Nelfb 是抗肿瘤CD8所必需的 + t细胞功能 为了研究NELF在成熟T细胞功能中的作用，我们删除了 Nelfb 以成熟的T细胞特异性方式杂交 Nelfb f/f 和远端 Lck-Cre (dLck-Cre )小鼠品系。不像近端 Lck-Cre 系统， dLck-Cre 仅在胸腺细胞阳性选择后被激活，因此对胸腺细胞发育的影响最小 30 ,31 。原代CD8细胞的NELFB蛋白水平显著降低 + t细胞，但非CD8细胞没有 + 单元格，来自 Nelfb f/f ，dLck-Cre 敲除(以下简称KO)小鼠对它们的 Nelfb f/f 副本(补充图。 1a、b ).与对照组相比，KO小鼠中其他三种NELF亚单位的水平也降低了 Nelfb f/f 控制(补充图。 1b )，与之前发现的四个NELF亚基的蛋白质稳定性相互依赖相一致 32 。KO小鼠的CD8百分比略低 + CD4增加 + t细胞比 Nelfb f/f 控制(补充图。 1c ).CD4细胞数量 + 亚群，包括幼稚细胞、中枢记忆细胞、效应记忆细胞和调节性T (Treg)细胞，在以下方面具有可比性 Nelfb f/f 和KO(补充图。 1d，e ).在CD8中 + T细胞，幼稚T细胞的数量在 Nelfb f/f 和KO小鼠(补充图。 1f ).然而，与对照组相比，KO小鼠的中枢记忆和效应记忆T细胞数量显著减少 Nelfb f/f 小鼠(补充图。 1f )，这可能表明这些小鼠对环境抗原的反应有缺陷。
为了研究NELF在T细胞对肿瘤生长的反应中的作用，我们挑战了 Nelfb f/f 以及具有同系小鼠乳腺肿瘤细胞(E0771和AT-3)的KO小鼠。与对照组相比，KO组的肿瘤生长更旺盛 Nelfb f/f 主机(图 1a–d ).肿瘤浸润性淋巴细胞(til)包含的白细胞总数显著减少(图。 1e )和CD8 + t细胞(图。 1f )的KO对 Nelfb f/f 荷瘤小鼠。此外，KO小鼠具有较小的效应记忆(图。 第一代 )和增殖性CD8 + t细胞群体(图。 1h ).为了确定CD8的固有缺陷 + 来自KO小鼠的t细胞，我们过继转移CD8 + t细胞来自 Nelfb f/f 或KO小鼠免疫缺陷 Rag1 −/− 受体小鼠，随后用E0771肿瘤攻击嵌合小鼠。正如所料，接受 Nelfb f/f CD8 + 与接受载体的t细胞相比，t细胞表现出强烈的抗肿瘤反应(图。 1i，j ).相反，过继转移的KO CD8 + 与对照组相比，t细胞没有赋予任何肿瘤抑制活性(图。 1i，j ).从具有KO CD8的嵌合小鼠收获的肿瘤 + t细胞的总记忆和效应记忆CD8明显较小 + 人口与那些 Nelfb f/f CD8 + t细胞(图。 1k，l ).这些发现证明了CD8 + NELF在抗肿瘤免疫中的t细胞固有功能。
图1: Nelfb 对于CD8是必需的 + t细胞固有的抗肿瘤功能。 a , b E0771的生长曲线( a )和AT-3( b )肿瘤在 Nelfb f/f 还有KO老鼠。 c , d E0771肿瘤重量( c )和图像( d )年收获时 Nelfb f/f 还有KO老鼠。 e –h 中E0771肿瘤的TIL分析 Nelfb f/f 和KO小鼠: e CD45 + (所有活细胞的百分比)， f CD8 + (% CD45 + ), g 效应记忆CD44 + CD62L − (% CD8 + ), h Ki67 + (% CD8 + ), n = 5/组。 i , j E0771肿瘤生长曲线( i )和重量( j )在 Rag1 −/− 老鼠接受 Nelfb f/f 还是KO CD8 + t细胞。 k , l 中E0771肿瘤的TIL分析 Rag1 −/− 老鼠接受 Nelfb f/f 还是KO CD8 + t细胞。 k CD8 + (% CD45 + ), l 效应记忆CD44 + CD62L − (% CD8 + ); n = 5/组。数据以平均值SEM表示；学生的 t -检验(针对两组)或单因素方差分析(针对三组或更多组)。使用双因素方差分析和多重比较来比较肿瘤曲线。使用双边测试。源数据作为源数据文件提供。
Nelfb 缺失损害记忆T细胞回忆反应 记忆性T细胞反应对于介导疫苗接种的保护作用至关重要 33 ,34 。确定…的影响 Nelfb 在肿瘤抗原引发的疫苗接种过程中，我们选择了两种侵袭性的卵清蛋白(OVA)表达肿瘤模型:淋巴瘤E.G7-OVA和黑色素瘤B16-OVA(图。 2a 和补充图。 2a ).在这两种肿瘤模型中，未接种疫苗(非vac)的荷瘤KO小鼠的存活率往往低于其 Nelfb f/f 对应物，虽然差异没有统计学意义(图。 2b 和补充图。 2b ).这可能是因为强大的肿瘤生长超过了宿主的抗肿瘤免疫力。当小鼠用OVA蛋白接种，然后用肿瘤细胞攻击时，接种显著延长了两者的存活时间 Nelfb f/f 还有KO主持人。然而，疫苗接种显示出对肿瘤更强的保护作用 Nelfb f/f 比KO小鼠( p 图中= 0.002。 2b p =补充图中的0.01。 2b ).此外，接种疫苗显著增加了CD8 + t细胞丰度 Nelfb f/f ，但不包括KO，主机(图。 2c )，暗示着 Nelfb KO削弱记忆T细胞反应。
图2: Nelfb T细胞的缺失削弱了对肿瘤抗原疫苗接种的记忆反应。 a 使用OVA蛋白然后用E.G7-OVA肿瘤攻击的疫苗接种程序方案。 b E.G7-OVA荷瘤小鼠的存活曲线 Nelfb f/f 和接种或未接种的KO小鼠。 c CD8 + E.G7-OVA肿瘤浸润性CD45的百分比 + 细胞； n = 4/组。 d B16肿瘤生长曲线 Nelfb f/f 和接种或未接种的KO小鼠； Nelfb f/f 非真空( n = 4), Nelfb f/f 真空( n = 7)、KO非真空( n = 6)、KO vac( n = 9);比较均值差异的单因素方差分析。使用双因素方差分析和多重比较来比较肿瘤曲线。源数据作为源数据文件提供。
为了确定NELF在记忆T细胞功能中的作用，我们接下来使用热灭活的B16肿瘤细胞作为基于已建立方案的疫苗 35 。与OVA介导的疫苗接种的发现一致，B16肿瘤的生长与未接种疫苗的相当 Nelfb f/f 和KO小鼠(图。 2d ).相比之下，疫苗接种提供了强大的生存优势 Nelfb f/f ，但在KO小鼠中没有(图。 2d )，进一步证实了NELF在记忆T细胞反应中的重要性。接种疫苗后，带有肿瘤 Nelfb f/f 宿主，而非KO宿主，CD8显著增加 + 脾脏中的T细胞丰度，以及脾脏和淋巴结中的中枢记忆T细胞(补充图。 2c–e ).总之，我们对肿瘤抗原启动的疫苗接种的多种模型的研究表明，NELF在促进肿瘤抗原启动的T细胞召回反应中起着关键作用。
Nelfb KO导致CD8的功能缺陷 + t细胞 为了进一步表征CD8 + t细胞缺陷 Nelfb KO小鼠，我们试图确定细胞功能受 Nelfb T细胞受体(TCR)激活过程中的损失。羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记显示KO CD8 + t细胞在体外TCR激活后不久(第1-4天)具有相对正常的增殖率，但在第5天表现出明显的增殖缺陷(图。 3a 和补充图。 3a ).这表明 Nelfb 缺失不可能直接损害TCR激活的细胞周期进入。另一方面，显着更多的KO CD8 + t细胞经历了凋亡 Nelfb f/f TCR激活后24小时出现的对应物(图。 3b 和补充图。 3b
图3: Nelfb 缺失促进细胞凋亡和CD8的耗竭 + t细胞。 a CFSE的时间进程 低的 人口占总人口的百分比 Nelfb f/f 和KO CD8 + 体外培养的t细胞， n = 3/组。 b 凋亡细胞的百分比 Nelfb f/f 和KO CD8 + 抗CD3/CD28活化24小时后的t细胞，通过膜联蛋白V-APC/PI评估用于流式细胞术分析， n = 3/组。 c TIM3时间进程的代表性流式细胞仪图 + PD1 + 双阳性耗尽细胞 Nelfb f/f 和KO CD8 + 体外培养的t细胞。 d –f TIM3的百分比 + (d )，PD1 + (e )，以及PD1 + TIM3 + (f )单元格内 Nelfb f/f 和KO CD8 + 体外培养的t细胞， n = 3/组。 g 肿瘤坏死因子α的流式细胞仪图 + 干扰素γ + 双阳性多功能T细胞。 h 的百分比 Nelfb f/f 和KO CD8 + 体外培养10天后的t细胞， n = 3/组。数据以平均值±标准差表示；使用学生的来比较平均差异 t -测试。使用双因素方差分析和多重比较来比较时间依赖性曲线。使用双边测试。源数据作为源数据文件提供。
白细胞介素2 (IL2)对活化T细胞的扩增至关重要，但也促进衰竭表型 36 。正如所料，在与IL2长时间体外孵育后，两者 Nelfb f/f 和KO CD8 + t细胞逐渐增加免疫抑制受体PD1和TIM3的表达(图。 3c–f ).值得注意的是，PD1/TIM3单阳性或双阳性耗尽群体的增加幅度在KO组显著高于对照组 Nelfb f/f 细胞(图 3c–f ).多功能性的丧失是记忆干细胞数量减少和T细胞衰竭增加的标志 37 。延长的体外增殖也导致干扰素γ (IFNγ)和肿瘤坏死因子α (TNFα)双阳性、多功能KO T细胞的丰度显著低于对照组 Nelfb f/f (图。 3g，h 和补充图。 3c，d ).总之，我们的数据强烈表明 Nelfb 消融会加剧CD8 + 体外扩增过程中的t细胞衰竭。
证实…的影响 Nelfb CD8上的缺失 + t细胞功能，我们使用总CD8进行单细胞RNA测序(scRNA-seq) + t细胞分离自 Nelfb f/f 还有KO老鼠。基于典型的标记基因表达模式，我们确定了四个主要的亚组——幼稚、记忆、衰竭和衰老人群(图。 4a 和补充图。 4a ).与…相比 Nelfb f/f CD8 + t细胞，KO样品具有较小的幼稚和记忆，但是具有较大的衰竭和衰老的细胞群(图。 4b 和补充图。 4b–d ).使用已建立的轨迹分析算法 38 ，我们发现了两个从幼稚阶段开始的分化轨迹；一个导致精疲力竭阶段，另一个导致衰老阶段(图。 4c 39 。分化轨迹的假时分析清楚地表明，对于衰竭和衰老的谱系，KO细胞的假时显著高于 Nelfb f/f (图。 4d ).这表明KO细胞位于其分化起点的更下游，因此比 Nelfb f/f 细胞。总之，我们的数据支持NELF阻止CD8过早终末分化的观点 + t细胞。
图4: Nelfb 缺失促进CD8的终末分化 + t细胞。 a tSNE图代表 Nelfb f/f 和KO CD8 + 从10月龄小鼠脾细胞中分离的t细胞。一只小鼠/基因型。 b 来自以下人群的个体亚群的百分比Nelfb f/f 和KO CD8 + t细胞； Nelfb f/f n = 2412)，KO( n = 1877);通过卡方检验评估频率。 c 通过轨迹分析定义了两个分化谱系。 d 两个分化谱系的伪时间定量 Nelfb f/f 和KO CD8 + t细胞， Nelfb f/f n = 2412)，KO( n = 1877);双面学生的 t -测试。方框的边界代表四分位数范围的第25和第75个百分点。方框内部的黑线代表数据的中位数。触须代表数据的最小值和最大值，方框外的黑点和触须代表异常值。源数据作为源数据文件提供。
优先依赖NELF的Pol II暂停在TCF1目标上 为了阐明NELF调节T细胞功能的分子机制，我们在原代小鼠CD8中进行了NELFB ChIP-seq + t细胞。对转录因子结合基序富集的无偏分析显示，NELFB染色质结合与TCF1的重叠最明显(图。 5a 40 。值得注意的是，NELFB ChIP-seq信号在TCF1靶的增强子和转录起始位点(TSS)都明显较高 13 ,41 对比非TCF1靶(图。 5b ).接下来，我们进行了主要的Pol II芯片测序 Nelfb f/f 和KO CD8 + t细胞。我们使用Pol II暂停指数来评估Pol II的启动子近端富集程度，用D值来表示两个累积分布之间垂直距离的最大差异 42 ,43 (图。 5c ).在…里 Nelfb f/f CD8 + 与非TCF1靶相比，t细胞TCF1靶具有显著更高的Pol II暂停指数(图。 5c ，D = 0.45736， p < 2.2e-16). Nelfb KO在TCF1目标下更大程度地降低了Pol II暂停指数(D = 0.3172， p < 2.2e-16) than at non-TCF1 targets (D = 0.13387, p < 2.2e-16, Fig. 5c ，补充图。 5a ).当分别分析增强剂和TSS时，Pol II结合的减少 Nelfb KO在TCF1靶比在TCF1非结合靶更明显(图。 5d 和补充图。 5b ).总之，我们的数据表明，NELF依赖的Pol II结合在初级CD8 + t细胞优先与TCF1结合的调节区相关。
图5: NELF介导的Pol II暂停于 独联体 TCF1靶基因的调节元件。 a 野生型CD8基因序列的富集分析 + t细胞。 b 野生型CD8的TCF1和非TCF1靶的增强子和TSS区的NELFB结合信号 + t细胞。 c 中TCF1和非TCF1目标的暂停指数的累积曲线 Nelfb f/f 和KO CD8 + t细胞。垂直虚线表示两个累积分布之间垂直距离的最大差异。 d TCF1或非TCF1靶的增强子和TSS区域的Pol II信号 Nelfb f/f 和KO CD8 + t细胞。方框的边界代表四分位数范围的第25和第75个百分点。方框内部的黑线代表数据的中位数。触须代表数据的最小值和最大值，方框外的黑点和触须代表异常值。Violin图通过具有连续性校正的双边Wilcoxon秩和检验进行评估。对于Pol II芯片序列分析， n = 2个生物复本/组。
NELF调节TCF1靶的染色质可及性 Pol II在启动子和增强子上的积累与染色质的可及性有关 21 ,44 。因此，我们使用了转座酶可及的染色质测序分析 ( ATAC序列)来评估初级幼稚细胞中总染色质开放度 Nelfb f/f 和KO CD8 + t细胞。主成分分析表明 Nelfb f/f 和KO具有不同的染色质开放状态(补充图。 5c ).四分之三的差异可及区域显示染色质开放度降低 Nelfb 删除(补充图 5d )，表明NELF在促进染色质可及性中的作用。使人联想到它在NELFB染色质结合区的富集(图。 5a )，TCF1结合是KO受损可及性的染色质区域中最显著富集的基序(图。 6a Nelfb KO触发的染色质开放度降低在TCF1靶比非TCF1靶发生得更多，此外，KO效应在增强子中比在TCF1靶的TSS中更明显(图。 6b 和补充图。 5e 6a、b ).这些数据支持这样一种观点，即NELF在幼稚的CD8 + t细胞优先促进染色质在TSS的可及性，并在更大程度上促进TCF1靶的增强。
图6: NELF与TCF1相关，并促进TCF靶基因的染色质可及性和转录程序。 a 在KO与中使用较少开放的染色质区域进行基序分析 Nelfb f/f CD8 + t细胞；二项式检验。 b KO中较少开放的区域与 Nelfb f/f CD8 + 细胞(占相应区域总数的百分比)。对于ATAC序列分析， n = 2个生物复本/组。 c 用SDS-PAGE对生物素化蛋白进行蛋白质印迹。NELFE和GAPDH分别作为阳性和阴性对照。实验独立重复三次，结果相似。 d 热图显示在激活后的KO与对照中具有TCF1结合和降低的ATAC序列和RNA序列信号的基因 Nelfb f/f CD8 + t细胞。 e KO CD8 + 细胞与TCF7缺乏、T细胞衰竭和衰老的信号相关 Nelfb f/f CD8 + 细胞与记忆T细胞和脂肪酸代谢的信号有关。对于RNA-seq分析， n = 3个生物复本/组。 f NELFB 高的 人黑色素瘤til与记忆T细胞和脂肪酸代谢的信号有关。基于经验表型的排列测试用于基因集合富集分析。源数据作为源数据文件提供。
NELF染色质结合的倾向及其对TCF1靶的作用促使我们辨别这两种转录因子之间的物理关系。TCF1蛋白水平在幼稚时具有可比性 Nelfb f/f 和KO CD8 + t细胞(补充图。 6c )，表明NELF不太可能通过调节其表达来影响TCF1的目标。使用邻近标签 45 ，我们发现NELF与TCF1非常接近(图。 6c ).作为阳性对照，在NELFB和另一个NELF亚基NELFE之间检测到相似的物理接近性(图。 6c ).这一发现与NELF和TCF1作用于一组共同的目标来调节幼稚CD8细胞染色质可及性的想法相一致 + t细胞。
染色质在转录调控区的可及性通常先于相关基因的转录 46 ,47 。因此，我们进行了深度RNA测序 Nelfb f/f 和KO CD8 + 在通过抗CD3/CD28加IL2的体外TCR活化之前和之后的t细胞。虽然基线转录组在 Nelfb f/f 和KO细胞，野生型和KO细胞的TCR激活的转录组非常不同(图。 6d ，补充图。 6d 和补充数据 1 ).值得注意的是，基因集合富集分析(GSEA)表明 Nelfb 缺失与TCF1缺乏、T细胞衰竭和老化信号的丰富基因信号相关(图。 6e ).此外，KO细胞表现出记忆T细胞和脂肪酸代谢(记忆T细胞的标志)的基因标记减少 48 (图。 6e ).与我们的发现相一致，GSEA对已发表的人类黑色素瘤的scRNA-seq数据的分析显示 NELFB 肿瘤浸润性CD8的表达 + 与记忆T细胞和脂肪酸代谢的基因标记显著相关的细胞 49 (图。 6f ).因此，我们的数据强烈表明，NELF促进TCR触发的转录，有利于记忆T细胞的命运，并减轻T细胞衰竭和老化。
NELFB过表达增强抗肿瘤免疫 为了确定NELFB过表达是否可以增强获得性免疫，我们建立了T细胞特异性转基因小鼠模型(下文称为Tg，补充图。 7a ).除了NELFB水平升高(图。 7a )，另外两个NELF亚单位NELFA和NELFC的表达在CD8也增加 + Tg小鼠的t细胞(补充图。 7b )，很可能是通过稳定整个NELF综合体。在体内竞争性试验中，KO或Tg CD45.2 + CD8 + 将t细胞与其相应的对照CD8以1∶1的比例混合 + 携带同源标记CD45.1的t细胞 + ，随后将其转移到B16荷瘤受体小鼠中。肿瘤浸润CD8 + 细胞在转移后2-3周进行分析(图。 7b ).正如预期的那样，KO细胞明显比对照细胞强(图。 7c，d ).相反，Tg细胞包含大多数肿瘤浸润性CD8 + 细胞群(图。 7e，f )，表明过表达NELFB的T细胞优于它们的WT对应物。当纯化WT和Tg CD8时 + 细胞被分别转移到 Rag1 −/− 免疫缺陷宿主，随后是E0771肿瘤攻击，Tg CD8 + t细胞再次表现出比它们的野生型对应物更强的抗肿瘤活性(图。 7g–I ).此外，接受Tg CD8的小鼠 + 细胞中的白细胞总数明显增加(图。 7j )和CD8 + TILs(图 7k ).NELFB过表达增加效应记忆(图。 7l )和增殖性CD8 + t细胞群体(图。 7m )同时减少耗竭标记PD1的表达(图。 7n ).此外，NELFB过表达增加单一和双重IFNγ + /TNFα + CD8 + 细胞(图 7o–q ).总的来说，我们的数据表明NELF是促进CD8的限速因素 + T细胞抗肿瘤活性，可能通过减少T细胞耗竭和增加记忆和多功能性来实现。
图7: NELFB过表达促进CD8的肿瘤杀伤能力 + t细胞。 a WT/Tg脾CD8中NELFB和肌动蛋白的代表性蛋白质印迹 + t细胞。实验独立重复三次，结果相似。 b 竞争性共转移分析方案。 c 接受WT/KO CD8的小鼠中til的代表性流式细胞仪图 + t细胞。 d 占总til的百分比CD8 + 接受WT/KO CD8的小鼠中的细胞 + t细胞， n = 6/组。 e 接受WT/Tg CD8的小鼠中til的代表性流式细胞仪图 + t细胞。 f 占总til的百分比CD8 + 接受WT/Tg CD8的小鼠细胞 + t细胞， n = 10/组。 g –i E0771肿瘤生长曲线( g )，重量( h )，以及图像( i )在 Rag1 −/ 接受WT或Tg CD8的小鼠 + t细胞；重量( n = 6)、Tg( n = 5). j –q 中E0771肿瘤的TIL分析 Rag1 −/ 接受WT或Tg CD8的小鼠 + t细胞， n = 6/组。 j CD45 + (总活细胞的百分比)， k CD8 + (% CD45 + ), l 效应记忆CD44 + CD62L − (% CD8 + ), m Ki67 + (% CD8 + ), n PD1的中值荧光强度(MFI ), o 干扰素 + (% CD8 + ), p 肿瘤坏死因子 + (% CD8 + ), q 多功能干扰素γ + 肿瘤坏死因子α + (% CD8 + ).数据以平均值SEM表示；使用学生的来比较平均差异 t -测试。使用双因素方差分析和多重比较来比较肿瘤曲线。使用双边测试。源数据作为源数据文件提供。
T细胞衰竭和缺乏持续性是CAR-T治疗成功的主要障碍 50 。因此，我们试图确定人类NELFB (hNELFB)是否可以在更具临床相关性的环境中增强T细胞的功能。我们设计了一个双顺反子CD19特异性CAR载体，基于一个已建立的CAR结构，抗CD19-28z 51 (抗CD19-28z-P2A-内尔夫布)。慢病毒介导的原代人T细胞转导导致hNELFB的过表达(补充图。 8a )在体外扩增过程中不增强CAR表达或改变CD4:CD8比率(补充图。 8b–d ).体外扩增的hNELFB过表达的人T细胞显示CD62L百分比增加 + CD45RA + 据报道，这是幼稚干细胞和记忆干细胞共有的特征 52 ，在两种CD4 + 和CD8 + 人口(图 8a、b ).在使用NSG免疫缺陷小鼠的Raji淋巴瘤模型中，与接受PBS或模拟感染的T细胞的小鼠相比，携带亲代抗CD19-CAR-28z载体的T细胞显著延长了荷瘤小鼠的存活时间(图。 8c ).值得注意的是，带有抗CD19-CAR-28z-hNELFB的T细胞比带有亲代CAR-T载体的T细胞具有显著更好的宿主存活优势(图。 8c ).在实体瘤模型中，其中CD19抗原在人乳腺癌细胞系MDA-231中被改造，接受表达hNELFB的CAR-T细胞的宿主小鼠表现出比具有亲代CAR-T细胞的小鼠更小的肿瘤生长(补充图。 8e ).此外，与亲代CAR-T相比，表达hNELFB的CAR-T赋予CD8更多的肿瘤浸润 + 和CD4 + t细胞(补充图。 8f，g )，以及更高的记忆标记CD127表达和更少的具有耗尽标记TIM3的细胞 + CD39 + 在两个CD8中 + 和CD4 + 人口(补充图 8h–k ).因此，我们的数据提供了hNELFB过表达可以促进CAR-T抗癌免疫疗法的原理证据。
图8: NELFB过表达增强人类CAR-T功效。 a , b CD62L的百分比 + CD45RA + CD4内的细胞 + (a )和CD8 + (b )体外扩增10天后的28z或28z-hNELFB CAR-T细胞群， n = 4/组。 c 接受PBS或模拟T细胞、CD19 CAR-28z T细胞或CD19 CAR-28z-hNELFB T细胞的Raji荷瘤小鼠的存活曲线。 d 由NELFB、Pol II和TCF1介导的增强子-启动子环模型。使用学生的来比较平均差异 t -测试。对数秩(Mantel–Cox)检验用于生存分析。源数据作为源数据文件提供。
