T-LGLL患者T细胞的scRNA-seq显示CD8的扩增 + 效应T细胞 为了描述T-LGLL患者T细胞的表型、功能状态和克隆能力，我们构建了一个包含约500，000 CD3的图谱 + 13例患者的t细胞(男/女，7/6；中位年龄51岁，范围26-85 ),其血液样本在阿仑珠单抗治疗3-6个月前后采集，并来自7名匹配的健康对照者捐献的血液(补充表 1 ).我们的研究用图表表示在图中。 1a 。补充数据中显示了排序指标 1 .
图1:T-LGLL患者的T细胞景观。 a 实验研究设计方案。 b 所有患者和健康供体中T细胞的单细胞基因表达的T分布随机邻近嵌入(t-SNE)图，用CD4着色 + 和CD8 + t细胞群。 c 使用scRNA-seq结果生成的T细胞中CD4和CD8A表达的密度散点图。 x -轴，CD4基因表达； y -轴，CD8A基因表达；点由细胞密度着色。 d 一辆CD8 + /CD4 + 比较患者之间的t细胞比率( n = 13)和健康供体( n = 6).数据以平均值SEM表示；双侧不成对曼恩-惠特尼检验。 P 值= 0.0092。 e 同样的t-SNE图在( b )，CD4的颜色编码 + 和CD8 + t细胞亚群。 f 显示个体患者和健康供体中T细胞亚群百分比的饼图；配色方案如在(e ). g 将效应记忆T细胞的百分比与患者( n = 13)和健康供体( n = 6).数据以平均值SEM表示；双侧不成对曼恩-惠特尼检验， P 值= 0.0167。
为了对患者治疗前后进行系统比较，我们合并了所有个体和不同时间点的数据19 (补充方法和结果)。sva包纠正了批次效应 20 如基于高熵的样品混合量化指标所示。我们通过CD4中特征基因的表达进一步验证了细胞注释和样品混合 + 和CD8 + t细胞 21 (图。 1b 和补充图。 1 ).CD4抗艾滋病药（Cluster of Differentiation 4） + 和CD8 + 预期t细胞构成富集的CD3的大部分 + t细胞群体，他们聚集在一起。我们观察到个体间CD4/CD8组成有很大程度的差异:CD8+ 接受阿仑珠单抗治疗前患者的亚群范围为32.6–87.5%，CD8普遍升高 + T-LGLL患者的亚群(图。 1c，d ).然后，我们使用表型聚类验证了每个患者的主要T细胞亚群是可识别的 11 。我们通过聚类平均表达和先前分类的大量数据集的特征转录谱之间的全基因组相关性来注释聚类( GSE93777 在GEO) 22 ，并鉴定了幼稚、中枢记忆和效应记忆T细胞群(图。 1e ).使用规范标记的表达来确认和提炼注释(补充图。 2 ).患者亚组的组成各不相同，效应记忆T细胞在患者中更为普遍(图。 1f，g )，与表型效应记忆T细胞的已知扩增一致 23
T-LGLL TCR曲目多样性的丧失 在流式细胞术和CDR3测序中使用TCRβ单克隆抗体已经测量了TCR克隆性 4 ,24 。我们首先研究了scTCR-seq在鉴定LGLL霸王龙的克隆性时的分辨率。在所有患者样本中，我们在27–89%(中位数61%)的细胞中检测到至少一条生产性α链，在79–98%(中位数95%)的细胞中检测到至少一条生产性β链，其中27–80%(中位数58%)的细胞只有一条生产性α链，60–95%(中位数87%)的细胞只有一条生产性β链。有6–73%(中位数为45%)的细胞具有成对的生产性αβ链，一些细胞具有多个TCRα和/或β链(补充表 2 ).这些数据类似于先前基于TCR序列的单细胞结果 7 。目前所有的TCR测序方法都不太可能检测到α链 7 ，部分是由于较低的表达 崔凡克 基因比 可变区 基因(补充图。 3a
这里，我们将“扩增克隆”定义为≥10个具有相同TCRα-和β-链的T细胞 25 。前三个扩增的TCR克隆包含高达70%的测序CD3 + 患者的t细胞群，但病例之间存在差异(图。 2a ).在当前的研究中，scTCR-seq显示出与流式细胞术和CDR3测序在相同情况下确定顶级克隆的结果一致，但提供了高得多的分辨率(图。 2b ).存在正相关( R = 0.503)，匹配Jβ/Jα(定义见) www.imgt.org )并用流式细胞仪测定数值。通过绘制每个V和J基因匹配的细胞数，患者显示克隆扩增(图。 2c 和补充图。 4 和 5 )4 。与健康供体的多克隆T细胞库不同，患者的结果图显示一个或几个特定的CDR3序列占优势，表明LGLL T细胞中CTL的预期克隆扩增。基尼指数衡量分配的平等程度 26 ,27 2d ；0.091 0.043, P = 0.014, t -测试)。我们还计算了香农熵(H)指数，以评估每个样本的TCR库的多样性27 2e 2f–h 和补充图。 6 –9 ).
图2:T-LGLL患者TCR多样性的丧失。 a 显示单个患者和健康供体中前3个克隆总数的频率的点图。点的大小与前3个克隆的频率成比例。右边的饼图显示了患者(顶部)和健康供体(底部)中前3个克隆(红色部分)总和的中等百分比。双边不成对t -测试。 P 值= 0.0008。 b 显示通过流式细胞术检测到的21 TRVB的频率的高度相关性的三维点图( x -轴)、scTCR-seq( y -轴)和免疫序列( z -轴)，平均相关系数为0.503。c 摩天大楼图显示健康供体1 (HD1)和代表性患者(UPN10和UPN13)的Vβ/Vα和匹配的Jβ/Jα。基尼指数( d )和香农指数( e )的TCR克隆性进行了比较 n = 13)和健康供体( n = 7).数据以平均值SEM表示；双侧不成对曼恩-惠特尼检验。 P 值= 0.0167( d )和 P 值= 0.0047( e ). f 绘制了代表性HD1和患者UPN10的CDR3长度，在 x -轴和频率(CDR3尺寸) y -轴(重叠曲线显示CD8 + 和CD4 + 分别为红色和蓝色的t细胞)。 g 克隆大小绘制在HD1和UPN10中，对数克隆大小绘制在 x -轴和对数累积频率 y -轴。 h 在所有患者中比较幂律拟合曲线的斜率值( n = 13)和健康供体( n = 7);所有个体的图见补充图。6 和 7 。数据以平均值SEM表示；双侧不成对曼恩-惠特尼检验。 P 值= 0.0018。
T-LGLL患者中缺乏常见的TCRA和TCRB克隆型 克隆性T-LGLL扩增被假设来源于慢性抗原刺激，我们检测了可能暗示潜在共同抗原的CDR3同源性的证据。我们使用了circlize包( https://cran.r-project.org/web/packages/circlize )可视化受试者之间共享的TCR使用情况 24 ,28 ，并观察到电路图中的连接在低水平的受试者之间是共享的，类似于健康供体(图。 3a，b P = 0.41, t -测试)。两个样品共享具有相同核苷酸CDR3序列的TCR克隆，如圆图中的弧线所示。患者中的优势克隆在少数其他患者中以低水平表达，但它们也存在于健康供体中(包括个体中前200、前500和前1000克隆；图。3c 和补充图。 10 和 11 ).与三个独立的数据集相比 6 ,24 ,29 在我们的患者中，TCR的使用与优势序列重叠，在健康供体中也存在；显性TCR克隆仅在最近报道的20名LGLL霸王龙患者中以低水平共享(补充图。 12 和 13 和补充数据 2 ).总的来说，这些结果意味着CD8 + t细胞克隆扩增是受试者特异性的，或对个体患者是“私有的”, TCR的使用不是疾病特异性的。这种在T-LGLL患者中缺乏共同TCR克隆型的现象以前已经被观察到5
图3:在T-LGLL患者中缺乏常见的TCRA和TCRB克隆型。 a 显示了Circos图:圆圈中的片段代表产生重排TCR序列的单个细胞。黑线连接的克隆在个体间共享相同的CDR3序列。左边显示了六个健康供体(HD1-HD6)之间相同CDR3序列的共享；右侧患者(UPNs 1、8、12、13、14和15)和患者(UPNs 4、10、17、18、19和24)共享相同的CDR3序列。红色和蓝色曲线与克隆大小成比例。b 连接患者中具有相同CDR3序列的细胞的弧线计数( n = 13)和健康供体( n = 7)进行成对比较，没有显著差异。数据以平均值SEM表示；双侧不成对曼恩-惠特尼检验。 c 热图显示了患者和健康供体的前200个TCR克隆中共享的CDR3序列。两者都有 x 表示“对象”: analysand y -轴列出了患者和健康供体的样本，相邻的网格显示了相同患者的成对样本(治疗前和治疗后)。显示了样品间共享的相同TCR克隆的计数。颜色方案，范围从深橙色到深蓝色，表示共享的TCR CDR3序列的数量，从高到低。
同源T-LGLL特异性CDR3及其对转录表型的影响 由于在LGLL霸王龙患者中缺乏共同的克隆型，我们对富集的cdr进行分组，以识别存在于许多不同样本中的TCR聚类组，这些聚类组可能被选择用于结合潜在的共同抗原。为了更全面地评估CDR3基序，对前500个组合的TCRB CDR3序列进行了详细的计算机分析。我们使用GLIPH(通过副表位热点对淋巴细胞相互作用进行分组)来识别“TCR特异性组”:不同TCR序列的群集，它们可能通过CDR3序列中的共有基序识别共同抗原 30 。我们鉴定了49个具有5个以上不同CDR序列的TCR特异性组(图。 4b 补充图。 14 和 15 和补充表格 3 ).最高TCR特异性组在t-SNE投影中占据了一个有限的区域(图。 4a ).与具有相似转录表型的给定克隆型(共享相同的TCR序列)的T细胞相似，与那些随机分组的TCR相比，表达不同TCR但在TCR特异性组内的T细胞倾向于具有更多的转录组相似性(t-SNE图中较短的距离)(图。 4c P < 0.0002, unpaired t -测试)。t-SNE图中细胞的成对距离(基于转录组)与TCR序列相异度正相关(Damerau-Levenshtein距离；补充图 16a ).这些结果表明克隆扩增的T细胞与转录表型高度相关。
图4: TCR的使用和活化阶段决定了T细胞的表型。 a 图3中同样的t-SNE曲线。 1b 用来自所有患者和健康供体的单个T细胞，通过GLIPH鉴定的TCR特异性组染色。 b 具有超过五个不同cdr的前八个TCR特异性组的序列和相应的网络日志。在每个面板中，右侧的饼图显示了该TCR特异性组在前5名患者(黑色数字)和所有其他患者中的百分比。在数字A中；在CRG序列之后，A表示包含在CRG中的克隆数，B表示该CRG在所有细胞中的频率。 c 将同一TCR特异性组内细胞的距离与t-SNE图中任何随机细胞的置换距离进行比较；双侧不成对曼恩-惠特尼检验。 P 值= 0.0188。 d 扩散图显示CD8的成分 + 所有患者和健康供体的t细胞表型变异。每个点代表一个CD8 + t细胞。t细胞活化、TCR表达和所有其他细胞分别以红色、粉色和蓝色着色，维度1为开 x -轴和尺寸2打开 y -轴。扩散图显示了T细胞活化在第1维(左侧，红色)和TCR表达在第2维(右侧，粉红色)的动态变化。 e 曲线表明T细胞活化和TCR表达分别沿扩散图上显示的1维和2维的动态变化。 x -轴，扩散图上的尺寸； y -轴，T细胞活化的估算表达(顶部，红色)和TCR表达(底部，粉红色)成分。红色和粉色实线代表5–95%的区间，用阴影区域表示；蓝线表示中等。 f CD8扩散图 + 第1维和第2维上的t细胞，并通过克隆扩增着色(红色代表扩增的克隆)。在扩增的克隆中比在非扩增的克隆中观察到更高的活化(右边的小提琴图)。 g 基尼指数与T细胞活化呈正相关(左)，但与TCR表达无关(右)。每个点代表一个样本。皮尔逊相关检验。
我们寻找受试者共有的聚合群(crg ),因此更有可能反映潜在共同抗原的选择。在单个CRG中，我们绘制了TCR占CRG大部分的前五名患者(仅在治疗前获得的样本中)的细胞百分比。具有最高细胞数的前八个crg富含效应记忆和CD45RO+ CD8 + 集群(图 4a 和补充图。 16b ，c和 17 ).在UPN15细胞中，from卡斯PGTNYGYTF序列占优势；在CRG-卡斯拉格特夫中有73%的细胞是由这五位患者贡献的，并且它们显示出TRBV5-6和TRBJ2-2的高使用率；在剩余的顶部crg中，来自5名患者的细胞贡献了最多的细胞数量，占个体crg的74-90%。从这些发现中，我们推断CD8+ LGLL霸王龙体内的T细胞扩增可能是由一些患者身上的相似抗原驱动的，但不是大多数患者 31 。为了了解每个CRGs中克隆扩增T细胞的共同转录特征，我们比较了特定CRG中T细胞的基因表达与所有其他细胞的基因表达，并绘制了这49个TCR特异性组中CRG特异性最高的基因(补充图。 18a 和补充数据 3 )，接着是基因本体(GO)术语富集每个CRGs中的差异表达基因。t细胞活化和免疫反应基因以及细胞周期基因在大多数crg中上调。我们推断，由于细胞周期和免疫反应基因的上调，扩增的克隆被激活，并可能具有获得性生长、存活和功能优势(补充图。 18b 和补充数据 4 ).
在顶级的CRG中，在患者中而不是在健康供体中富集的前四个CRG是CRG-caspgtnygytf、CRG-CASIVGSYNEQFF、CRG-CASRAGETEAFF和CRG-CASSLVGGSYEQYF(补充图。 19a ).CRG-卡斯维格斯奈夫和CRG-卡斯拉格特夫组中的一些CDR3s出现在10倍供体3中大小大于10的克隆中(包括在10倍基因组学样品VDJdb数据集中，并且是CMV血清阳性) 32 。与我们队列中的其他患者相比，这些crg在巨细胞病毒血清阳性的T-LGLL患者中的比例过高。最近的一项研究 30 + CDR3s在CMV的扩增克隆中更多地出现 + 科目比在CMV − 病例(费希尔检验； P = 0.033).这些结果增加了我们当前分析的有效性，并增加了慢性CMV抗原刺激是T细胞克隆扩增的潜在驱动力的假设 33
我们将T-LGLL患者的β链CDR3序列输入TCRmatch 34 ,35 以便鉴定表位和相关抗原。在来自T-LGLL患者的扩展TCR序列中，有四个来自常见病毒病原体的表位:EBV、CMV和甲型流感病毒(补充图。 19b 和补充数据 5 -1 ).我们使用TCRmatch(补充数据)专门检测了LGLL霸王龙患者中优势克隆(前10个克隆)的推定抗原 5 -2 ).然而，在这些非常顶级的克隆中，大多数TCR序列不能被定位到任何抗原的任何表位。此外，具有单克隆扩增的患者中的大多数顶级克隆不能被定位到TCRmatch中的任何表位。然而，我们的分析并不全面，因为与潜在的大量TCR相比，不可避免地受到参考数据库中受试者和表位数量较少的限制。此外，将我们的CDR3序列与第二个数据库VDJdb中的病毒特异性CDR3序列进行匹配 32 显示大多数CDR3s来源于CMV和其他常见病毒。患者和健康供体中CDR3组成(按病毒分组)的良好相关性表明克隆扩增不能用暴露于普通病毒来解释(补充图。 20 并在补充结果中详述)。
TCR的使用和激活状态有助于T细胞表型 我们的数据(图。 4a 11 ,12 可视化T细胞表型变异，并强调与T细胞活化和T细胞终末分化相关的成分的表达，以便使用回归分析检查它们对T细胞表型的贡献 11 。我们观察到T细胞活化是第一个维度上最具信息性的组成部分，并且有一个连续的改变T细胞活化的模式(图。 4d，e ).其他组成部分，包括T细胞终末分化、促炎和溶细胞效应物途径，在第一维上与T细胞激活方向相同，这可能是由于每个途径中基因的适度重叠，但也可能来自相关功能基因的协调(补充图。 21a–d ).当用CD8中T细胞亚群标记基因的颜色表示时 + T细胞，分化轨迹出现从幼稚T细胞到中枢和效应记忆T细胞(补充图。 21e，f ).通过相关性分析，22%的T细胞表型变异归因于TCR表达，TCR表达在扩散图的第2维显示持续增加(图。 4e 8 ,12 。总之，这些结果表明T细胞表型是由抗原TCR刺激和环境刺激共同作用的结果。在具有扩展和非扩展克隆的颜色编码的相同扩散图上，扩展克隆聚集在维度1的左侧，表明克隆扩展对T-LGLL中转录组的影响(图。 4f 第四代移动通信技术
LGLL霸王龙细胞存活和凋亡基因程序的失调 为了了解LGLL霸王龙中解除管制的基因程序，我们首先比较了接受阿仑单抗治疗前的患者和健康供体的基因表达，并利用基因集合富集分析来探索LGLL霸王龙中基因程序的整体变化 3 ,36 ,37 。患者中上调的基因高度富集于免疫反应和细胞存活的信号通路(标志性基因集包括干扰素反应、PI3K_AKT_MTOR和IL6_JAK_STAT3信号)和细胞增殖(有丝分裂纺锤体)，而在T-LGLL中表达较少的基因富集于凋亡通路(wnt连环蛋白信号、MYC_targets和凋亡)(图)。 5a 和补充数据 6 ).凋亡基因组的下调在CD8中特别明显 + t细胞。这些结果与早期的出版物一致，表明了T-LGLL中免疫激活、细胞存活和细胞凋亡基因程序的不平衡 2 ,3 。然后我们利用基因本体论 38 研究LGLL霸王龙顶部差异表达基因的丰富功能术语。上调的基因在免疫反应和细胞活化方面高度富集(补充图。 22 和 23 ).我们的研究小组先前通过RT-qPCR测量了JAK-STAT途径中84个基因在患者中的表达，包括但不限于当前的患者队列，我们再次观察到这些基因在T-LGLL患者中的激活；scRNA-seq和qPCR的结果显示了良好的相关性( R = 0.31, P < 0.0001; Supplementary Fig. 24 ).细胞凋亡基因包括 TNF , CASP10 ，以及 异步传输模式 下调(GO:0006915凋亡过程，GO:0008219细胞死亡和GO:0012501程序性细胞死亡)，抗凋亡基因( 凋亡基因 , JAK2 ，以及 BCL2L1 )都上调了，虽然 federation of american scientists 美国科学家联合会 和 florida association of school librarians 佛罗里达学校图书管理员协会 在患者中过度表达(图。 5b ).这些结果支持了先前提出的LGLL霸王龙细胞凋亡失调和存活通路组成性激活的机制 3 ,23 。我们使用字符串数据将最高差异表达基因映射到蛋白质相互作用网络 39 ，后面是jActiveModulesTopo 40 ,41 为了识别生物学上有意义的基因子网络(图。 5c ).在这个子网络中，CD8A是最独特的中枢基因，指示细胞毒性T细胞和免疫反应的激活。
图5:LGLL霸王龙中失调的基因程序。 a 与健康供体相比，T-LGLL患者差异表达基因的基因集富集分析(GSEA)图。GESA基于Kolmogorov Smirnov测试。 b 显示T-LGLL患者中促凋亡和抗凋亡基因表达的箱线图( n = 13)与健康供体( n = 7).显示的是25–75%的响应范围(顶部和底部方框线)以及最小值和最大值(条形)。双边不成对 t -测试。 c T-LGLL患者中参与免疫反应和细胞存活的上调基因和参与凋亡的下调基因的网络。 d 显示在T-LGLL氏精确检验中，与非扩增克隆相比，扩增克隆中富含上调基因的热门GO术语的条形图。 e 与健康供体相比，T-LGLL患者的T细胞衰竭基因的GSEA图。患者的t细胞始终表达较高水平的衰竭标记，基因列表来自两个以前的出版物 42 ,43 。GESA是基于Kolmogorov Smirnov测试。 f 患者的t细胞并不总是表达较高水平的共刺激因子或较低水平的共抑制因子。
为了理解LGLL霸王龙中扩增克隆的生物学，我们在个体中以成对的方式比较了扩增克隆与个体中剩余细胞的基因表达，并且通过Genomatix将顶部差异表达的基因用于途径分析36 。扩增克隆中较高表达的基因在免疫反应和细胞活化方面显著富集(图。 5d )，并且凋亡途径的失调是明显的，因为凋亡级联中的几个关键基因( 轮船上交货(free on steamer) , BCL2 ，以及 BIRC3 )在扩大的无性系中代表不足。总之，扩增的克隆是高度活化的，并且可能获得了生长、存活和功能优势，部分是由于细胞凋亡的失调。扩增克隆的表达特征提示了新疗法的目标。
我们特别检测了T-LGLL样本中T细胞衰竭基因的表达和T细胞共抑制受体的表达，因为这些途径在癌症中经常是异常的。我们使用两种不同的参考基因列表，在LGLL霸王龙中持续观察到增强的T细胞衰竭 42 ,43 ，但T细胞中的共抑制和共刺激受体的变化不定(图。 5e，f 2 ,9 ,44
免疫抑制治疗调节LGLL霸王龙的克隆能力和基因表达 通过比较单克隆抗体阿仑单抗治疗前后(3个月和6个月)的T细胞亚群，我们观察到CD8优势或效应T细胞占优势的T细胞扩增没有减弱。阿仑单抗没有显著改变T细胞亚群比例和炎症细胞因子；CD45RO的比例 + CD8 + t细胞增加(补充图。 25 ).我们检测了阿仑珠单抗治疗后T细胞克隆能力的变化。在治疗前后，许多重排的CDR3连接主要在受试者中共享，但在受试者之间不共享。较大的克隆似乎更有可能在处理后继续存在(图。 6a 和补充图。 26 ).免疫抑制没有削弱TCR克隆性；与治疗前相比，治疗进一步扭曲了TCR多样性，表现为较低的H多样性指数。6b
图6:免疫抑制治疗调节LGLL霸王龙的克隆能力和基因表达。 a 显示的是circos图，其中圆圈中的片段代表在患者之间或患者两次就诊之间产生重排TCR序列的单个细胞。黑线表示连接共享相同CDR3序列的细胞的弧线。左边和右边的图分别显示了UPNs 1、8和12以及UPNs 13、14和15之间相同CDR3序列的共享。红色和蓝色曲线分别与处理前后样品中的克隆大小成比例。b 比较了患者(治疗前和治疗后)和健康供体TCR克隆性的基尼指数和香农指数。基尼系数仍然很高(0.547±0.215， P < 0.001) and Shannon index significantly lower (5.21 ± 2.25, P = 0.002)。治疗前后患者样本之间的双边Wilcoxon检验( n = 12);患者之间双边不成对的Mann-Whitney( n = 13)和健康供体( n = 7); P 数值如图所示。 c 治疗后LGLL霸王龙患者中jActiveModulesTopo发现的一个下调基因模块，包括 STAT3 ；表达水平的动态变化 STAT3 和凋亡基因(GO: 006915)在T-LGLL患者治疗前后( n = 12).显示的是25–75%的响应范围(顶部和底部方框线)以及最小值和最大值(条形)。 P 图中显示了双侧配对t检验的值。 d 显示的是不同时间点的治疗前和治疗后样品中前十位TCR克隆型的百分比。黑线表示预处理的前十个克隆；蓝线表示处理后的前十个克隆，它们不在处理前的前十个中。 e 阿仑珠单抗后增加、减少和稳定克隆的免疫激活基因和细胞周期基因的表达变化。 f 左，阿仑珠单抗治疗后有反应和无反应的凋亡基因表达变化(平均)。 x -轴，两个时间点，治疗前和治疗后； y -轴，调节凋亡基因的表达水平，以将应答者和非应答者的凋亡基因表达的治疗前值设置为零。右，治疗前有反应者(Resp)和无反应者(Non-resp)的凋亡基因表达水平；双边不成对 t -测试； P < 0.0001 [as software generated P < 0.0001, exact P 值不可用]。
我们通过基因表达的成对比较来探索阿仑珠单抗后转录组的变化。在全球范围内，我们观察到一些免疫基因表达下降，包括 TNF , 核因子 , 喀斯特地貌 , IL2 和 STAT5 ，而 真菌学 和细胞周期(G2M检查点，DNA修复和有丝分裂纺锤体)基因上调(补充图。 27a ).然而，顶级差异表达基因的途径分析显示许多免疫途径上调(补充图。 27b STAT3 是治疗后显著下调的基因之一，亚网络中的枢纽基因(由jActiveModulesTopo鉴定)是在阿仑珠单抗治疗后下调的基因。它的几个邻近基因，包括 TNFRSF10A，CDKN1B，CXCR4，IL6ST，IL2RA ，以及 福克斯1 (都参与细胞凋亡)也下调，但细胞凋亡基因(GO: 006915)的平均表达在治疗后上调(图。 6c ).参与T细胞分化和蛋白酶体活性的基因在治疗后下调。除了抗体依赖性细胞毒性和淋巴细胞耗竭，阿仑珠单抗治疗似乎调节STAT3途径并抑制T细胞分化；所有这些都可能有助于限制残留淋巴细胞的扩张和活化。
为了进一步表征阿仑珠单抗后的克隆动力学，我们根据克隆的比例变化将T细胞库模式的动力学大致分为三组:增加(克隆大小增加> 20%)、不变(克隆大小保持20%)和减少(克隆大小减少> 20%)。在12名有配对数据的LGLL霸王龙患者中，我们观察到26个克隆增加(大小变化范围11-3104)，7个克隆不变，24个克隆减少(大小变化范围31-4950)。在有反应和无反应的情况下，大多数扩增的克隆在治疗后仍然存在。单个患者中顶级克隆的动态变化(图。6d 和补充图。 28 –32 )在处理后显示四种一般模式:(I)顶端克隆增加或减少，出现新的优势克隆(UPNs 1、13和17)；(II)顶级克隆被新的优势克隆(UPNs 8、14、19和24)取代；(III)优势克隆的细微变化(UPNs 4和10)；(IV)优势克隆进一步扩大(UPNs 12、15和18)。这些模式都与治疗反应无关 1
为了理解处理如何改变CTL克隆的行为，我们以成对的方式比较了相同克隆处理前后的基因表达，克隆遵循三种动态模式。随着治疗的进行，增加的克隆显示出富含免疫反应和细胞激活(IFNγ、KRAS、MTOCR、IFNα和JAK/STAT3途径)的基因上调，但是在未改变和减少的克隆中，涉及免疫反应、淋巴细胞激活和细胞代谢(翻译起始、蛋白质定位、呼吸电子传递和细胞周期)的基因下调(图。 6e 和补充图。 33 和 34 ).用免疫抑制疗法，尺寸增加的克隆保留了活跃的免疫功能和细胞代谢，而在稳定和减少的克隆中具有这些功能的基因被抑制 23 。简而言之，配对的scRNA-seq和scTCR-seq显示阿仑珠单抗调节T-LGLL中的T细胞克隆性和全局转录组标记。考虑到治疗后T细胞亚群的微小变化和TCR克隆的广泛变化，我们推断单个细胞亚群的转录组变化反映了T-LGLL的发病机制特征。
接受阿仑珠单抗治疗后，T-LGLL患者血浆细胞因子的增加与治疗前水平相似(补充图。 35 和 36 ).T细胞亚群和TCR克隆性的变化在应答者和非应答者中也没有差异。我们在动态基因表达随治疗的变化中寻找对阿仑珠单抗反应的鉴别器。我们以成对的方式分别比较了治疗前后有反应者和无反应者的基因表达，观察到有反应者的细胞凋亡基因比无反应者增加更显著(图。 6f ，左)。接下来，为了确定我们队列中对阿仑珠单抗应答的预测因子，比较了基线时应答者和无应答者的基因表达。参与免疫应答和细胞激活的基因(KRAS、IL6_JAK_STAT3和TP53途径)在应答者中高度表达。细胞凋亡中基因的表达(GO: 0006915和REACTOM _ 5357801图。 6f ，对)。较少偏斜的活化诱导的细胞死亡可能预测对免疫抑制治疗的反应，T细胞的凋亡是治疗成功的一个因素。阿仑珠单抗的疗效似乎是凋亡基因表达增加和随之而来的克隆扩增抑制的结果。
