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CD8中RNA聚合酶ⅱ暂停因子NELF+t细胞促进抗肿瘤免疫

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发表时间:2022-04-25 12:06作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

t细胞因子1 (TCF1)是记忆和干细胞样CD8所必需的+t细胞功能。TCF1如何与其他转录因子合作来调节转录仍不清楚。在这里,我们显示负延伸因子(NELF),一种RNA聚合酶II (Pol II)暂停因子,在T细胞对癌症的反应中与TCF1协同作用。删除鼠标Nelfb编码NELFB亚单位的,在成熟T淋巴细胞中削弱对原发性肿瘤攻击和肿瘤抗原介导的疫苗接种的免疫反应。Nelfb缺失导致记忆T细胞群体更加衰竭和减少,而其异位表达增强了抗肿瘤免疫和嵌合抗原受体T细胞免疫疗法的功效。从机制上讲,NELF与TCF1相关,并优先被TCF1靶基因的增强子和启动子募集。Nelfb消融减少了这些TCF1相关位点的Pol II暂停和染色质可及性。因此,我们的发现表明NELF在抗肿瘤免疫中具有重要的限速功能。

介绍

t细胞在遇到抗原、共刺激信号和炎性细胞因子后经历快速增殖并获得效应子功能1,2,3。短命效应细胞在清除外来抗原后经常经历凋亡。一小部分效应细胞会发育成长寿的记忆T细胞2。效应和记忆T细胞在控制病毒感染和肿瘤生长中起着关键作用。然而,与急性病毒感染不同,肿瘤抗原通常过量存在,从而诱导肿瘤反应性T细胞的衰竭表型4。衰竭的T细胞表现出多种抑制性受体的上调和多功能性的丧失,已经成为在抗癌免疫治疗中重振T细胞功能的主要目标3。尽管在过继细胞疗法和基于免疫检查点阻断的疗法中取得了临床成功5,6大多数患者仍然不能从这些免疫疗法中获益,部分原因是缺乏持久的肿瘤反应性记忆T细胞。

最近的研究报道了许多控制记忆T细胞分化的关键转录因子,包括TCF17,FOXO18,MYB9,BACH210和BATF311。特别是由该基因编码的TCF1蛋白TCF7,在调节T细胞发育中起关键作用12,差异化13、以及衰竭期间的效应子功能保持14,15。TCF1促进有利于记忆T细胞分化的染色质可及性16。同时,TCF1的缺失加剧了T细胞的衰竭,而增强的TCF1表达改善了T细胞的衰竭15,16。TCF1还通过促进抗凋亡因子BCL2来促进T细胞的长期存活15同时抑制促凋亡因子BIM16。TCF1+t细胞群在对免疫检查点封闭免疫疗法的反应中是至关重要的17。虽然TCF1在决定T细胞命运中的作用已经被很好地确定,但是对于在T细胞分化相关的转录程序中促进其功能的配偶体却知之甚少。

Pol II暂停在调节后生动物基因表达中起关键作用18,19,20。在分子水平上,启动子附近的Pol II暂停阻止了核小体的组装,从而维持了一个许可的染色质结构,用于未来对环境刺激的转录激活21。最近的研究也表明Pol II的暂停和释放在转录增强子中起作用22。NELFB是控制Pol II暂停的NELF复合体的四个亚单位之一23。小鼠遗传学研究表明,NELFB对早期胚胎发育是不可或缺的24和乳腺发育25。此外,NELF参与成年组织稳态的各个方面,包括心肌中的能量代谢26巨噬细胞的炎症反应27损伤后肌纤维修复28和保持接合处的完整性29。然而,NELF依赖性Pol II暂停在T细胞功能中的功能意义仍不清楚。

这里,我们定义一个CD8+t细胞cell在抗肿瘤免疫反应中的内在作用。使用组织特异性小鼠遗传模型,我们证明了CD8基因中的NELFB+t淋巴细胞对于抗肿瘤免疫非常重要。从机制上讲,NELF与TCF1相关,并促进染色质在TCF1结合的转录增强子和启动子处的可及性。我们进一步证实,在小鼠模型中,异位的NELFB表达增强了宿主抗肿瘤免疫以及CAR-T免疫疗法的疗效。

结果

Nelfb是抗肿瘤CD8所必需的+t细胞功能

为了研究NELF在成熟T细胞功能中的作用,我们删除了Nelfb以成熟的T细胞特异性方式杂交Nelfbf/f和远端Lck-Cre (dLck-Cre)小鼠品系。不像近端Lck-Cre系统,dLck-Cre仅在胸腺细胞阳性选择后被激活,因此对胸腺细胞发育的影响最小30,31。原代CD8细胞的NELFB蛋白水平显著降低+t细胞,但非CD8细胞没有+单元格,来自Nelfbf/f,dLck-Cre敲除(以下简称KO)小鼠对它们的Nelfbf/f副本(补充图。1a、b).与对照组相比,KO小鼠中其他三种NELF亚单位的水平也降低了Nelfbf/f控制(补充图。1b),与之前发现的四个NELF亚基的蛋白质稳定性相互依赖相一致32。KO小鼠的CD8百分比略低+CD4增加+t细胞比Nelfbf/f控制(补充图。1c).CD4细胞数量+亚群,包括幼稚细胞、中枢记忆细胞、效应记忆细胞和调节性T (Treg)细胞,在以下方面具有可比性Nelfbf/f和KO(补充图。1d,e).在CD8中+T细胞,幼稚T细胞的数量在Nelfbf/f和KO小鼠(补充图。1f).然而,与对照组相比,KO小鼠的中枢记忆和效应记忆T细胞数量显著减少Nelfbf/f小鼠(补充图。1f),这可能表明这些小鼠对环境抗原的反应有缺陷。

为了研究NELF在T细胞对肿瘤生长的反应中的作用,我们挑战了Nelfbf/f以及具有同系小鼠乳腺肿瘤细胞(E0771和AT-3)的KO小鼠。与对照组相比,KO组的肿瘤生长更旺盛Nelfbf/f主机(图1a–d).肿瘤浸润性淋巴细胞(til)包含的白细胞总数显著减少(图。1e)和CD8+t细胞(图。1f)的KO对Nelfbf/f荷瘤小鼠。此外,KO小鼠具有较小的效应记忆(图。第一代)和增殖性CD8+t细胞群体(图。1h).为了确定CD8的固有缺陷+来自KO小鼠的t细胞,我们过继转移CD8+t细胞来自Nelfbf/f或KO小鼠免疫缺陷Rag1−/−受体小鼠,随后用E0771肿瘤攻击嵌合小鼠。正如所料,接受Nelfbf/fCD8+与接受载体的t细胞相比,t细胞表现出强烈的抗肿瘤反应(图。1i,j).相反,过继转移的KO CD8+与对照组相比,t细胞没有赋予任何肿瘤抑制活性(图。1i,j).从具有KO CD8的嵌合小鼠收获的肿瘤+t细胞的总记忆和效应记忆CD8明显较小+人口与那些Nelfbf/fCD8+t细胞(图。1k,l).这些发现证明了CD8+NELF在抗肿瘤免疫中的t细胞固有功能。

图1:Nelfb对于CD8是必需的+t细胞固有的抗肿瘤功能。
figure 1

a, bE0771的生长曲线(a)和AT-3(b)肿瘤在Nelfbf/f还有KO老鼠。c, dE0771肿瘤重量(c)和图像(d)年收获时Nelfbf/f还有KO老鼠。eh中E0771肿瘤的TIL分析Nelfbf/f和KO小鼠:eCD45+(所有活细胞的百分比),fCD8+(% CD45+), g效应记忆CD44+CD62L(% CD8+), hKi67+(% CD8+), n= 5/组。i, jE0771肿瘤生长曲线(i)和重量(j)在Rag1−/−老鼠接受Nelfbf/f还是KO CD8+t细胞。k, l中E0771肿瘤的TIL分析Rag1−/−老鼠接受Nelfbf/f还是KO CD8+t细胞。kCD8+(% CD45+), l效应记忆CD44+CD62L(% CD8+); n= 5/组。数据以平均值SEM表示;学生的t-检验(针对两组)或单因素方差分析(针对三组或更多组)。使用双因素方差分析和多重比较来比较肿瘤曲线。使用双边测试。源数据作为源数据文件提供。

Nelfb缺失损害记忆T细胞回忆反应

记忆性T细胞反应对于介导疫苗接种的保护作用至关重要33,34。确定…的影响Nelfb在肿瘤抗原引发的疫苗接种过程中,我们选择了两种侵袭性的卵清蛋白(OVA)表达肿瘤模型:淋巴瘤E.G7-OVA和黑色素瘤B16-OVA(图。2a和补充图。2a).在这两种肿瘤模型中,未接种疫苗(非vac)的荷瘤KO小鼠的存活率往往低于其Nelfbf/f对应物,虽然差异没有统计学意义(图。2b和补充图。2b).这可能是因为强大的肿瘤生长超过了宿主的抗肿瘤免疫力。当小鼠用OVA蛋白接种,然后用肿瘤细胞攻击时,接种显著延长了两者的存活时间Nelfbf/f还有KO主持人。然而,疫苗接种显示出对肿瘤更强的保护作用Nelfbf/f比KO小鼠(p图中= 0.002。2b, p=补充图中的0.01。2b).此外,接种疫苗显著增加了CD8+t细胞丰度Nelfbf/f,但不包括KO,主机(图。2c),暗示着NelfbKO削弱记忆T细胞反应。

图2:NelfbT细胞的缺失削弱了对肿瘤抗原疫苗接种的记忆反应。
figure 2

a使用OVA蛋白然后用E.G7-OVA肿瘤攻击的疫苗接种程序方案。bE.G7-OVA荷瘤小鼠的存活曲线Nelfbf/f和接种或未接种的KO小鼠。cCD8+E.G7-OVA肿瘤浸润性CD45的百分比+细胞;n= 4/组。dB16肿瘤生长曲线Nelfbf/f和接种或未接种的KO小鼠;Nelfbf/f非真空(n= 4),Nelfbf/f真空(n= 7)、KO非真空(n= 6)、KO vac(n= 9);比较均值差异的单因素方差分析。使用双因素方差分析和多重比较来比较肿瘤曲线。源数据作为源数据文件提供。

为了确定NELF在记忆T细胞功能中的作用,我们接下来使用热灭活的B16肿瘤细胞作为基于已建立方案的疫苗35。与OVA介导的疫苗接种的发现一致,B16肿瘤的生长与未接种疫苗的相当Nelfbf/f和KO小鼠(图。2d).相比之下,疫苗接种提供了强大的生存优势Nelfbf/f,但在KO小鼠中没有(图。2d),进一步证实了NELF在记忆T细胞反应中的重要性。接种疫苗后,带有肿瘤Nelfbf/f宿主,而非KO宿主,CD8显著增加+脾脏中的T细胞丰度,以及脾脏和淋巴结中的中枢记忆T细胞(补充图。2c–e).总之,我们对肿瘤抗原启动的疫苗接种的多种模型的研究表明,NELF在促进肿瘤抗原启动的T细胞召回反应中起着关键作用。

NelfbKO导致CD8的功能缺陷+t细胞

为了进一步表征CD8+t细胞缺陷NelfbKO小鼠,我们试图确定细胞功能受NelfbT细胞受体(TCR)激活过程中的损失。羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记显示KO CD8+t细胞在体外TCR激活后不久(第1-4天)具有相对正常的增殖率,但在第5天表现出明显的增殖缺陷(图。3a和补充图。3a).这表明Nelfb缺失不可能直接损害TCR激活的细胞周期进入。另一方面,显着更多的KO CD8+t细胞经历了凋亡Nelfbf/fTCR激活后24小时出现的对应物(图。3b和补充图。3b).

图3:Nelfb缺失促进细胞凋亡和CD8的耗竭+t细胞。
figure 3

aCFSE的时间进程低的人口占总人口的百分比Nelfbf/f和KO CD8+体外培养的t细胞,n= 3/组。b凋亡细胞的百分比Nelfbf/f和KO CD8+抗CD3/CD28活化24小时后的t细胞,通过膜联蛋白V-APC/PI评估用于流式细胞术分析,n= 3/组。cTIM3时间进程的代表性流式细胞仪图+PD1+双阳性耗尽细胞Nelfbf/f和KO CD8+体外培养的t细胞。dfTIM3的百分比+ (d),PD1+ (e),以及PD1+TIM3+ (f)单元格内Nelfbf/f和KO CD8+体外培养的t细胞,n= 3/组。g肿瘤坏死因子α的流式细胞仪图+干扰素γ+双阳性多功能T细胞。h的百分比Nelfbf/f和KO CD8+体外培养10天后的t细胞,n= 3/组。数据以平均值±标准差表示;使用学生的来比较平均差异t-测试。使用双因素方差分析和多重比较来比较时间依赖性曲线。使用双边测试。源数据作为源数据文件提供。

白细胞介素2 (IL2)对活化T细胞的扩增至关重要,但也促进衰竭表型36。正如所料,在与IL2长时间体外孵育后,两者Nelfbf/f和KO CD8+t细胞逐渐增加免疫抑制受体PD1和TIM3的表达(图。3c–f).值得注意的是,PD1/TIM3单阳性或双阳性耗尽群体的增加幅度在KO组显著高于对照组Nelfbf/f细胞(图3c–f).多功能性的丧失是记忆干细胞数量减少和T细胞衰竭增加的标志37。延长的体外增殖也导致干扰素γ (IFNγ)和肿瘤坏死因子α (TNFα)双阳性、多功能KO T细胞的丰度显著低于对照组Nelfbf/f(图。3g,h和补充图。3c,d).总之,我们的数据强烈表明Nelfb消融会加剧CD8+体外扩增过程中的t细胞衰竭。

证实…的影响NelfbCD8上的缺失+t细胞功能,我们使用总CD8进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)+t细胞分离自Nelfbf/f还有KO老鼠。基于典型的标记基因表达模式,我们确定了四个主要的亚组——幼稚、记忆、衰竭和衰老人群(图。4a和补充图。4a).与…相比Nelfbf/fCD8+t细胞,KO样品具有较小的幼稚和记忆,但是具有较大的衰竭和衰老的细胞群(图。4b和补充图。4b–d).使用已建立的轨迹分析算法38,我们发现了两个从幼稚阶段开始的分化轨迹;一个导致精疲力竭阶段,另一个导致衰老阶段(图。4c).假时间是描述单个细胞从分化起始点沿着特定轨迹的定位的参数,因此代表了从初始分化阶段到终末分化阶段的分化程度39。分化轨迹的假时分析清楚地表明,对于衰竭和衰老的谱系,KO细胞的假时显著高于Nelfbf/f(图。4d).这表明KO细胞位于其分化起点的更下游,因此比Nelfbf/f细胞。总之,我们的数据支持NELF阻止CD8过早终末分化的观点+t细胞。

图4:Nelfb缺失促进CD8的终末分化+t细胞。
figure 4

atSNE图代表Nelfbf/f和KO CD8+从10月龄小鼠脾细胞中分离的t细胞。一只小鼠/基因型。b来自以下人群的个体亚群的百分比Nelfbf/f和KO CD8+t细胞;Nelfbf/f (n= 2412),KO(n= 1877);通过卡方检验评估频率。c通过轨迹分析定义了两个分化谱系。d两个分化谱系的伪时间定量Nelfbf/f和KO CD8+t细胞,Nelfbf/f (n= 2412),KO(n= 1877);双面学生的t-测试。方框的边界代表四分位数范围的第25和第75个百分点。方框内部的黑线代表数据的中位数。触须代表数据的最小值和最大值,方框外的黑点和触须代表异常值。源数据作为源数据文件提供。

优先依赖NELF的Pol II暂停在TCF1目标上

为了阐明NELF调节T细胞功能的分子机制,我们在原代小鼠CD8中进行了NELFB ChIP-seq+t细胞。对转录因子结合基序富集的无偏分析显示,NELFB染色质结合与TCF1的重叠最明显(图。5a)40。值得注意的是,NELFB ChIP-seq信号在TCF1靶的增强子和转录起始位点(TSS)都明显较高13,41对比非TCF1靶(图。5b).接下来,我们进行了主要的Pol II芯片测序Nelfbf/f和KO CD8+t细胞。我们使用Pol II暂停指数来评估Pol II的启动子近端富集程度,用D值来表示两个累积分布之间垂直距离的最大差异42,43(图。5c).在…里Nelfbf/fCD8+与非TCF1靶相比,t细胞TCF1靶具有显著更高的Pol II暂停指数(图。5c,D = 0.45736,p < 2.2e-16). NelfbKO在TCF1目标下更大程度地降低了Pol II暂停指数(D = 0.3172,p < 2.2e-16) than at non-TCF1 targets (D = 0.13387, p < 2.2e-16, Fig. 5c,补充图。5a).当分别分析增强剂和TSS时,Pol II结合的减少NelfbKO在TCF1靶比在TCF1非结合靶更明显(图。5d和补充图。5b).总之,我们的数据表明,NELF依赖的Pol II结合在初级CD8+t细胞优先与TCF1结合的调节区相关。

图5: NELF介导的Pol II暂停于独联体TCF1靶基因的调节元件。
figure 5

a野生型CD8基因序列的富集分析+t细胞。b野生型CD8的TCF1和非TCF1靶的增强子和TSS区的NELFB结合信号+t细胞。c中TCF1和非TCF1目标的暂停指数的累积曲线Nelfbf/f和KO CD8+t细胞。垂直虚线表示两个累积分布之间垂直距离的最大差异。dTCF1或非TCF1靶的增强子和TSS区域的Pol II信号Nelfbf/f和KO CD8+t细胞。方框的边界代表四分位数范围的第25和第75个百分点。方框内部的黑线代表数据的中位数。触须代表数据的最小值和最大值,方框外的黑点和触须代表异常值。Violin图通过具有连续性校正的双边Wilcoxon秩和检验进行评估。对于Pol II芯片序列分析,n= 2个生物复本/组。

NELF调节TCF1靶的染色质可及性

Pol II在启动子和增强子上的积累与染色质的可及性有关21,44。因此,我们使用了转座酶可及的染色质测序分析(ATAC序列)来评估初级幼稚细胞中总染色质开放度Nelfbf/f和KO CD8+t细胞。主成分分析表明Nelfbf/f和KO具有不同的染色质开放状态(补充图。5c).四分之三的差异可及区域显示染色质开放度降低Nelfb删除(补充图5d),表明NELF在促进染色质可及性中的作用。使人联想到它在NELFB染色质结合区的富集(图。5a),TCF1结合是KO受损可及性的染色质区域中最显著富集的基序(图。6a). NelfbKO触发的染色质开放度降低在TCF1靶比非TCF1靶发生得更多,此外,KO效应在增强子中比在TCF1靶的TSS中更明显(图。6b和补充图。5e, 6a、b).这些数据支持这样一种观点,即NELF在幼稚的CD8+t细胞优先促进染色质在TSS的可及性,并在更大程度上促进TCF1靶的增强。

图6: NELF与TCF1相关,并促进TCF靶基因的染色质可及性和转录程序。
figure 6

a在KO与中使用较少开放的染色质区域进行基序分析Nelfbf/fCD8+t细胞;二项式检验。bKO中较少开放的区域与Nelfbf/fCD8+细胞(占相应区域总数的百分比)。对于ATAC序列分析,n= 2个生物复本/组。c用SDS-PAGE对生物素化蛋白进行蛋白质印迹。NELFE和GAPDH分别作为阳性和阴性对照。实验独立重复三次,结果相似。d热图显示在激活后的KO与对照中具有TCF1结合和降低的ATAC序列和RNA序列信号的基因Nelfbf/fCD8+t细胞。eKO CD8+细胞与TCF7缺乏、T细胞衰竭和衰老的信号相关Nelfbf/fCD8+细胞与记忆T细胞和脂肪酸代谢的信号有关。对于RNA-seq分析,n= 3个生物复本/组。f NELFB高的人黑色素瘤til与记忆T细胞和脂肪酸代谢的信号有关。基于经验表型的排列测试用于基因集合富集分析。源数据作为源数据文件提供。

NELF染色质结合的倾向及其对TCF1靶的作用促使我们辨别这两种转录因子之间的物理关系。TCF1蛋白水平在幼稚时具有可比性Nelfbf/f和KO CD8+t细胞(补充图。6c),表明NELF不太可能通过调节其表达来影响TCF1的目标。使用邻近标签45,我们发现NELF与TCF1非常接近(图。6c).作为阳性对照,在NELFB和另一个NELF亚基NELFE之间检测到相似的物理接近性(图。6c).这一发现与NELF和TCF1作用于一组共同的目标来调节幼稚CD8细胞染色质可及性的想法相一致+t细胞。

染色质在转录调控区的可及性通常先于相关基因的转录46,47。因此,我们进行了深度RNA测序Nelfbf/f和KO CD8+在通过抗CD3/CD28加IL2的体外TCR活化之前和之后的t细胞。虽然基线转录组在Nelfbf/f和KO细胞,野生型和KO细胞的TCR激活的转录组非常不同(图。6d,补充图。6d和补充数据1).值得注意的是,基因集合富集分析(GSEA)表明Nelfb缺失与TCF1缺乏、T细胞衰竭和老化信号的丰富基因信号相关(图。6e).此外,KO细胞表现出记忆T细胞和脂肪酸代谢(记忆T细胞的标志)的基因标记减少48(图。6e).与我们的发现相一致,GSEA对已发表的人类黑色素瘤的scRNA-seq数据的分析显示NELFB肿瘤浸润性CD8的表达+与记忆T细胞和脂肪酸代谢的基因标记显著相关的细胞49(图。6f).因此,我们的数据强烈表明,NELF促进TCR触发的转录,有利于记忆T细胞的命运,并减轻T细胞衰竭和老化。

NELFB过表达增强抗肿瘤免疫

为了确定NELFB过表达是否可以增强获得性免疫,我们建立了T细胞特异性转基因小鼠模型(下文称为Tg,补充图。7a).除了NELFB水平升高(图。7a),另外两个NELF亚单位NELFA和NELFC的表达在CD8也增加+Tg小鼠的t细胞(补充图。7b),很可能是通过稳定整个NELF综合体。在体内竞争性试验中,KO或Tg CD45.2+CD8+将t细胞与其相应的对照CD8以1∶1的比例混合+携带同源标记CD45.1的t细胞+,随后将其转移到B16荷瘤受体小鼠中。肿瘤浸润CD8+细胞在转移后2-3周进行分析(图。7b).正如预期的那样,KO细胞明显比对照细胞强(图。7c,d).相反,Tg细胞包含大多数肿瘤浸润性CD8+细胞群(图。7e,f),表明过表达NELFB的T细胞优于它们的WT对应物。当纯化WT和Tg CD8时+细胞被分别转移到Rag1−/−免疫缺陷宿主,随后是E0771肿瘤攻击,Tg CD8+t细胞再次表现出比它们的野生型对应物更强的抗肿瘤活性(图。7g–I).此外,接受Tg CD8的小鼠+细胞中的白细胞总数明显增加(图。7j)和CD8+TILs(图7k).NELFB过表达增加效应记忆(图。7l)和增殖性CD8+t细胞群体(图。7m)同时减少耗竭标记PD1的表达(图。7n).此外,NELFB过表达增加单一和双重IFNγ+/TNFα+CD8+细胞(图7o–q).总的来说,我们的数据表明NELF是促进CD8的限速因素+T细胞抗肿瘤活性,可能通过减少T细胞耗竭和增加记忆和多功能性来实现。

图7: NELFB过表达促进CD8的肿瘤杀伤能力+t细胞。
figure 7

aWT/Tg脾CD8中NELFB和肌动蛋白的代表性蛋白质印迹+t细胞。实验独立重复三次,结果相似。b竞争性共转移分析方案。c接受WT/KO CD8的小鼠中til的代表性流式细胞仪图+t细胞。d占总til的百分比CD8+接受WT/KO CD8的小鼠中的细胞+t细胞,n= 6/组。e接受WT/Tg CD8的小鼠中til的代表性流式细胞仪图+t细胞。f占总til的百分比CD8+接受WT/Tg CD8的小鼠细胞+t细胞,n= 10/组。giE0771肿瘤生长曲线(g),重量(h),以及图像(i)在Rag1−/接受WT或Tg CD8的小鼠+t细胞;重量(n= 6)、Tg(n= 5).jq中E0771肿瘤的TIL分析Rag1−/接受WT或Tg CD8的小鼠+t细胞,n= 6/组。jCD45+(总活细胞的百分比),kCD8+(% CD45+), l效应记忆CD44+CD62L(% CD8+), mKi67+(% CD8+), nPD1的中值荧光强度(MFI ),o干扰素+(% CD8+), p肿瘤坏死因子+(% CD8+), q多功能干扰素γ+肿瘤坏死因子α+(% CD8+).数据以平均值SEM表示;使用学生的来比较平均差异t-测试。使用双因素方差分析和多重比较来比较肿瘤曲线。使用双边测试。源数据作为源数据文件提供。

T细胞衰竭和缺乏持续性是CAR-T治疗成功的主要障碍50。因此,我们试图确定人类NELFB (hNELFB)是否可以在更具临床相关性的环境中增强T细胞的功能。我们设计了一个双顺反子CD19特异性CAR载体,基于一个已建立的CAR结构,抗CD19-28z51(抗CD19-28z-P2A-内尔夫布)。慢病毒介导的原代人T细胞转导导致hNELFB的过表达(补充图。8a)在体外扩增过程中不增强CAR表达或改变CD4:CD8比率(补充图。8b–d).体外扩增的hNELFB过表达的人T细胞显示CD62L百分比增加+CD45RA+据报道,这是幼稚干细胞和记忆干细胞共有的特征52,在两种CD4+和CD8+人口(图8a、b).在使用NSG免疫缺陷小鼠的Raji淋巴瘤模型中,与接受PBS或模拟感染的T细胞的小鼠相比,携带亲代抗CD19-CAR-28z载体的T细胞显著延长了荷瘤小鼠的存活时间(图。8c).值得注意的是,带有抗CD19-CAR-28z-hNELFB的T细胞比带有亲代CAR-T载体的T细胞具有显著更好的宿主存活优势(图。8c).在实体瘤模型中,其中CD19抗原在人乳腺癌细胞系MDA-231中被改造,接受表达hNELFB的CAR-T细胞的宿主小鼠表现出比具有亲代CAR-T细胞的小鼠更小的肿瘤生长(补充图。8e).此外,与亲代CAR-T相比,表达hNELFB的CAR-T赋予CD8更多的肿瘤浸润+和CD4+t细胞(补充图。8f,g),以及更高的记忆标记CD127表达和更少的具有耗尽标记TIM3的细胞+CD39+在两个CD8中+和CD4+人口(补充图8h–k).因此,我们的数据提供了hNELFB过表达可以促进CAR-T抗癌免疫疗法的原理证据。

图8: NELFB过表达增强人类CAR-T功效。
figure 8

a, bCD62L的百分比+CD45RA+CD4内的细胞+ (a)和CD8+ (b)体外扩增10天后的28z或28z-hNELFB CAR-T细胞群,n= 4/组。c接受PBS或模拟T细胞、CD19 CAR-28z T细胞或CD19 CAR-28z-hNELFB T细胞的Raji荷瘤小鼠的存活曲线。d由NELFB、Pol II和TCF1介导的增强子-启动子环模型。使用学生的来比较平均差异t-测试。对数秩(Mantel–Cox)检验用于生存分析。源数据作为源数据文件提供。

讨论

在目前的研究中,我们定义了CD8+t细胞Pol II暂停因子NELF在调节适应性免疫中的内在功能。在基因消融后Nelfb,CD8+t细胞表现出加速的凋亡、受损的增殖、多功能性的丧失和记忆细胞群的减少,所有这些都可能导致有缺陷的抗肿瘤免疫反应。的效果Nelfb记忆T细胞反应的KO可归因于记忆细胞群中NELF的直接作用或效应T细胞中NELF功能的间接结果,类似于其他T细胞转录因子的遗传研究结果,例如电池故障Irf453,54。结合scRNA-seq和分化轨迹分析,我们发现T细胞特异性缺失Nelfb导致更多的终末分化群体,同时减少幼稚和记忆祖细胞库。这些发现与最近一项使用特定肌肉干细胞的研究相一致NelfbKO模型,其中Nelfb肌源性祖细胞过早终末分化引起的重复性肌肉损伤导致缺失受损的肌肉补充28。我们指出CD8中的NELFB蛋白+在我们的T细胞特异性遗传模型中,T细胞是不完全耗尽的,类似于在其他组织特异性遗传模型中观察到的情况NelfbKO鼠标模型26,27,28。可以想象,单个NELF亚基的蛋白质含量和NELF复合体的稳定性都会影响T细胞的寿命和功能。我们的KO和转基因小鼠模型的强健表型为NELF在维持CD8中的重要和限速作用提供了令人信服的证据+抗肿瘤免疫中的细胞功能。

APEX2介导的近端标记赋予半径为1-10nm的相邻蛋白交联55。因此,我们的结果强烈表明NELFB和TCF1之间的物理接近,但不一定是直接的蛋白质相互作用。然而,与全基因组的发现一起,最接近的标记数据与NELF和TCF1是共同占据CD8中一组共同转录增强子和启动子的相同转录复合物的一部分的概念相一致+t细胞。同样值得指出的是,我们的ATAC测序是在原始的CD8中进行的+t细胞,而大量RNA-seq是在CD8中完成的+TCR激活前后的t细胞。与TCR激活前的基线转录组不同,它们在Nelfbf/f和KO细胞,TCR激活的转录组Nelfbf/f和KO细胞基本上是不同的。因此,我们的数据支持这样的模型,即NELF依赖的染色质开放先于TCR激活,并可能促进TCR刺激的TCF1靶基因转录(图。8d).

已知在启动子近端区域暂停的NELF依赖性Pol II通过维持可接近的染色质结构来促进转录21以及稳定转录起始复合物26。相比之下,关于Pol II在转录增强子处积累的功能结果知之甚少。我们对初级CD8的全基因组调查+t细胞支持这样的观点,即NELF依赖的Pol II积累对增强子中染色质可及性的影响比对启动子的影响更大。虽然增强子相关Pol II调节转录的确切机制仍有待确定,但我们设想了至少两种可能的情况:(1)增强子相关Pol II可能促进增强子-启动子成环/相互作用(图。8d);和(2) Pol II转录的增强子RNA可以作为额外转录因子/辅因子的锚44,56。基于组蛋白的表观遗传程序设计与T细胞发育和分化的不同阶段有关57。例如,终末衰竭和干细胞样记忆T细胞具有独特的组蛋白修饰和染色质可及性特征58。此外,组蛋白甲基转移酶Suv39h1已被证明通过使H3K9me3沉积在记忆相关基因上来抑制记忆T细胞分化的转录程序59。我们认为NELF介导的Pol II暂停可能是表观遗传程序的一部分,它决定了记忆T细胞的分化和功能。

我们的工作提出了改善CD8结果的策略+基于t细胞的过继细胞疗法。NELFB在人类和小鼠T细胞中的过表达显著增强了抗肿瘤免疫并延长了荷瘤宿主的生存期。与我们的发现一致,TCF1过表达已被证明能增强抗肿瘤免疫,因此被认为能增强CAR-T的疗效60。我们认为NELF属于一个不断扩大的转录因子列表,其过表达增强了CAR-T效率52,61。在基于T细胞的免疫疗法中,确定这些转录因子是否调节相同或不同的转录程序将是令人感兴趣的。我们使用的抗CD19-28z CAR构建体比携带4-1BB或ICOS信号结构域的新一代抗CD19 CAR构建体更容易衰竭62。为了加强NELFB过表达在促进过继细胞治疗中的翻译潜力,需要进一步的实验来检测具有紧张信号和衰竭倾向表型的其他CAR构建体中的NELFB过表达,如GD2.28z CAR-T63。因为CD8+观察到t细胞衰竭是一种泛癌表型64NELF在缓解免疫衰竭方面的功能可应用于多种癌症类型。

总之,我们目前的研究表明NELF在CD8+t细胞同时作用于TCF1靶基因的增强子和启动子,以增强染色质的可及性和转录激活。我们提出,NELF依赖性Pol II暂停和TCF1之间的功能合作是一种控制记忆T细胞和分化效应细胞之间转换的机制,最终决定抗肿瘤免疫和基于细胞的免疫疗法对癌症的疗效。


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