CD8白血病和非白血病免疫系统的单细胞特征+t细胞大颗粒淋巴细胞白血病

T细胞大颗粒淋巴细胞白血病(T-LGLL)是一种罕见的成熟、克隆性扩增T细胞的淋巴增生性疾病STAT3突变很常见。尽管T-LGLL被描述为一种对抗原的慢性T细胞反应，但非白血病免疫系统在这种反应中的功能在很大程度上是未知的。在这里，通过利用单细胞RNA和T细胞受体图谱(scRNA+TCRαβ-seq ),我们表明，无论STAT3突变状态下，T-LGLL克隆型比健康的反应性克隆型更具细胞毒性和耗竭性。此外，T-LGLL克隆型通过共刺激细胞间相互作用、单核细胞分泌的促炎细胞因子和T-LGLL克隆分泌的IFNγ，与非白血病免疫细胞的反应性克隆相比，表现出更活跃的细胞交流。除了白血病细胞库，T-LGLL中的非白血病T细胞库也比其他癌症和自身免疫性疾病中的更成熟、更具细胞毒性和克隆限制。最后，72%的白血病T-LGLL克隆型与其非白血病库共享T细胞受体相似性，通过可能的共同靶抗原将白血病和非白血病库联系在一起。我们的结果为优先考虑靶向整个免疫系统而不仅仅是T-LGLL克隆型的治疗提供了理论基础。

T细胞大颗粒淋巴细胞白血病(T-LGLL)是一种罕见的淋巴增生性疾病，以血液、骨髓和脾脏中异常、克隆受限和活化的效应T细胞的积聚为特征^1,2。虽然免疫介导的血细胞减少症(最常见的是中性粒细胞减少症，70-80%)和自身免疫性表现(最常见的是类风湿性关节炎[RA]，10-18%)通常与T-LGLL相关，但它通常表现为一种惰性疾病，可通过低剂量免疫抑制治疗来控制^3,4,5.

没有出现症状和共有的形态学和表型(CD3⁺CD8⁺CD45RA⁺CD57⁺)健康反应性细胞毒性T细胞的特征给CD8的诊断带来了挑战⁺白血病³。激活体细胞突变STAT3基因，CD8的标志⁺T-LGLL，发生在40-50%的患者身上^{6,7,8,9,10,11}，其中大多数变体(例如Y640F、D661V和D661Y)位于的SH2结构域中STAT3。尽管突变型和野生型患者的临床特征STAT3重叠、(严重)中性粒细胞减少症和自身免疫性表现在突变患者中更常见STAT3案例^{6,10,12,13,14}。然而，T-LGLL克隆型显示出持续的STAT3激活，而不管STAT3突变状态并抵抗FAS/FAS-L介导的凋亡，这可以通过上调的存活信号通路来解释，如MCL1、NF-κB和PI3K/AKT^15,16,17.

虽然慢性抗原刺激已被认为可驱动T-LGLL中的细胞毒性T细胞淋巴细胞增殖，但很少有关于非白血病人群在驱动或辅助T-LGLL发病中的作用的报道。B细胞活性改变(恶液质、高丙种球蛋白血症、免疫球蛋白产生增加，包括自身抗体)¹⁸多种细胞因子(例如，IL-15、TNF、IL-6)水平升高^19,20,21,22单核细胞表达IL-15可以在转基因小鼠中启动T-LGLL^19,20提示非白血病细胞在疾病中的可能作用。因为白血病细胞负荷的变化与治疗反应无关^12,23,24，多种症状可归因于细胞因子表达的升高³全面了解LGLL霸王龙背后的全部免疫系统是一个尚未满足的需求。

在这里，我们使用单细胞RNA和TCR测序(scRNA+TCRαβ-seq)将T-LGLL克隆型从它们的非白血病全部序列中分离出来，并与健康对照组、其他癌症和自身免疫性疾病进行比较，以确定T-LGLL在癌症、自身免疫性疾病和慢性炎症交叉中的位置。我们用bulk-RNA-seq、TCRβ-seq、流式细胞术、血清蛋白谱和体外验证扩展了我们的发现。我们的系统免疫学分析强调了克隆性和非克隆性免疫系统在LGLL霸王龙发病机制中的协同作用，并建议未来的治疗应着眼于削弱整个免疫系统，而不仅仅是LGLL霸王龙克隆(图。1a).

a该研究的示意图，左图表示不同的群组，右图突出显示了主要发现。bCD45的一致流形近似和投影(UMAP)表示⁺来自LGLL霸王龙的分选细胞(n= 11)和健康供体(n= 6)用scRNA+TCRαβ-seq分析的样品。不同的颜色表示聚类，检测到TCR的单元格以红色突出显示。c重新聚集的T细胞及其表型的UMAP图(左)。检测到TCR的细胞(右)分为单克隆(检测到TCR一次)、扩增(检测到TCR≥2次)和过度扩增(检测到TCR≥10次)克隆型。d与T-LGLL相比，来自过度扩增(TCR检测≥10次)克隆型的细胞比例(n= 11)和健康(n= 6).箱形图可视化的定义在方法部分数据可视化中进行了说明。P-数值通过双边曼-惠特尼检验计算得出。e来自面板的具有过度扩张的TCR的细胞的聚焦UMAPc没有重新聚类(左)。分别显示了T-LGLL患者和健康对照的细胞分布(右)。f差异表达的基因(P_形容词 < 0.05, calculated with a Bonferroni corrected t-检验)过度扩张的T-LGLL和健康克隆型之间的差异。标记了LGLL霸王龙的前30个差异表达基因和健康霸王龙的前10个差异表达基因。X-轴表示两种条件之间的平均log2倍变化，和Y-轴表示P_形容词-负对数10中的值。虚线表示P_形容词= 0.05.g使用与图中相同的UMAP表示法突出显示了选定的最高差异表达基因的比例表达e. h最高上调的GO途径(P_形容词 < 0.05, Benjamini-Hochberg corrected Fisher’s one-sided exact test on differentially expressed genes) in T-LGLL clonotypes in comparison to hyperexpanded clonotypes from healthy controls. Colors indicate whether the pathway can be associated to immune function by manual curation. iT-LGLL患者细胞毒性蛋白(GMZA、GZMB和PRF1)的蛋白水平表达(平均荧光强度，MFI)n= 6)和健康对照(n= 6)在流式细胞术队列中。P-用双侧曼-惠特尼检验计算值。jTCR刺激和非刺激条件下细胞因子(TNF和IFNγ)和脱粒标记物(CD107a和CD107b)的蛋白水平表达(log2倍MFI变化)。P-用双侧曼-惠特尼检验计算值。

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T-LGLL细胞显示出高细胞毒性和衰竭

为了获得LGLL霸王龙免疫系统的无监督视图，我们分析了超过150，000个流式细胞仪分选的CD45⁺血液单核细胞(补充图。1a)来自9个个体和6个年龄匹配的健康对照的11个T-LGLL样本，具有scRNA+TCRαβ-seq (10X基因组学，补充数据1).在整个数据集的初始聚类之后(图。1b，补充图。2a–d)，我们关注表达TCR的细胞，并对其进行重新聚类(图。1c，补充图。3a–d).尽管与克隆扩增的CD8相似⁺来自健康对照的t细胞(定义为至少两个具有相同TCR的细胞),克隆扩增的CD8⁺来自T-LGLL患者的T细胞也具有独特的T-LGLL特异性特征，并且它们在几种CD8中过度表达⁺t细胞群(补充图。3e).

正如预期的那样，与健康对照组相比，T-LGLL患者的样本克隆性更强，细胞扩增更多(P < 0.01, Mann-Whitney test) (Fig. 1d).这对于扩增克隆的选择阈值是不变的(补充图。4a–b).为了确定T-LGLL细胞和反应性细胞毒性克隆型之间的转录差异，我们从T-LGLL患者和健康对照中提取了过度扩增的克隆型(定义为至少10个具有相同TCR的细胞),并用之前计算的簇对它们进行了注释(图。1c，e).在健康对照中，过度扩增的细胞优先具有CD8⁺效应器记忆(CD8⁺ T_{东地中海(Eastern Mediterranean)})表现型(P < 0.0001, two-sided Fisher’s test), whereas in T-LGLL, the hyperexpanded cells were phenotypically more heterogeneous (Fig. 1e，补充图。5a).与来自健康人的过度扩增的反应性细胞相比，T-LGLL细胞中最高上调的基因包括多种细胞毒性相关转录物(GZMB, PRF1, KLRB1，KLRD1)，其中上调最显著的是NKG7，这在细胞毒性小泡的动员中是必不可少的²⁵(图。1f，补充数据2).另一个顶级差异表达(DE)基因包括常见的T-LGLL标记(四氯化碳, CCL5, FOS，FCGR3A [CD16]，IFNG)，抗凋亡基因(六月, DUSP1)，以及与T细胞衰竭相关的基因(LAG3和蒂吉特)(图。第一代).DE基因翻译成T-LGLL中最上调的通路是细胞杀伤、T细胞活化和对IFNγ信号通路的反应(图。1h，补充数据2).在健康对照中，包括其他细胞毒性基因(GNLY，LYZ)，形成钙卫蛋白的基因(S100A8和S100A9)，以及CD52，没有富集到任何免疫相关途径(图。1f，g，补充图。5b).

为了验证与反应性细胞相比，LGLL霸王龙具有更高的细胞毒性，我们对六个LGLL霸王龙和六个健康对照样本进行了流式细胞术分析(补充数据1).推定的T-LGLL克隆型(CD8⁺CD57⁺)被证实表达更多的细胞毒性蛋白(GZMA/GZMBP < 0.01, PRF1 P < 0.05, Mann-Whitney test) than the CD8⁺CD57⁺来自健康对照的t细胞(图。1i，补充图。6a).此外，CD8⁺CD57⁺T-LGLL细胞对抗CD3/CD28/CD49抗体介导的TCR刺激反应不佳。他们的脱粒反应(CD107a/b)缺乏(P < 0.01), and their cytokine production (TNF/IFNγ) in response to stimulation was diminished (P < 0.01) relative to the healthy CD8⁺CD57⁺细胞(图1j，补充图。6a).然而，在T-LGLL中TNF/IFNγ的基础水平较高(补充图。6b).因为先前已经报道了潜伏感染如巨细胞病毒的患者的T细胞中TNF/IFNγ水平较高²⁶我们假设这种现象暗示了抗原经历的T细胞衰竭，这与DE基因一致。

LGLL霸王龙克隆的表型特征

T-LGLL患者的TCR库从寡克隆到多克隆不等，免疫显性克隆型解释了总TCR库的7-50 %(图。2a).我们从其他CD8分子中分离出T-LGLL克隆型⁺通过手动处理来自(1) scTCRαβ-seq、(2) Vβ流式细胞术(存在免疫显性Vβ家族)和(3)的数据来分析t细胞STAT3扩增子测序(匹配变异等位基因频率STAT3突变或野生型STAT3用Vβ流式细胞仪数据，补充数据1).我们总共鉴定了18种LGLL霸王龙克隆型(9种突变型STAT3和九个野生型STAT3，补充数据3)，每个患者都有一到四个LGLL霸王龙克隆型(图。2a).两名患者有随访样本，在两个时间点观察到相同的T-LGLL克隆型(患者1有四个T-LGLL克隆型，患者2有一个)(图。2a).

aLGLL霸王龙克隆型的克隆扩张(n= 11)和一个代表性健康对照。每个方框表示用scTCRαβ-seq检测的样品中独特的T细胞克隆型，方框的大小对应于其在库占有中的频率。b面板中突出显示的所选18种LGLL霸王龙克隆型的转录组的UMAP图a从11个LGLL霸王龙样本中(n= 9名患者)。c在与图中相同的UMAP表示中突出显示的T-LGLL聚类之间的选定差异表达基因的比例表达b. d显示差异表达基因的比例表达的热图(P_形容词 < 0.05, calculated with Bonferroni corrected two-sided tT-LGLL表型群之间的差异。参考面板的集群(cl)号b标记在热图的右侧。e不同聚类中不同患者特异性T-LGLL克隆型的比例。每个条形代表一个单独的LGLL霸王龙克隆体。f估算和检测STAT3UMAP表示中出现的突变状态。推断出来的STAT3突变状态以克隆型方式获得，如图所示a(显示在左侧面板中)和检测到的STAT3使用变体检测工具Vartrix(显示在右边的面板中)从scRNA-seq数据中检索突变状态。g之间差异表达的基因(P_形容词 < 0.05, calculated with Bonferroni corrected two-sided t-测试)突变型和野生型STAT3LGLL霸王龙克隆体。每种情况的前20个基因被标记。X-轴表示两种条件之间的平均log2倍变化，和Y-轴表示P_形容词-负log10转换标度中的值。h最高上调的GO途径(P_形容词 < 0.05, Benjamini-Hochberg corrected Fisher’s one-sided exact test on differentially expressed genes) in wild-type STAT3与突变的相比STAT3克隆类型。i野生型中单个细胞的细胞毒性评分STAT3克隆与突变的比较STAT3scRNA-seq中的克隆。P-数值通过双边曼-惠特尼检验计算得出。j来自10个突变型和5个野生型的批量RNA测序数据的主成分分析(PCA)图STAT3T-LGLL患者和5名健康供体的CD8⁺-分类的T细胞。k野生型的细胞毒性评分STAT3患者(n= 5)相比之下STAT3突变的(n= 10)bulk-RNA-seq验证队列中患者的得分。P-用双侧Kruskal-Wallis检验计算值。

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属于T-LGLL克隆型的细胞的重新聚类鉴定了七种不同的转录T-LGLL表型(图。2b–d，补充图。7a–b).每个LGLL霸王龙克隆型都存在于不止一个集群中(图。2e).最大的一组，上调了T-LGLL标记FCGR3A (CD16)和四氯化碳和衰竭标记LAG3，TIGIT，以及毒药，是大多数克隆型的优势表型(13/18，72.2%)(图。2c–e，补充数据2).其他T-LGLL表型包括上调的效应子簇KLRB1, IL32，以及火器局表达(聚类1)；高细胞毒性簇(簇2)；记忆样簇(簇3)；和具有上调的优先产生细胞因子的簇干扰素和三氯化碳(第4组)。在通路分析中，4/7 (57.14%)的簇(簇0、3、4和6)具有上调的NF-kB活化，而簇3和6表现出对IFNγ的显著反应(图。2d，补充数据2).聚类0、3和4显示上调STAT3风景园林中的转录因子调控网络²⁷分析(补充图。7c–d).

野生型STAT3LGLL霸王龙克隆比突变克隆的细胞毒性更强

值得注意的是，STAT3从scTCRαβ-seq和扩增子测序数据估算的突变型和野生型克隆型在降维空间中分别进行部分分组(图。2f).来验证我们的人工推断STAT3状态，我们分析了来自scRNA-seq数据的脱靶读数，并鉴定了83个表达突变的细胞STAT3和200个表达野生型的细胞STAT3(图。2f，补充图。8a)。STAT3表达Y640F、S614R和D661Y突变的细胞富集于。CD52⁺记忆类簇3(P < 0.001, two-sided Fisher’s exact test), whereas the wild-type STAT3细胞富集在细胞毒性簇2(P < 0.0001). The largest cluster (cluster 0) contained both mutated and wild-type STAT3细胞。

DE基因和通路分析表明，野生型STAT3与突变的相比，细胞更加活跃，细胞毒性增强STAT3细胞。野生型的顶级基因STAT3包括细胞颗粒溶素, KLRG1，以及CD5，最上调的途径包括T细胞激活、上调的TCR信号传导和对IFNγ的反应(图。2g，h，补充数据2).此外，野生型STAT3T-LGLL克隆型也显示了较高的细胞毒性评分²⁸ (P < 0.0001, Mann-Whitney test) and a lower exhaustion score (P < 0.0001) than the mutated STAT3T-LGLL克隆型(图。2i，补充图。8b).相反，突变基因中上调的基因STAT3克隆型包括与T细胞存活相关的基因(常备军, KLF2)和细胞因子信号(三氯化碳, CCL4L2, IL2RG)，最高上调的通路与蛋白质翻译和对I型干扰素(IFNα，IFNβ)的反应相关，尽管在P-数值调整(补充图8c).

为了验证突变型和野生型之间的差异STAT3T-LGLLs，我们分析了额外的变异患者STAT3 (n= 10)和野生型STAT3 (n= 5) CD8⁺T-LGLL和CD8⁺来自健康供体的t细胞(n= 5)与批量RNA-序列(补充数据1).批量RNA-seq数据证实了野生型STAT3从突变株中分离出样本STAT3通过主成分2 (PC2)在降维空间中的那些解释了15.85%的方差(图。2j).批量RNA-seq数据也验证了CD8更高的细胞毒性分数⁺野生型t细胞STAT3患者与变异的相比STAT3患者(P < 0.05, Mann-Whitney test) (Fig. 2k).

白血病和非白血病TCR在结构上有相似之处

尽管缺乏直接证据，但通常假设LGLL霸王龙克隆来自抗原特异性免疫反应³。由于T-LGLL克隆型的潜在抗原特异性仍然未知，我们结合了以前的TCRβ-seq分析的T-LGLL克隆型^24,29连同我们用scTCRαβ-seq分析的样品(n= 11)，来自CD8的TCRβ-序列⁺分类样本(n= 8)，以及从bulk-RNA-seq推断的TCRαβs(n= 15)数据(补充数据1)以形成来自170名患者的199个LGLL霸王龙克隆的最大描述数据集(补充数据3).通过基因分型或推断HLA类型³⁰根据scRNA-seq和bulk-RNA-seq数据，我们能够确定31%克隆型(62/199)的HLA类型，69% (43/62)是HLA-A*02 +。所有的T-LGLL克隆型仅限于个别患者，GLIPH2没有鉴定出结构氨基酸水平的相似性³¹，即使分析只集中在43个HLA-A*02 + T-LGLL克隆上。这表明缺乏驱动LGLL霸王龙克隆扩增的共有靶抗原。

接下来，我们假设，尽管患者之间没有共享抗原，但非白血病克隆型可以在个体患者中靶向相同的诱导抗原，这将被观察为白血病和非白血病克隆型之间共享的TCR基序。对CD8进行迭代GLIPH2分析⁺ (n= 8)和单核细胞(MNC)分类(n= 17) TCRβ-seq患者样本表明，在72%的T-LGLL患者中，白血病T-LGLL克隆确实与其非白血病克隆具有氨基酸水平的相似性(6/8 CD8⁺和12/17 MNC分选的样品。3a，b，补充图。9，补充数据3).为了避免由于测序深度的差异而产生的偏差，在分析前将样品二次取样至相同的读取深度(每个样品30，000次读取)。在排除白血病克隆并仅将非白血病TCR二次取样至每个样品30，000个读数后，也获得了类似的结果(补充图。10a，补充数据3).这些发现表明，大多数白血病T-LGLL克隆型可能靶向与它们的非白血病库的克隆型相同的抗原，因此，我们称它们为抗原驱动的克隆型。

a网络图显示了三名LGLL霸王龙患者的抗原驱动克隆型。抗原驱动表示T-LGLL克隆与其非白血病库共享氨基酸水平的相似性。每个点(一个节点)是一个TCR克隆型，具有共享氨基酸水平相似性的克隆型由一条线(一条边)连接。The T细胞克隆用蓝色突出显示，非白血病克隆用红色突出显示。每个网络图下方显示的是单个患者的部分GLIPH2结果，TCRs上的颜色编码相同。额外的LGLL霸王龙病例见补充图。9. bT-LGLL(单核细胞[MNC])分类中抗原驱动的存在(即最大的克隆型是否与TCR库的其余部分具有共享的氨基酸水平相似性)n= 17，CD8⁺-已分类n= 8)，从血液中取样的转移性黑色素瘤(SKCM，n= 29)、类风湿性关节炎(RA、n= 32)，和健康对照(HC，MNC分类n= 785，CD8⁺-已分类n= 38).T-LGLL患者比其他条件下的患者具有更多抗原驱动的病例(P < 0.05, Fisher’s one-sided exact test). All samples were subsampled to the same read-depth (30,000 reads per sample). Results where the T-LGLL clone was excluded before downsampling and in which the subsampling was only done for the non-leukemic library are shown in the Supplementary Fig. 10a. c变异后的比例(n= 6)和野生型STAT3患者(n= 6)，其中在MNC队列中检测到抗原驱动的或没有抗原驱动的克隆型。d抗原驱动和非抗原驱动的T-LGLL克隆型在多个时间点的进化。单独的线对应于单独的T-LGLL克隆型，而加粗的线表示中间值。P-数值通过双边曼-惠特尼检验计算得出。e流式细胞术分析中国汉族人群的Vβ谱和变异等位基因频率(VAF)STAT3Y640F克隆(位于收缩的Vβ1克隆中)用于证明患者1中的T-LGLL克隆动力学(克隆漂移)。fUMAP代表八国集团⁺来自两个不同时间点的患者1的t细胞。左图突出显示了不同的聚类，叠加的线对应于用伪时间算法Slingshot计算的预测成熟轨迹(伪时间)。中间的面板显示了扩展和收缩的克隆。右图突出显示了T-LGLL克隆型中先前定义的细胞毒性评分。

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为了了解抗原驱动是否仅限于T-LGLL，我们使用RA患者的TCRβ-seq样本进行了类似的分析³² (n= 45)，从血液中取样的转移性黑素瘤³³(SKCM，n= 29)，和健康对照(CD8⁺分类的³², n= 38;跨国公司分类n= 785³⁴)(补充数据1)具有相似的子采样。抗原驱动在LGLL霸王龙中最为普遍(P < 0.05, two-sided Fisher’s exact test) and the least seen in healthy controls (Fig. 3b，补充数据4).抗原驱动的克隆型在突变的(n= 6)和野生型STAT3患者(n= 6)成相等的比例(图。3c).

我们接下来询问在T-LGLL中引起这些多克隆反应的抗原是否是由通常遇到的抗原表位引起的。不到一半(74/199，37.19%)的T-LGLL克隆型在健康人(n= 785) TCRβ剧目³⁴，他们解释了不到1%的健康曲目(补充图。10b，c).为了控制HLA基因型的影响，我们还将我们的分析局限于43个已知HLA-A*02的T-LGLL克隆型⁺并且只在HLA-A*02中搜索它们⁺健康捐赠者(n= 294).44.2% (19/43)的克隆型被发现至少一次，也是在低频率(补充图。10d，补充数据3).

有趣的是，抗原驱动的克隆型在健康对照组中观察到的频率更高n= 785) TCRβ比非抗原驱动的克隆型(P < 0.01, Kruskal-Wallis test, Supplementary Fig. 10e)，表明抗原驱动的克隆型可以识别常见的抗原。因此，我们用有监督的机器学习方法TCRGP预测了T-LGLL克隆型的抗原特异性³⁵针对CMV、EBV、甲型流感和HSV2常见的病毒表位。预测199个T-LGLL克隆型中只有2个(1.0 %)识别这些抗原，并且两个克隆型都靶向CMV pp65表位(补充数据3).由于TCRGP模型已经使用来自HLA-A*02供体的数据进行了训练，我们接下来只关注在HLA-A*02+患者中检测到的43种T-LGLL克隆型。HLA-A*02+阳性(n= 43)或HLA-A*02阴性(n= 19)患者被预测识别这些病毒(补充数据1和3).预测靶向CMV pp65的两个TCR来自HLA分型不明确的患者。总的来说，这些结果表明这四种病毒不含有LGLL T-的主要驱动抗原。

我们接下来研究了一组LGLL霸王龙患者，从这些患者中可以获得随访样本²⁴ (n= 17，38个样本)。我们注意到，同一患者可能同时具有抗原驱动和非驱动克隆，并且在随访期间，具有抗原驱动的克隆型大于非驱动的克隆型(P < 0.05, Mann-Whitney test, Fig. 三维（three dimension的缩写），补充图。10f)表明抗原驱动可能为克隆提供生长优势。

为了进一步理解抗原驱动和非驱动克隆的进化，我们研究了来自具有两种类型克隆的患者(患者1)的样品。该分析使用了相隔七年(2011年至2018年)收集的三份外周血样。尽管患者的T-LGLL病没有得到治疗，但占主导地位的STAT3不是抗原驱动的突变克隆(78% → 10%)被抗原驱动的替代STAT3野生型克隆(5% → 24%)携带不同的TCRαβ(图。3e、f，补充图。11a–e).非抗原驱动的STAT3突变的和抗原驱动的STAT3野生型克隆在表型上是不同的，并且可能有两个不同的成熟终点，如通过弹弓轨迹分析所表明的³⁶(图。3f).抗原驱动的野生型STAT3克隆比收缩更具细胞毒性STAT3突变克隆(图。3f，补充图。11a–e).扩展克隆中的顶级DE基因包括GZMH, 颗粒溶素，以及FCGR3A (CD16)并且克隆比缩小的克隆具有更高的细胞毒性分数(P < 0.0001, Mann-Whitney test, Fig. 3f，补充图。11d，补充数据2).相反，在STAT3突变的收缩克隆呈现减毒的CD8⁺ T_{东地中海(Eastern Mediterranean)}以表达为特征的表型GZMK并被上调SOCS1和SOCS3，已知其抑制JAK-STAT信号传导¹⁹.

总之，我们的结果表明，大多数，但不是全部，T-LGLL克隆型可能起源于最初的多克隆抗原反应。此外，抗原驱动的克隆型比非驱动的T-LGLL克隆型更大，并且通常表现出更强的细胞毒性表型。

在T-LGLL中，非白血病T细胞群是成熟的和克隆的

在发现克隆性和非克隆性免疫细胞库可能通过抗原偏好相联系后，我们试图详细研究T-LGLL中非白血病免疫细胞群的表型。由于T-LGLL克隆型的存在使免疫系统产生偏见，我们从scRNA+TCRαβ-seq数据中去除了克隆扩增的T-LGLL细胞，并将其与来自实体癌的类似数据进行比较³⁷ (n= 3)，血液癌症³⁸ (n= 8)，和健康对照(n= 6)(补充数据)1).聚类后(图4a，补充图。12a–c)，我们观察到，与其他癌症相比，常规树突细胞(CDC)的比例(P < 0.01 and P_形容词= 0.052，Benjamini-Hochberg校正的Mann-Whitney检验)和幼稚B细胞(P < 0.05 and P_形容词= 0.16)和成熟CD4的比例降低⁺ T_{东地中海(Eastern Mediterranean)}-细胞(集群2和13，两者P < 0.01 and P_形容词= 0.052)在LGLL霸王龙中有所增加(图4b，补充图。13a–b).当仅包括患有血液癌症的患者(n= 8)，CD4⁺ T_{东地中海(Eastern Mediterranean)}T-LGLL中的细胞仍然显著升高(图。4b).当与健康对照相比时，获得了类似的结果(n= 6，补充图。13c，d).

a非白血病CD45的UMAP表现⁺来自11个T-LGLL、6个健康、4个慢性粒细胞白血病、4个CLL、2个肾细胞癌和1个非小细胞肺癌样本的分选细胞，采用10X技术从外周血中提取，其中不同的颜色表示聚类。显示每个组群的重叠点的密度估计显示在右侧。b差异丰富的非白血病群集(来自图片a)T-LGLL患者之间(n= 9)和其他癌症患者(n= 11，上图)和T-LGLL以及血癌(n= 8，下面板)。水平线表示P= 0.05，根据双侧曼-惠特尼检验计算得出。c成熟效应记忆CD4的百分比⁺CD57⁺CD4细胞以外的细胞⁺LGLL霸王龙体内的T细胞(n= 6)与健康对照相比(n= 6)在流式细胞术队列中。P-用双侧曼-惠特尼检验计算值。d增殖CD4的百分比⁺CD4细胞外的t细胞⁺流式细胞术队列中T-LGLL患者与健康对照组相比，在TCR结扎或TLR刺激后，用CFSE稀释法测量T细胞。P-用双侧曼-惠特尼检验计算值。e左图:CD8的克隆性指数(Gini，越高表示克隆越多)⁺LGLL霸王龙的分类种群(n= 10)、类风湿性关节炎(n= 32)，和健康对照(n= 38)使用TCRβ-seq进行分析。中图:T-LGLL患者单核细胞(MNC)样品的非白血病TCR库的克隆性指数(n= 38)和健康对照(n= 785).右图:2005年非白血病TCR-MNC样本库的克隆性指数STAT3突变(mt)(n = 26)和野生型(wt)(n= 39)患者。P-用双侧曼-惠特尼检验计算值。

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用流式细胞仪分析的患者队列证实，T-LGLL患者具有明显更高百分比的成熟终末分化抗原经历CD4⁺CD57⁺t细胞^39,40当与健康对照相比时(P < 0.05, Mann-Whitney test, Fig. 4c，补充图。13e–g).来支持CD4的成熟⁺在T-LGLL的T细胞中，我们注意到总CD4的增殖能力⁺在TCR连接和TLR刺激后，以羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)稀释度测量，T-LGLL中的T细胞区室与健康对照相比减少(P < 0.05, Fig. 4d，补充图。13f).

除了增加T细胞的成熟，抗原驱动的过程增加了T细胞的克隆能力。因此，我们比较了非白血病CD8的克隆能力⁺T-LGLL中的T细胞转化为CD8⁺分类健康和类风湿性关节炎样本^24,32发现非白血病CD8⁺与类风湿性关节炎患者相比，T-LGLL患者的T细胞具有更有限的TCR功能(P < 0.01, Mann-Whitney test) and healthy controls (P < 0.05), latter of which was validated in the MNC-cohort (P < 0.0001, Fig. 4e).此外，野生型的非白血病储备STAT3病人比突变的病人更容易克隆STAT3患者(P < 0.0001) (Fig. 4e).

干扰素γ驱动非白血病免疫细胞库的激活

除了细胞丰度的变化，与其他癌症患者和健康对照相比，scRNA-seq还显示了T-LGLL中不同非白血病亚群的激活。例如，不同细胞因子的表达(CCL2/3/4/5)、共刺激基因(CD27，TNFRSF4 [HVEM]，TNFRSF14 [OX40]，TNFRSF25 [DR3])，以及IFNγ应答基因(例如，B2M, TAP1与健康对照相比，HLA分子)在不同的非白血病NK细胞、单核细胞和B细胞群中上调(图。5a)，其他癌症(补充图。14a)，以及血液癌症患者(补充图14b，补充数据2).值得注意的是，不同细胞毒性基因的表达(GZMA/B/H, PRF1, NKG7)在非白血病CD8中上调⁺，CD4⁺和NK细胞簇。非白血病T细胞的表型在流式细胞术队列中得到验证，其中CD8⁺CD57⁻和总CD4⁺LGLL霸王龙种群表达了较高水平的GZMA/B(P < 0.01 for CD8⁺CD57⁻和CD4⁺曼-惠特尼检验)和PRF1(P < 0.01 for CD8⁺CD57⁻和CD4⁺)比健康(图。5b).

a选择的差异表达基因的表达(P_形容词 < 0.05, calculated with Bonferroni corrected two-sided t-测试)根据它们在非白血病CD45⁺来自T-LGLL患者的分选细胞(n= 9)和健康对照(n= 6).数值表示为log2倍变化(log2fc)。b左:CD8中细胞毒性蛋白GZMA/B和PRF1的蛋白水平表达(MFI平均荧光强度)⁺CD57⁻LGLL霸王龙患者体内的细胞(n= 6)和健康对照(n= 6).右图:GZMA/B和PRF1的比例⁺CD4抗艾滋病药（Cluster of Differentiation 4）⁺流式细胞术队列中的细胞。P-用双边曼-惠特尼检验计算的值。c上调的标志类通路(P_形容词 < 0.05, Benjamini-Hochberg corrected Fisher’s one-sided exact test on differentially expressed genes) in non-leukemic cells from T-LGLL (n= 9)与健康(n= 6).dT-LGLL患者不同免疫亚群中IFNγ应答模块评分的中值表达(n= 9)，健康对照(n= 6)，其他癌症患者(n= 11).T-LGLL样本富含IFNγ高簇(P < 0.05, Fisher’s one-sided exact test). Clustering was performed with Ward’s linkage. e左:的缩放表达式干扰素在白血病(红色)和非白血病(绿色)人群中。P-数值通过双边曼-惠特尼检验计算得出。右图:的缩放表达式干扰素在不同的白血病(红色)和非白血病(绿色)人群中。集群编号参见图。2b(白血病群集)和图。4a(非白血病集群)。

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为了了解LGLL霸王龙体内驱动免疫激活的途径，我们在LGLL霸王龙患者、其他癌症患者和健康人群中进行了途径分析。T-LGLL中最上调的途径包括IFNγ-应答(在12/16个亚群中相对于其他癌症上调，16/17相对于健康，9/15相对于其他血液癌症)，IFNα-应答(9/16相对于其他癌症，15/17相对于健康，8/15相对于其他血液癌症)，和NFκB (11/16相对于其他癌症，0/17相对于健康，4/15相对于其他血液癌症)途径(图。5c，补充图。14c，d).

我们关注IFNγ反应，因为它是所有比较中最上调的途径之一，并通过计算IFNγ反应模块得分来量化其效果⁴¹在个体患者的所有免疫亚群中。最强的IFNγ反应见于不同的髓细胞亚群(CD16⁺单核细胞，CD16⁻单核细胞、CDC)、NK细胞和CD8⁺ T_{东地中海(Eastern Mediterranean)}细胞(图5d).在无监督聚类中，根据样品的IFNγ反应分数，将样品分成高IFNγ和低IFNγ两组。来自T-LGLL组的样本被富集到高IFNγ组(P < 0.05, Fisher’s one-sided exact test), confirming that IFNγ response is more strongly activated in T-LGLL than in other cancers. A similar analysis with the NF-κB pathway did not show enrichment of T-LGLL samples (Supplementary Fig. 14e).有趣的是，T-LGLL细胞表达更多的干扰素比非白血病细胞(P < 0.0001, Mann-Whitney), where the highest expression was seen in cytokine-secreting T-LGLL cluster 4 (Fig. 5e).

LGLL霸王龙克隆显示出预测的细胞间相互作用量增加

为了进一步了解细胞因子作为T-LGLL中白血病和非白血病区室之间免疫反应的介质的功能，我们重新分析了9名T-LGLL患者和8名健康对照者的血浆细胞因子谱⁴²(补充数据1).在T-LGLL患者中，多种细胞因子，包括IFNγ诱导的细胞因子(CXCL10，CXCL11)，JAK-STAT通路激活细胞因子(IL-6，IL-10，IL-15RA)和炎症趋化因子(CCL3，CCL4，MCP1)升高(图。6a).然而，根据以前的出版物^20,21在T-LGLL中，IFNγ水平没有升高。血浆细胞因子数据与scRNA-seq的结合显示大多数(11/17，64.7%)上调的细胞因子主要由单核细胞或CDC表达(例如，CCL2/3/7, CXCL10/11，IL15RA)而不是T-LGLL克隆型(图6b，补充图。15a).相反，17种细胞因子中有6种上调(例如，四氯化碳, TNFRSF14 [疱疹病毒侵入介体])和干扰素被LGLL霸王龙克隆优先表达。

aT-LGLL患者之间差异表达(未经调整的双侧Mann-Whitney检验)的血浆细胞因子(n= 9)和健康对照(n= 8)，其中细胞因子P < 0.05 (horizontal line) are labeled. bT-LGLL患者的非白血病和白血病免疫细胞亚群中的scRNA-seq数据中差异表达的细胞因子的中值表达(聚类数参见图。4a).热图聚类采用沃德连锁法。对每列的值进行缩放。c不同单核细胞群中T-LGLL的HLA II类模块评分(见图。4a)与健康对照和其他疾病群组进行比较。P-用双侧Kruskal-Wallis检验计算值。d粘附珠(荧光微球)的CD16的比例⁺还有CD16⁺CD14^暗淡的T-LGLL患者的单核细胞(n= 6)与健康对照相比(n= 6).P-用曼-惠特尼检验计算值。e重要的配体-受体相互作用的数量(P < 0.05, CellPhoneDB permutation test) between T-LGLL clonotypes (as shown in Fig. 2e)或来自健康对照和不同非白血病免疫细胞亚群的最大扩展的超扩展克隆型(> 50 TCRs)，计算CellPhoneDB。用沃德连锁法进行聚类。从蓝色到红色的色阶标记了细胞类型之间预测的相互作用的数量。fT-LGLL克隆型与不同免疫亚群的显著配体-受体相互作用的数量。所示的受体-配体对是具有统计学意义的相互作用，被认为是共刺激或抑制作用。颜色表示与细胞类型相互作用的T-LGLL克隆型的数量。g左图:UMAP图显示了T-LGLL克隆型的分布，这些克隆型与它们的非白血病对应物有不同数量的相互作用。右图:所选的18个白血病T-LGLL克隆型的转录组的UMAP图如图。2b.

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除了作为最重要的细胞因子生产者，单核细胞也是在LGLL T细胞和其他条件下在DE基因分析中转录改变最大的亚群(首先，CD16⁺单核细胞；第四，CD16^-单核细胞)(补充图。15b–g).流式细胞术分析也证实尽管单核细胞的总数减少(P < 0.05, Mann-Whitney test), the distribution of different monocyte subsets was altered, and T-LGLL patients had a bigger proportion of CD16⁺单元格(P < 0.05, Supplementary Fig. 16a，b)出CD14⁺单核细胞。单核细胞群体中上调的DE基因包括多种HLA分子和经典清除受体(例如，CLEC10A, CD44, CLEC2B, CLEC9A, MRC1)，翻译成上调的HLA II类²⁸ (P < 0.0001, Kruskal-Wallis test) and scavenging scores (P < 0.0001, Fig. 6c，补充图。16c，补充数据2).为了分析单核细胞的抗原呈递功能，我们将血液MNCs与荧光微球一起孵育，发现粘附珠的CD14⁺CD16⁺和CD14^暗淡的CD16⁺与健康对照组相比，单核细胞在T-LGLL中增加(P < 0.05 Mann-Whitney test, Fig. 6d，补充图。16d)，这可能表明更高的清除潜力。

接下来，我们计算了配体-受体与手机的相互作用⁴³T-LGLL克隆型和其他免疫细胞之间的相互作用，并将其与来自健康对照的过度扩增的克隆型的相互作用组进行比较。相互作用组分析表明，与健康的过度扩增的克隆型相比，T-LGLL克隆型和其他免疫细胞之间的相互作用数量增加(图。6e).大部分差异可追溯到T-LGLL-单核细胞相互作用，许多预测的相互作用可归因于共刺激(例如，CD2–CD58, CD48–CD244, CLEC2B–KLRF1, 肿瘤坏死因子F14–TNFRSF14);虽然只有少数相互作用是抑制性的(例如，LGALS9–HAVCR2)(图。6f).基于配体-受体相互作用的数量，T-LGLL克隆型形成了三个集群:(1)强相互作用(相互作用的最高数量)，(2)相互作用，和(3)免疫独立(相互作用的最低数量)，这在T-LGLL克隆型的集中集群中也很明显(图。6g).免疫无关STAT3来自患者2的突变T-LGLL克隆型具有最低的相互作用次数，并且在1年的随访中，该克隆的大小和表型是稳定的(补充图。17a–e).

在这项研究中，scRNA+TCRαβ-seq的价值在于它在鉴定TCR序列限制性克隆扩增中的准确性。在其他非T细胞恶性肿瘤中，很少有类似的细胞特异性标记物，或者需要同时进行DNA测序来确定克隆细胞。利用scRNA+TCRαβ-seq，我们能够对寡核苷酸和多克隆CD8的扩增T-LGLL克隆进行详细和精确的表征⁺T细胞库，并显示了强烈的抗原驱动的免疫反应的证据，这种反应形成了T-LGLL的整个免疫细胞库。

已知T-LGLL克隆型与其健康的反应性对应物相比，过表达细胞毒性和T细胞活化相关基因^44,45。在这里，我们还发现了与疲劳相关的基因，比如LAG3和蒂吉特，是健康对照中T-LGLL和过度扩增细胞之间最上调的基因之一，但不是以前发现的PDCD1 (PD1)和HAVCR2 (TIM-3)^44,45。我们的体外验证表明，TCR连接不能触发T-LGLL克隆型的正常脱粒和细胞因子产生。这些发现可能部分解释了为什么T-LGLL通常仅表现为中度淋巴细胞增多，尽管高度活化，但很少发展为更具侵袭性(增殖性)的疾病STAT3和STAT5B突变^46,47.

我们的数据显示了患者间和患者内的异质性，具有相同TCR重排的T-LGLL克隆可能具有多种表型。重要的是CD16⁺ 四氯化碳⁺ LAG3⁺ 毒药⁺表型被确定为大多数克隆型(13/18，72.2%)中的显性表型，并见于突变型或野生型患者STAT3，进一步统一了这些疾病，除了著名的共享JAK-STAT活动¹⁹。因为这种表型明显不同于过度扩增的CD8的效应记忆表型⁺t细胞，它可以帮助诊断过程，特别是在野生型的区别STAT3来自反应过程的案例。然而，发现野生型STAT3克隆型比突变型具有更高的T细胞活性、细胞毒性和非白血病克隆性STAT3，这在以前的流式细胞仪出版物中是没有的¹⁴，提出变异了STAT3野生型LGLL霸王龙STAT3T-LGLL和反应过程产生于不同的病因。

LGLL霸王龙体内的激发抗原仍然难以捉摸。我们用当前最佳实践的生物信息学工具以非监督和监督的方式分析了TCR^31,35,48但是没有发现共同的假定的、已知的或未知的抗原的证据，甚至在个体患者中也没有。这些分析的明显局限性是，它们是独立于HLA-基因型进行的，或者只涉及来自具有HLA-A*02+背景的患者的T-LGLL克隆。不幸的是，先前发表的T-LGLL TCR数据集中没有包括所有患者的HLA信息²⁴。受监督的TCRGP工具已经证明优于其他类似的方法³⁵当所分析的TCR库的基因型已知时。然而，由于表位特异性TCR的训练数据有限，现有的TCR分析工具很可能无法捕获抗原特异性库的全部异质性，导致即使在HLA-A*02的情况下也出现假阴性⁺病人。然而，我们的结果表明，LGLL霸王龙患者的共同点可能不是抗原，而是支持LGLL霸王龙克隆型扩张和持续的环境、遗传和/或免疫因素。这些结果与高等的结果一致。⁴⁹，他们用scRNA+TCRαβ-seq分析了阿仑单抗治疗的T-LGLL患者，没有观察到针对已知抗原的共享T-LGLL克隆型或T-LGLL克隆型。

然而，我们的结果与LGLL霸王龙是由对抗原的异常反应驱动的说法并不矛盾。相反，在一项对HLA基因型不变的分析中，我们观察到超过一半(72%)的T-LGLL克隆型TCR与来自相同患者非白血病库的TCR具有结构相似性。我们来自抗原驱动的结果支持了LGLL霸王龙的抗原反应是多克隆或寡克隆的，而不是单克隆的观点。我们的结果与之前的数据一致STAT3突变发生在最初的克隆扩增之后，是一个巩固克隆优势的事件³。T-LGLL患者中抗原驱动的克隆型更大，它们可以与非抗原驱动的克隆同时出现。有趣的是，在一个有随访样本的病人身上，突变的STAT3克隆被细胞毒性更强野生型取代STAT3克隆。此外，非白血病CD8⁺和CD4⁺与其他癌症、类风湿性关节炎和健康对照相比，T-LGLL中的T细胞库更成熟、更具细胞毒性且克隆受限，这表明驱动抗原具有强大的免疫编辑能力。高通量表位MHC-TCR筛选工具的出现⁵⁰并且它们在T-LGLL中的使用将提供关于抗原特异性反应的宝贵信息。

除了非白血病CD8，还有其他发现⁺和CD4⁺T细胞，进一步支持了针对患者特异性抗原的异常寡克隆免疫反应作为T-LGLL中疾病诱导和进化驱动触发器的想法。我们注意到T-LGLL克隆型和单核细胞之间的共刺激细胞间相互作用增加，单核细胞的抗原呈递细胞功能增强。驱动这些差异的免疫因素是对IFNγ的反应，这在单核细胞群体中最为明显。这干扰素优先由T-LGLL克隆型表达，而不是由单核细胞表达，将白血病和非白血病细胞库连接成一个恶性循环。由于在我们的数据中只发现了克隆漂移的偶然情况，我们无法确定非白血病免疫系统是否导致了T细胞克隆型向LGLL T细胞克隆型的转化，反之亦然，这需要在未来的研究中解决。

目前T-LGLL的治疗方法，包括皮质类固醇、甲氨蝶呤和环孢素A，效果不令人满意，因为超过一半的患者最终会复发¹⁸提出了对联合或序贯疗法的需求。目前的补救疗法包括去除T细胞的抗CD52(阿仑单抗)和抗CD3(抗胸腺细胞球蛋白)疗法^3,51,52。这些方法也针对非T-LGLL克隆，这可以解释为什么在阿仑珠单抗治疗后TCR谱没有多样化⁴⁹以及为什么治疗反应与STAT3突变状态或克隆负荷²³。此外，削弱整个免疫系统的治疗已经显示出令人鼓舞的结果，包括一线治疗(环磷酰胺，> 70%的反应率)⁵³和补救疗法(托法替尼，一种JAK3抑制剂，缓解率> 60%)⁵⁴.

总之，我们的研究强调了整个免疫细胞库，包括过度扩增的CD8⁺T-LGLL细胞，非白血病CD8⁺细胞，CD4⁺细胞和单核细胞对CD8有贡献⁺T-LGLL病表型。异常的抗原驱动的免疫反应形成了所有的组成部分，并维持了过度扩张的T-LGLL克隆型的持久性。我们的结果表明，未来的治疗不仅应该针对T-LGLL克隆型，还应该针对其他免疫细胞类型及其相互作用，以改变T-LGLL患者的结果。