PD-L1阻断后外周血中新抗原特异性CD8 T细胞反应可能预测转移性尿路上皮癌的治疗结果

CD8⁺t细胞对肿瘤突变衍生的新抗原的反应性被广泛认为促进了由免疫检查点阻断(ICB)诱导的抗肿瘤免疫。这里我们显示了新抗原反应性CD8数量的增加⁺治疗前至治疗后3周之间的t细胞(NART)群区分了使用PD-L1阻断治疗的转移性尿路上皮癌(mUC)中疾病得到控制的患者与疾病进展的患者。外周血CD8的纵向分析⁺在来自临床试验NCT02108652的24名患者队列中，由DNA条形码标记的pMHC多聚体组成的患者特异性新肽库的t细胞识别也显示，来自疾病对照患者的外周NARTs以PD1为特征⁺Ki67⁺与旁观者大量抗原和病毒抗原反应性CD8相比，效应表型和CD39水平增加⁺t细胞。该研究提供了ICB后NART特征的见解，并表明早期NART扩张和激活与mUC患者对ICB的反应相关。

由程序性死亡1 (PD-1) /程序性死亡配体1 (PD-L1)轴的ICB诱导的抗肿瘤T细胞反应可以在患有各种转移性癌症的患者中产生深度和持久的反应^1,2,3,4,5。在治疗前肿瘤中，高突变负荷与对多种适应症的免疫检查点阻断(ICB)的有益反应相关，这被认为至少部分是由于主要组织相容性复合体(MHC)I类至CD8展示的外源性新抗原的呈递增加⁺ICB激活了t细胞^6,7,8,9。事实上，越来越多的证据表明CD8⁺t细胞不仅渗入有反应的肿瘤，而且在用ICB治疗后，在患者的外周血中经历快速和强有力的增殖^{10,11,12,13,14,15,16,17}。关于这种CD8的特异性⁺T细胞应答，新抗原识别T细胞(NARTs)的询问大多局限于肿瘤组织¹⁸。重要的是，由于相关的新抗原对于个体患者是独特的，因此详细的NART分析需要预测潜在的新抗原，并使用针对每个患者的一组独特的新抗原进行T细胞筛选。这一努力受到技术障碍的阻碍，技术障碍限制了全面表征大量潜在呈递的新抗原以及潜在人类白细胞抗原I类(HLA)基因型多样性所需的分析范围。

为了解决这些问题，我们重点研究了之前报道的一组接受抗PD-L1抗体阿替唑单抗治疗转移性尿路上皮癌(mUC)的患者¹⁹。mUC的临床结果显著受益于ICB治疗的引入，大约20%以前患有致命疾病的患者经历了长期存活^20,21。此外，对研究中的患者进行了长期随访(n= 24)，在治疗开始后的5年多时间里，仍有一些无进展。使用患者特异性新肽-MHC (pMHC)多聚体文库，用DNA条形码标记，全面筛选治疗前、治疗中和治疗后收集的外周血样本²²，允许CD8的高通量检测⁺在一个平行反应中识别任何这种新肽的t细胞群。我们使用这种新技术研究了NART动力学和表型，并评估了其与临床结果的关系。

新表位预测和T细胞筛选

通过使用MuPeXI平台，从全外显子组测序(WES)和RNAseq预测每个个体患者的新表位²³。基于它们各自的MHC-I结合亲和力和表达水平，以及与给定肽相关的重组MHC-I分子的实验可用性，选择潜在的新肽候选物。在24名患者中，代表了56种不同的HLA ABC单倍型，在分析时，其中31种可用于pMHC多聚体的产生。平均来说，每个患者有四个HLA单体型。具有预测洗脱配体(EL)%等级分数的所有HLA可行的新肽²⁴ <0.5 and expression level >0.1 transcripts per million (TPM) were selected, yielding between 14-587 HLA-binding neopeptides per patient (Fig. 1a).为了对低突变负荷患者的潜在新表位进行完整评估，根据最低EL %等级分数，包括了来自表达水平> 0.1 TPM的基因的具有较高EL %等级分数的额外新肽，直到每个患者的T细胞识别分析达到最少200个新肽。结果，使用显示200-587个患者特异性新肽的pMHC多聚体文库分析了每个患者(图。1b).总共预测了24名患者的6237种HLA可行的新肽，并将其纳入T细胞分析(表1).

amUC患者突变衍生新肽识别和预测工作流程概述。和BioRender.com一起创作的。b患者队列中预测的和HLA可行的EL %等级< 0.5的新肽数量，以及TMB(菱形)。根据最佳RECIST 1.1标准分组的患者，PD(n= 13名患者；中位数= 123，范围= 16–700个新肽，预测的EL %等级< 0.5)和SD/PR/CR患者(n= 11名患者；中位数= 292，范围= 26–898个新肽，预测的EL %等级< 0.5)。虚线代表每个患者的面板中包含的最少200种新肽。c, d与SD/PR/CR患者相比，PD患者的TMB和EL %的预测新肽数量排名< 0.5。对于(c, d)使用非参数双边Mann-Whitney检验对各组进行比较，数据表示为1.5 IQR的上/下四分位数内最大/最小值的中值。NS。不重要。源数据作为源数据文件提供。

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在该患者队列中，肿瘤突变负荷(TMB)和EL %等级< 0.5的预测新肽数量都不能预测ICB结果(图。1c，d).因此，我们评估了循环NARTs的存在，以获得对开始抗PD-L1治疗后抗肿瘤免疫本质的更深入了解。

患者PBMC样本中存在NARTs

基于所选的新肽，为每个患者生成了与其HLA-型相匹配的条形码pMHC多聚体文库(图。2a).除了新肽，1-17个HLA匹配的来自巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)和流感(FLU，一起；CEF)包括在每个患者的肽库中，用于内部分析验证，并将NARTs与病毒抗原反应性T细胞(VARTs桌子1).T细胞识别通过外周血单核细胞(PBMC)染色和多聚体结合T细胞群中pMHC相关条形码的分类来检测。给定新表位的显著T细胞识别(NART反应)被定义为对数₂折叠更改(日志₂FC) >2，错误发现率(FDR) < 0.1，基于之前的调查²².

amUC癌症患者新抗原特异性T细胞检测工作流程概述。实验步骤包括从预测的新肽构建DNA条形码pMHC多聚体文库，收集多聚体组，用多聚体对患者PBMCs染色，分选多聚体结合CD8⁺t细胞、DNA条形码的扩增和测序以及数据分析。和BioRender.com一起创作的。b来自患者#2389的代表性输出，检测到的NART反应筛查。原木₂在每个时间点(治疗前、治疗后第3周、第9周、第63周、第159周和第273周),通过输入文库上的T细胞分选富集测序的pMHC相关条形码的倍数变化(fc)。标记点代表显著富集的pMHC与对数共附着的条形码₂fc >2，计数分数> 0.1%，以及p < 0.001, determined as T cell responses, among the sorted multimer positive CD8⁺t细胞群体。T细胞反应基于肽呈递HLA类型进行着色，用肽序列进行标记，并根据肽识别T细胞群体的估计频率确定大小。如果肽来源于病毒，则病毒在括号中注明，否则为突变来源的新肽。灰点代表非浓缩条形码。原木水平线₂fc = 2。垂直线分隔肽呈递HLA类型。c第2389号患者在治疗后9周的三次NART反应的四聚体验证。显示CD8+细胞，四聚体门控⁺人口。以百分比给出的四聚体pMHC群体的频率，连同括号中给出的从多聚体筛选得到的估计频率。d每个患者预测的HLA-I可行的新肽的文库大小，根据预测的HLA-I结合强度的彩色条，与每个患者筛选的样品中独特NART反应的总数相比(星号)。源数据作为源数据文件提供。

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在阿替唑单抗给药前采集的PBMC样本中筛选NARTs的存在(n= 85份样本，中位数=每名患者3份样本)1+补充表格1).值得注意的是，对于6名长期反应者，PBMCs可从治疗开始后> 231周的采样中获得。

NARTs患者筛查的代表性结果如图所示。2b和补充图。2a，b。对于患者#2389(根据实体瘤最佳缓解评估标准[RECIST]1.1版标准，治疗开始后> 280周)，T细胞识别(记录₂FC)描述了在该患者中评估的每种pMHC多聚体(n= 203;图。2b).根据采血的时间点列出结果，并根据评估的HLA分子分组。从治疗前到治疗后3周，观察到识别HLA-A*01:01和HLA-B*40:01上呈现的新表位的新T细胞群的出现，同时在大多数筛选时间点检测到针对HLA-A*01:01上呈现的流感表位的T细胞应答(VSDGGPNLY)。基于额外的样本可用性，使用新pMHC四聚体对治疗后3周或9周检测到的65例NART反应进行了分析(图。2c).50个NART反应是有效的，而另外9个反应是边缘可检测的(补充图。3).这些边界可检测的反应可能代表低亲和力的反应，可能仅通过使用DNA条形码标记的多聚体来检测，这是因为与用于检测这种T细胞的常规基于四聚体的检测相比，灵敏度提高了²²。在对患者样本进行筛选的同时，对选定的一组健康供体(HD) PBMC样本进行了评估，以验证基于所含CEF肽的所有pMHC多聚体文库(补充图。2c).少数pMHC多聚体复合物在所有样品中表现出非特异性结合，并被排除在进一步分析之外。

在治疗前的时间点，在24名患者中的18名中检测到识别新表位的T细胞(中位数2；每位患者0到10次NART反应)。阿替唑单抗治疗3周后，22例患者中的17例检测到识别新表位的T细胞(中位数3；每位患者0至13次NART反应；桌子1).22名患者中有18名(包括4名治疗前未检测到nart的患者)在治疗后出现nart，而这些nart在治疗前并不存在。在多个时间点观察到148个独特的NART反应中的45个(补充表1).在整个治疗过程中检测到的独特NART反应的数量与预测和评估的新表位的数量之间没有直接联系(图。2d).这表明，除了TMB之外，其他参数影响在ICB启动时驱动这种T细胞反应的能力。

治疗后三周NART反应的增强与临床结果的改善相关

在治疗前的时间点，没有观察到NART缓解数和最佳RECIST缓解数之间的关联。然而，在整个治疗过程中，NART反应的动力学存在差异，NART人群在治疗后三周增加，然后在大多数疾病控制患者(定义为SD、PR和CR患者)中收缩，但在进行性疾病患者(PD；图。3a).事实上，在治疗后三周的时间点，与PD患者相比，疾病控制患者往往具有更高数量的NART反应(图。3a, p= 0.067)，当比较CR和PD患者时也是如此(图。3b，c).在随后的时间点，没有观察到患者反应组之间的显著差异。变化(三角洲)计算治疗前和治疗后三周之间检测到的NART反应的数量，以更好地近似患者特异性NART动力学(图。3d–e).与PD患者相比，观察到疾病控制患者的δNART反应显著增加(图。三维（three dimension的缩写）, p= 0.012)，与PD患者相比，CR患者经历最大的δNART反应(图3e, p= 0.022).尽管与新表位相比，分析中包括的CEF来源的表位库要小得多，但在治疗过程中没有观察到VART反应库的变化(补充图。5).NART反应的频率是根据pMHC多聚体染色和分配给给定人群的条形码阅读分数来估计的(见材料和方法)。所有患者样本的估计频率之和(sef)在0.01%和3.9%之间(n= 62，平均0.55%(补充图)4a).个体反应估计频率范围从0.01%到约2.83%(n= 221)，98%以上的响应频率低于1%(平均值= 0.15 %，中位数= 0.048%)。因此，患者样本中的sef不会因单一的大NART反应频率而偏斜。无论是绝对SEF还是从基线到治疗后3周的SEF变化都与临床结果无关(图。3f–I).因此，基于这一评估，在PD患者和CR患者之间观察到NART反应数量的实质性差异，NART谱的广度而不是这些人群的综合估计频率是与ICB治疗的良好临床结果相关的关键参数。增长三角洲疾病控制患者治疗前至治疗后3周的许多NART反应表明，这些患者倾向于在治疗后迅速提高更广泛的T细胞新抗原识别库。

a治疗过程中所有患者检测到的NART反应数量。各个时间点的实心圆表示给定样品的筛选。根据SD、PR和CR对患者进行分组(n= 11名患者)和PD(n= 13名患者)。b–c治疗前检测到的NART反应数量(n= 24名患者)和治疗后三周(n= 22个患者)对于每个患者，d–e在最少两个时间点采样的患者在治疗前和治疗后3周之间的NART反应数量的变化(n= 22名患者)，f–gNART人群在治疗前和治疗后3周的SEF，以及(h–i)与SD/PR/CR患者或个体Best RECIST 1.1组相比，NART人群在治疗前和治疗后三周之间的SEF变化，在所有评估为PD的数字中。对于(b), (d), (f) + (h)组使用非参数双边Mann-Whitney检验和Kruskal-Wallis Dunn多重比较检验进行比较(c), (e), (g) + (i).对于(b–i)，数据表示为1.5 IQR上/下四分位数内最大/最小值中间值。NS。不重要*p < 0.05. Source data are provided as a Source Data file.

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如上所述，预测的新表位最初是基于EL%Rank评分< 0.5的选择标准，但是对于15名患者，新表位文库的大小被扩展到最少200个新表位。因此，我们评估了新表位特征和文库大小的潜在差异是否会影响我们的发现。进行了可比较的分析，仅包括EL %等级分数< 0.5且表达水平> 2 TPM的新表位，或将所有文库大小设为200。对于这两种分析，我们观察到与总新肽库相似的趋势(补充图。4b–d).因此，最初的选择标准并没有给我们的研究结果带来偏见。

根据持久的临床获益(DCB无进展生存期，PFS >6个月)在NART缓解数方面没有产生显著差异(补充图。4e).此外，尽管没有统计学意义，但从治疗前到治疗后3周具有较高δNART反应数的患者(δNART反应中位数> 0；补充图4f–h).

外周血TCR指标显示与NARTs相似的动力学

先前已经证明PBMCs和til的TCR多样性和克隆性与对ICB的反应相关^14,25,26。对于该群体，在DCB患者治疗后3周，肿瘤中存在的较高比例的T细胞克隆在血液中扩增¹⁹。我们观察到大量TCR克隆性在治疗后早期快速增加，类似于观察到的NART反应数量的增加(补充图。4i)，即使整体TCR克隆性或多样性的变化并没有区分对治疗有反应和无反应的患者(数据未显示)。尽管大量的TCR测序不能确定单个克隆的抗原特异性，但是对于具有良好临床结果的患者，NART反应发展和TCR克隆性之间的平行动力学是值得注意的。这进一步支持了克隆扩增和T细胞再生发生在ICB治疗后早期的论点。

nart的表型特征表明在疾病控制的患者中nart的增殖增加

为了表征NARTs的表型特征，设计了一个定制的多色流式细胞术抗体组来表征T细胞的分化、衰竭、活化和迁移(补充图。6a).藻红蛋白(PE)-新表位多聚体和与别藻蓝蛋白(APC)缀合的病毒pMHC多聚体都包括在该组中，以进一步区分NARTs和VARTs的表型特征。对pMHC多聚体结合T细胞进行分类，并对表位反应性的条形码进行测序，同时，对NARTs和VARTs的表型进行表征。根据最初的早期NART反应、患者样本和多聚体文库的可用性(n= 34).

使用均匀流形近似和投影(UMAP)降维插件将数据可视化。无论是治疗前还是治疗后，或者是疾病控制组与帕金森病患者相比，当按患者划分UMAPs时，观察到了人群分布的变化(图。4a、b).治疗后密度增加的群体以Ki67、PD-1和部分CD39的表达为特征(图。4c).特别是，与帕金森病患者相比，疾病控制患者的Ki67和PD-1表达NARTs在治疗后似乎更加丰富。相反，表达CD57的NARTs在PD患者治疗后出现的频率更高。因此，在UMAP信号的指导下，基于完整数据集，对个体患者和评估时间点的“大量CD8 T细胞”、“NARTs”和“VARTs”进行了量化，在疾病控制患者中治疗后出现增加的参数频率，即KI67、CD39和PD-1。我们观察到Ki67的频率增加⁺(散装CD8p= 0.00034，NARTsp= 0.0054，变量p= 0.001)和PD-1⁺(散装CD8p= 0.041，NARTsp= 0.043)从基线到治疗后三周，所有评估亚群中的CD8 T细胞(图。4d);表明ICB导致了T细胞活化的一般特征。重要的是，这种增加几乎只在疾病控制的患者中观察到，对Ki67⁺大量CD8 T细胞(p= 0.00088)，Ki67⁺NARTs(p= 0.011)和Ki67⁺VARTs(p= 0.0091).PD-1⁺从PD患者治疗前到治疗后，大量CD8 T细胞略有增加(p= 0.03;图。4e)，但应基于PD-1完全不存在来反映⁺治疗开始前的大量CD8 T细胞。仅在VART人群中，我们观察到Ki67对T细胞活化的边际、非显著增加⁺和PD-1⁺在PD组(图。4e).很明显，疾病对照组中的几个患者具有升高的PD-1水平⁺CD8 T细胞，尤其是在治疗前的“大量CD8”和“NART”中(大量CD8预处理p= 0.0089;NARTs前p= 0.02;图。4f).Ki67的类似增强水平⁺和PD-1⁺大量CD8’和CD39⁺，Ki67⁺和PD-1⁺在治疗后3wk观察到NARTs，尽管仅对PD-1有意义⁺NARTs(p= 0.028;图。4f).有趣的是，我们观察到三重阳性的Ki67⁺PD-1⁺CD39⁺PD组中完全没有CD8 T细胞(Bulk，NARTs或VARTs )(图。第四代移动通信技术).最后，在治疗后3周，高达60%的NARTs是Ki67⁺CD45RA^-细胞和倾向于构成疾病控制患者的较大亚群(补充图。6b)，其中大多数细胞是CD27⁺而不是CD57⁺，意味着激活状态，而不是终末分化(补充图。6c).终末分化CD57的频率没有差异⁺CD45RA⁺GzmB⁺在患者组之间或治疗过程中可以看到三阳性细胞(补充图。6e，f).可检测的NARTs主要由T组成_全身长的细胞，有一小部分幼稚细胞(补充图。6g).这表明在一定程度上也捕获了基于来自幼稚库的NARTs的T细胞识别。

a–b大量连接的CD8 + T细胞和NARTs在(a)预处理和(b)SD/PR/CR患者治疗后3周(n= 8名患者)和PD(n= 4名患者)。cUMAP表型标记的表达。表达相似参数的细胞基于表达模式进行聚类。d–f所选和(g)对于三阳性Ki67⁺PD-1⁺CD39⁺每位患者的大量CD8、NART和VART亚群，或者在治疗前(n= 14名患者)和治疗后3周(n = 14名患者)以及SD/PR/CR患者(n= 10名患者)和PD (n = 4名患者)。h–iCD39⁺SD/PR/CR患者治疗前后大量CD8 T细胞、NART和VART亚群的频率(n= 10名患者)和PD(n= 4名患者)。j–p2389号患者治疗后三周NART亚群关键参数的血流等值线图(5%，显示异常值)的代表性示例(DCB最佳RECIST 1.1 CR)。qKi67⁺，CD39⁺和PD-1⁺治疗前大量CD8 T细胞、NARTs和VARTs的亚群频率(n= 14名患者)并且在三周(n= 14名患者)和治疗后230+周(n= 6名患者)。对于(d–g)组使用非参数双边Mann-Whitney检验和Kruskal-Wallis Dunn多重比较检验进行比较(h) + (i).对于(d–i)，数据表示为1.5 IQR上/下四分位数内最大/最小值中间值。NS。不重要*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. wk: week, Pre: Pre-treatment, Post: Post-treatment. In (d), (e)和(g)后:治疗后三周。源数据作为源数据文件提供。

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重要的是，CD39似乎是最能区分PBMC NART人群和VART人群的参数(前p= 0.007，后处理p= 0.018;图。4h).CD39表达在NARTs中特别明显，在治疗前和治疗后，在具有疾病控制的患者中(治疗前p= 0.013，后处理p= 0.041;图。4i)，表明这组T细胞最近暴露于抗原。以前，已经发现CD39分化肿瘤特异性CD8⁺来自旁观者肿瘤浸润淋巴细胞的肿瘤浸润淋巴细胞²⁷。有趣的是，PD患者#7577表达Ki67的频率更高⁺细胞比其余PD患者多，但CD39很少⁺nart在治疗前和治疗后均可检测到，表明这类nart缺乏抗原识别，尽管ICB后有增殖(补充图。6c，d).

治疗后三周的上述NART亚群的例子见图。4j–p(2389号患者，最佳RECIST 1.1 CR)。对于具有长期临床反应的患者，我们在治疗后的较晚时间点(治疗后231+周，n= 6).这些患者中的大多数经历了Ki67频率的最初爆发⁺，PD-1⁺和CD39⁺在评估的晚期时间点下降至治疗前水平的亚群(图。4q).

总之，在单剂量的PD-L1阻断后，观察到NARTs的增殖爆发，这在以前的大量CD8 T细胞中已经注意到¹³。在这次爆发期间，疾病控制患者的NARTs往往处于Ki67⁺状态，主要是CD45RA⁻，PD-1⁺表现型，支持CD27表达超过CD57。此外，这种NART亚群可以根据CD39的表达在PBMCs中进行鉴定。

洗脱配体等级分数是CD8识别新表位的关键相关因素⁺t细胞

精确预测T细胞识别哪些肿瘤新表位是非常重要的。因此，我们评估了一些可能影响T细胞识别可能性的特征。t细胞识别新表位具有较低的百分位数等级，均与EL %等级相关(p= 0.0016)和结合亲和力预测(BA %等级，p < 0.0001), whereas neopeptide-related gene expression level did not differ between T cell recognized and non-recognized neopeptides (p= 0.73;图。5a–c).对于EL %等级< 0.5且表达水平> 2 TPM的预测新肽，观察到T细胞识别的新表位的富集(p < 0.001; Fig. 5d)，表明基因表达水平结合el与预测该队列中的免疫原性新表位相关。此外，改良的或保守的HLA-结合物没有差异，因为两者在T细胞识别的部分中表现相同(p= 0.19，图。5e)²⁸。有趣的是，我们没有观察到T细胞对来自某些突变类型的新肽(p= NS图。5f).然而，大量来自非错义突变的预测新肽引发了T细胞反应，这也见于肾细胞癌(RCC)患者²⁹。这种非错义突变分布不均匀，但存在于大多数接受评估的患者中(图。5g)

a–c根据T细胞识别分组的预测新肽的EL %等级分数、BA %等级分数和表达水平(是，n= 147个新肽/否，n= 6，090个新肽)。虚线表示z-检验中各组的分离，应用于图。5d. d新肽来源基因的表达水平和新肽的预测EL %等级评分。根据T细胞对新肽的识别进行着色。e肽EL %根据T细胞识别对野生型(正常)和突变新肽进行评分，并进行着色。f根据新肽诱导的突变类型分组的诱导T细胞识别或不诱导T细胞识别的新表位比例。g预测的新肽和新表位识别的分布，根据患者间肽诱导突变的类型分组(M =错义，F =移码，I =框架内插入，D =框架内缺失)。h非和T细胞识别的预测新肽的文氏图，以及它们是否来源于克隆突变或癌症驱动基因。对于(a–c)组使用非配对进行比较t-测试和数据显示为箱线图，范围为具有中间值的第25和第75个四分位数，晶须为1.5 IQR的上/下四分位数内的最大/最小值。NS。不重要*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Source data are provided as a Source Data file.

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最近，预测的新肽的克隆性与ICB后的T细胞免疫反应性相关，衍生自克隆突变的肽在PD-1和CTLA-4阻断后主导了诱导的T细胞反应^30,31。为了定义CD8的有利特征⁺t细胞反应性新肽，我们研究了它们的克隆性、基因来源、表达水平和HLA结合亲和力。衍生自克隆突变的肽构成了文库中包含的大多数新肽(6，237中的5，756；92%)，与之前在非小细胞肺癌中所见相似³⁰。在该队列中筛选的6，237种新肽中，观察到148种独特的新肽引发T细胞应答。其中，143个新肽来自克隆突变，两个来自癌症驱动基因(GPC3和MAML2)。没有观察到T细胞对克隆或非克隆新表位的识别差异(p= 0.4)，但这可能是由于在该队列中观察到大部分克隆突变。此外，在识别的肽中没有观察到对癌症驱动基因的偏好(p= 0.066)并且NARTs识别来自该群组中大量非经典癌症驱动基因的肽(n= 120个基因；图。5h).总之，这些结果表明HLA-肽结合亲和力在成功预测免疫原性新表位以及新抗原表达的潜在影响中的重要性。

治疗前TME mRNA基因标记与治疗后NART库和表型特征相关

建立了NART反应的特征后，我们随后分析了治疗前肿瘤中的mRNA表达模式，以评估肿瘤微环境(TME)中驱动治疗后NART反应的潜在决定因素。为了更好地了解TME的组成，我们应用差异表达分析(DEA)来确定过度表达的基因，并使用微环境群体计数器(MCP)来估计TME中免疫细胞群体的丰度。

从治疗前的RNA-seq数据中，基于治疗后三周检测到的NART反应的数量来评估差异表达的基因(高> = 3的反应的中值数量；图。6a).有趣的是，当基于差异表达的基因进行评估时，我们观察到基于TME基因表达模式的患者的强聚类——具有高NART应答数的患者倾向于具有更高的基因mRNA表达，如CD3D、PPARG和TNFSF15，涉及T细胞活化和分化^{32,33,34,35,36}，表明在具有大量治疗后NART反应的患者中T细胞刺激治疗前TME。相比之下，对于NART反应数量较低的患者，我们观察到FN1、ITGA5和COL3A1的高表达，这与癌症患者的低存活率相关^37,38,39。此外，CXCL5参与血管生成^40,41，在NART反应低的患者和帕金森病人中表达越来越多。此外，对于治疗后具有高NART反应的患者，DEA结果的基因本体(GO)富集分析显示，与TCR复合物和抗原呈递相关的基因集在治疗前富集，潜在地促进了治疗后NART反应的改善(图。6b，c).

a差异表达的基因(n= 295)，与治疗后三周的高与低NART反应相关。b, c来自GO富集分析的两个重要基因组，分别是抗原结合和T细胞受体复合物。d患者免疫细胞信号热图，按治疗后3周NART反应的高或低数量分组，以及(e–h)向高的联想(n= 11名患者)或低数量(n= 11名患者)的NART反应e)T细胞，fCTL，gCD8 T细胞，以及(h)成纤维细胞。没有从患者#40和#9723获得治疗后三周的PBMCs，因此这些患者不包括在分析或比较中。对于(a)和(d–h)NS¹表示由于样本不可用，在治疗后三周未进行筛查的患者。对于e)-h)组，使用非参数双侧Mann-Whitney检验进行比较，数据表示为1.5 IQR的上/下四分位数内最大/最小值的中值。NS。不重要*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Source data are provided as a Source Data file.

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应用MCP-counter方法，治疗后具有大量检测到的NART反应的患者具有更高的基因表达，这些基因共同定义了各种免疫细胞亚型，包括大量T细胞(p= 0.042)以及CD8 T细胞的趋势(p= 0.066)，同时表现出较低水平的成纤维细胞，表明抑制性较低的TME⁴² (p= 0.0005;图。6d–h).总的来说，治疗前的TME模式与治疗后的NART反应库相关，治疗前的T细胞激活患者肿瘤中的mRNA标记，这往往会在治疗后引起更广泛的NART反应。

这项研究利用高通量筛选方法，连续询问CD8 T细胞对患者特异性新肽的识别，这些新肽是从24名接受抗PD-L1治疗的mUC患者的外周血中的治疗前肿瘤变位基因组中预测的。几项发现很重要。首先，我们观察到在疾病控制的患者中，从治疗前到治疗后三周，NART反应增加。在这个时间点，总的新表位识别宽度，而不是这种CD8 T细胞群的估计频率，与临床放射反应相关。这可能反映了大多数NART响应的频率较低的发现。第二，NARTs的表型特征揭示了Ki-67⁺PD-1⁺治疗三周后记录疗效和临床结果。第三，与血液中的VARTs相比，CD39在NARTs的更高部分上表达，表明该标记可用于鉴定抗肿瘤T细胞。在大量CD8中没有观察到相同的差异⁺T细胞，可能包括在我们的新表位识别筛选中未捕获的额外肿瘤抗原特异性T细胞。第四，治疗前TME mRNA表达模式与治疗后三周NART反应增加相关。最后，新表位预测的计算机模拟部分再现了NARTs的T细胞识别，证明了肽HLA结合和突变基因表达影响新表位T细胞识别。

在我们的研究中检测到的NART反应的表观动力学与越来越多的文献一致，表明ICB在外周血中快速诱导免疫T细胞反应，其中多份报告描述了ICB启动后7-21天内早期外周T细胞的更新、扩增和活化^{12,13,14,15,16,17,19,43}。两种效应T细胞扩增¹⁴和Ki67+ PD-1+ CD8 T细胞增加¹³在外周，治疗后三周与ICB的临床结果相关。我们的发现提供了新的见解，因为它们通过检测和定量ICB后的循环NARTs，阐明了识别新表位的CD8 T细胞应答的特异性和时间动力学。然而，尽管最近的研究表明ICB诱导的来自淋巴结的原始肿瘤特异性T细胞的重新募集，但是还不能推断新出现的NARTs是真正的重新启动还是在外周以亚检测水平存在的预处理⁴⁴.

还应注意的是，该队列中患者的中位缓解时间为2.1个月(95% CI 2.0–2.2)⁵与第一次影像学疾病评估的时间一致，与针对mUC患者的其他ICB临床试验相当(缓解的中位时间为1.4-2.1个月)^{45,46,47,48,49,50}。因此，在第一次扫描之前没有测量到任何早期的肿瘤减少，但是快速的反应时间表明对治疗的临床反应发生得早。因此，这些观察结果与我们早期增殖的发现一致，因为大多数对治疗的反应是在治疗后9周获得的。

此外，询问NARTs揭示了从研究大量TCR-seq中不可见的动力学。这些NART反应对研究中的每个患者都是个体化的，并且在一些长期反应者的治疗开始后持续超过5年，尽管水平低于最初3周的峰值。本研究中未发现患者之间共有的NART反应。

对体内诱导的T细胞新抗原反应进行计算机模拟的能力，以及除了TMB和新肽预测与临床结果的关联之外的抗原多样性计算机模拟的临床相关性，是积极研究的领域。基因表达水平对新抗原质量的重要性先前已有描述，但阈值仍未确定⁵¹与已确立的HLA-I结合亲和力的重要性相反²⁸。我们观察到大多数NART人群识别EL%Rank <0.5且表达水平> 2 TPM的新肽，并且仅基于这些反应的分析也与临床结果相关(补充图。4b–d).然而，检测到对这些规格之外的新肽的大量NART反应，并且同样可以作为抗肿瘤免疫的重要靶标。虽然组合的EL%Rank评分和表达水平在此提供了新肽T细胞反应性的最佳参数，但这些结果也表明未来的新表位预测和选择应包括额外的参数，如肿瘤免疫原性、免疫引发和与已知自身和感染来源抗原的肽序列相似性，如最近描述的新抗原适合度模型中所包含的^{52,53,54,55,56}。在研究开始时，仅根据HLA结合亲和力和表达水平> 0.1 TPM选择新肽，限制了预测和选择免疫原性新表位的潜在偏差。最近，基于这些关键特征的选择得到了支持，但也揭示了在完全定义高准确度新表位预测的关键参数方面的持续挑战⁵⁷。最后，研究结果表明，超出当前阈值的预测的新肽应包括在未来的NART筛查中。

有趣的是，我们观察到治疗前肿瘤的mRNA表达模式在治疗后NART反应增强的患者和未增强的患者之间有所不同。特别是，高T细胞浸润似乎对NARTs的产生很重要。尽管需要验证，我们的结果也表明，治疗前TME mRNA基因表达模式在预测NART反应时也是有用的。同样令人感兴趣的是，临床结果可能由有利的治疗前TME和诱导的治疗后NART库共同驱动，这需要进一步的研究。

NARTs的表型特征允许在外周血中进行重要的观察，这在以前主要是在肿瘤微环境中进行的。最近，在非小细胞肺癌患者中，活化祖细胞样(TCF-1⁺PD-1⁺)已经观察到具有增殖能力的T细胞，强调了这种细胞类型对于抗肿瘤反应的可能重要性⁵⁸。我们的分析显示类似的PD-1⁺Ki67⁺主要在从治疗中获益的患者中检测治疗后的NART人群。尽管表型变化在某种程度上似乎是抗原非依赖性的，但我们的结果仍然表明外周血中NARTs的反应性和增殖趋势有助于肿瘤清除，并且活化的T细胞谱与良好的临床结果相关。此外，在肺和结肠直肠肿瘤中，CD39表达已被用于区分微环境中的旁观者和NARTs²⁷。我们在此证明，CD39的表达也有助于从血液中的旁观者T细胞中识别NARTs，而不需要获取和立即处理新鲜的肿瘤组织。

我们的研究有明显的局限性。首先，样本量很小。然而，对研究中的24名患者的筛选是非选择性的和全面的，每个患者包括200-587个新肽，总共产生6237个新肽。还纵向收集和筛选了患者样本，这允许在一些长期反应者中检测治疗后长达5年以上的NART反应。第二，我们没有评估MHC-II限制性肽的贡献和CD4 T细胞的作用，最近的研究表明，在ICB之后，CD4 T细胞介导和驱动抗肿瘤细胞毒性和免疫原性，同样在UC中^59,60,61。最后，我们没有进行治疗中的活检，因此无法评估治疗期间的NART转运和肿瘤免疫编辑。

另外令人感兴趣的是，两名对治疗有部分反应的患者的T细胞新表位识别谱与其他疾病控制的患者显著不同。患者#5122 (PFS/OS = 1932，best RECIST 1.1 PR)与其他长期无进展生存的患者不同，其NART反应数量较基线下降，且在整个治疗过程中未检测到NART反应。然而，病人被观察到怀有一个PDL1基因扩增与ICB治疗后的阳性结果相关⁶²。患者#1233在较大的队列中表现出NART动力学和表型以及与PD相关的治疗前TME mRNA表达模式；因此，没有这样的特征解释明显的临床反应。这些病例表明了ICB临床反应和耐药性的复杂性。

尽管有这些限制，我们的观察增加了目前对ICB诱导的抗肿瘤免疫的理解，并表明仅从治疗前存档肿瘤和治疗后外周血询问就可以获得对NART动力学的重要见解；NARTs确实可以在外周检测到，而且在受益于治疗的患者中检测到的程度更高。这些发现保证了进一步的研究，以改善ICB临床结果预测和研究ICB的机制基础，是否预先存在的NARTs上升到可检测的水平⁶³或者NARTs是否由于ICB而被招募和激活^44,64,65.