起始、蛋白质定位、呼吸电子传递和细胞周期)的基因下调(图。6e和补充图。3334).用免疫抑制疗法,尺寸增加的克隆保留了活跃的免疫功能和细胞代谢,而在稳定和减少的克隆中具有这些功能的基因被抑制23。简而言之,配对的scRNA-seq和scTCR-seq显示阿仑珠单抗调节T-LGLL中的T细胞克隆性和全局转录组标记。考虑到治疗后T细胞亚群的微小变化和TCR克隆的广泛变化,我们推断单个细胞亚群的转录组变化反映了T-LGLL的发病机制特征。

接受阿仑珠单抗治疗后,T-LGLL患者血浆细胞因子的增加与治疗前水平相似(补充图。3536).T细胞亚群和TCR克隆性的变化在应答者和非应答者中也没有差异。我们在动态基因表达随治疗的变化中寻找对阿仑珠单抗反应的鉴别器。我们以成对的方式分别比较了治疗前后有反应者和无反应者的基因表达,观察到有反应者的细胞凋亡基因比无反应者增加更显著(图。6f,左)。接下来,为了确定我们队列中对阿仑珠单抗应答的预测因子,比较了基线时应答者和无应答者的基因表达。参与免疫应答和细胞激活的基因(KRAS、IL6_JAK_STAT3和TP53途径)在应答者中高度表达。细胞凋亡中基因的表达(GO: 0006915和REACTOM _ 5357801图。6f,对)。较少偏斜的活化诱导的细胞死亡可能预测对免疫抑制治疗的反应,T细胞的凋亡是治疗成功的一个因素。阿仑珠单抗的疗效似乎是凋亡基因表达增加和随之而来的克隆扩增抑制的结果。

讨论

我们利用单细胞分辨率的偶联T细胞转录组和TCR谱分析来表征在2期临床研究中接受阿仑单抗治疗的T-LGLL患者的T细胞克隆扩增和基因表达。我们的结果证实了T细胞的克隆性扩增和T-LGLL缺乏共同的TCR克隆型,具有来自单细胞的成对的α和β链信息。我们定义了扩增的克隆(超过10个具有相同TCR克隆型的T细胞),这些克隆通常在大量样本中稀释,并确定了几个在T-LGLL患者中更普遍的CDR3序列的潜在共同聚集群,但没有明显的共同抗原,至少使用目前可用的数据库。LGLL霸王龙体内的TCR库遵循幂律分布,TCR的使用和活化状态对T细胞表型有联合作用。我们注意到患者中缺乏一个共同的克隆型,因为在一些病例中占优势的克隆在其他病例中仅以低水平存在,并且在健康对照中也发现了相同的克隆型。我们证实了LGLL霸王龙细胞存活和凋亡基因程序的失调。我们定义了与治疗反应相关的四种克隆动力学模式。阿留申单抗没有减弱T细胞的克隆性扩增,但增加了这些细胞的凋亡。免疫激活在治疗后持续存在,但基线表达和凋亡基因失调程度与治疗反应相关,与克隆动态模式无关。

一种(未知的)起始抗原被假设为LGLL霸王龙的病因2,但是我们和其他人没有在CD8中观察到共有的克隆型+T-LGLL,甚至在大型患者队列和HLA匹配的个体中5。在GLIPH中,一些常见的CDR3会聚群被少数患者共享。由于当前参考数据库的限制,与普通扩展CDR3聚类相对应的潜在抗原的插补并不成功。大多数顶级crg具有共同的转录组特征,特别是上调的免疫激活和细胞周期;在阿仑珠单抗后增加的克隆中也观察到了这些特征,这与单克隆抗体治疗诱导的应激环境中扩增克隆的推定存活和功能优势一致。

alemtuzumab在T-LGLL的作用机制仍不确定。血液学反应伴随着总T细胞数量的减少,但持续存在异常克隆和高细胞因子水平1。LGLL霸王龙的血细胞减少可能是由于造血细胞破坏的细胞介导而不是体液介导,阿仑珠单抗可能通过减少而不是消除致病克隆而起作用。事实上,我们和其他人已经观察到持续的致病性T细胞克隆,尽管有有效的治疗;例如,在一项研究中,克隆扩增的逆转仅在治疗后几年发生24。治疗后更偏斜的TCR多样性最初是令人惊讶的。然而,T细胞库似乎是动态的;克隆优势度的波动,根据CDR3序列估算,存在于大约三分之一的患者中24。治疗后克隆能力的增加也可以解释为克隆扩增没有减弱,特别是由于scTCR-seq的高分辨率。显然,降低的克隆多样性可能不需要进行性克隆扩增。广泛反应性单克隆抗体可能减少大小克隆,如果致病性LGL克隆有存活优势,T细胞减少可能不成比例。事实上,我们的数据暗示了扩大的克隆显示出免疫激活模式和增殖遗传程序。

我们观察到存活信号通路中多个基因的激活和LGLL霸王龙细胞凋亡的整体失调,这与已发表的研究结果一致2,3在这个生存网络的中心STAT3。STAT3在抑制细胞凋亡中具有关键功能,抑制STAT3信号传导诱导细胞凋亡并降低生存素表达45。阿仑单抗治疗减少STAT3表达,增加细胞凋亡,抑制T细胞分化。在免疫介导疾病的临床试验中,抑制JAK/STAT3途径是有效的1,46。除了抗体依赖性细胞毒性外,阿仑珠单抗治疗后的淋巴细胞减少症可能归因于淋巴细胞分化抑制和淋巴细胞存活抑制。在基因表达的离散变化中,治疗后有反应者的凋亡基因表达增加比无反应者更明显,有反应者的凋亡基因表达水平在基线时更高。凋亡信号通路的激活可能是阿仑珠单抗有效的合理机制,减缓但不停止CTL增殖。

我们的结果和他们对数据的解释有局限性。首先,我们队列的临床谱和样本量必然是有限的,考虑到患者的稀有性、招募前的预处理、T-LGLL广泛的临床异质性(STAT3突变和HLA背景)和实验费用。第二,关于TCRs的共同表位和潜在抗原的结论受到现有数据库的限制。第三,MYC在细胞增殖和凋亡中的作用是上下文相关的。我们认为MYC在T-LGLL中是促凋亡的,但是它的功能在体外可以更好的评估。阿仑珠单抗治疗如何改变STAT3信号的确切方式也可以在组织培养中寻找。第四,我们的分析完全基于T细胞区室,排除了其他细胞类型。在未来,如果可行的话,更多的单个细胞的工作在更大的多种细胞类型的队列中进行将是可取的。

赫尔辛基小组利用LGLL霸王龙患者单细胞的高通量转录组和TCR谱获得了一致和互补的结果,并出现在一篇配套文章中47。这两项工作都补充了以前的研究和T细胞克隆扩增的高级模型,它们应该提供一个全面的克隆和转录组数据库,有助于理解T-LGLL和其他免疫介导的疾病的细胞和分子动力学。


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