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USP25促进病理性HIF-1驱动的代谢重编程,是胰腺癌的潜在治疗靶点

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发表时间:2022-04-25 14:02作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

去异丙基化酶(DUBs)在靶向蛋白质降解中起重要作用,并代表了癌症的新兴治疗模式。然而,它们在胰腺导管腺癌(PDAC)中的治疗潜力还没有被探索。在这里,我们开发了一个DUB发现管道,将基于活动的蛋白质组学与患者来源的PDAC类器官和鼠遗传模型中的功能丧失遗传筛查相结合。这种方法将USP25确定为PDAC生长和维持的主要调节因子。遗传和药理学USP25抑制导致PDAC类器官的生长严重受损,而正常胰腺类器官不敏感,并导致患者来源的异种移植物显著退化。从机制上讲,USP25消除并稳定HIF-1α转录因子。PDAC的特点是微环境严重缺氧USP25缺失消除了HIF-1α的转录活性并损害糖酵解,诱导肿瘤缺氧核心的PDAC细胞死亡。因此,USP25/HIF-1α轴是PDAC代谢重编程和存活的重要机制,可以在治疗上加以利用。

介绍

胰腺导管腺癌(PDAC)是一种高致死性疾病,5年存活率低于9%1,预计到2030年将成为癌症死亡的第二大原因2。PDAC肿瘤的侵袭性和对传统化疗的耐药性被认为是由于缺乏临床靶向突变、免疫细胞缺乏的低氧微环境、代谢改变和肿瘤异质性。从胰腺上皮内瘤变(PanINs)到侵袭性和转移性疾病的恶性进展通常伴随着胰腺上皮内瘤变的早期获得性激活突变。喀斯特地貌致癌基因,发生在超过90%的PDAC病例中,随后是肿瘤抑制基因的缺失,例如INK4A/ARF, TP53,以及SMAD43。尽管对PDAC基因特征有所了解,但迄今为止,抑制关键致癌驱动因子KRAS的治疗努力大多不成功。因此,为了成功治疗这种疾病,迫切需要特异性靶向癌症特异性途径的新治疗策略。

最近,三维肿瘤器官样模型的出现,具有保留原始肿瘤异质性的内在优势,允许改进PDAC的建模4,5,6,7,8。在类有机模型中的表征努力已经导致了对PDAC发展中所涉及的机制的更精确的理解5以及与患者治疗反应的更好相关性6,7。迄今为止,用于识别新治疗靶点的鼠源性和患者源性类器官(PDO)的分子表征在很大程度上依赖于基因组和转录组分析4,7,这通常不能准确地识别酶状态或活性的变化。许多蛋白质,如蛋白酶、激酶和代谢酶,通常在翻译后水平受到蛋白质修饰如泛素化和磷酸化的调节。为了准确测量酶的活性,近年来,基于活性的蛋白质组学领域随着被称为基于活性的探针(ABPs)的小分子的使用而获得了极大的关注9。ABPs允许酶的活性位点残基共价连接,这有助于在酶活性水平而不是简单的蛋白质丰度水平上分析系统范围的变化。已经开发了基于机制的ABPs来靶向不同种类的酶活性,包括泛素缀合的ABPs(泛素-ABPs)来识别去泛素化酶(DUBs)10,11,12。DUBs通过水解底物蛋白的单泛素链和多泛素链之间的酰胺键,在泛素-蛋白酶体系统中发挥重要作用12,13,14。因此,DUBs抵消泛素化酶的活性,从而调节许多底物蛋白的活性、稳定性、定位和相互作用。

人类基因组编码约100个DUB,其中5个亚型被表征为半胱氨酸肽酶,包括USPs(泛素特异性蛋白酶)、UCHs(泛素羧基末端水解酶)、MJDs(含Machado-Josephin结构域的蛋白酶)、OTUs(卵巢肿瘤蛋白酶)和MINDYs(与含泛素的新DUB家族基序相互作用)。这些酶的活性位点中明确的催化半胱氨酸残基,以及它们的高度靶标选择性,使得DUBs成为癌症中有希望的治疗靶标15,16,17。然而,它们的生物学作用和治疗潜力在PDAC还没有被探索。

在这项研究中,我们采用了一种综合的方法,将PDOs和基因修饰的小鼠模型与基于活性的蛋白质组学相结合,来鉴定在PDAC活跃的DUBs。通过在PDAC类器官中的功能丧失遗传筛选分析了DUBs的功能意义,该筛选将USP25鉴定为PDAC肿瘤生长和存活所需的必需DUB。我们发现USP25通过调节缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的稳定性和转录活性来调节糖酵解。最后,体外和体内对USP25的药理学抑制导致PDAC细胞死亡和肿瘤消退,这表明USP25是PDAC有前途的治疗靶点。

结果

基于活性的蛋白质组学研究PDAC具有酶活性的DUBs

为了在PDAC鉴定具有酶活性的DUBs,我们开发了一种结合泛素-ABPs和质谱的分析管道(图。1a).为了捕捉DUBs的最大多样性,我们收集了三类ABPs,它们包括单泛素识别元件,带有炔丙基酰胺(PA)、乙烯甲酯(VME)或乙烯砜(VS)亲电弹头,与DUBs活性位点的亲核半胱氨酸残基共价相互作用10,11,18。这使得我们能够确定在三个临床相关的PDAC模型中哪些dub是丰富的和具有酶活性的:1 .来自广泛使用的鼠“KPCY”模型的胰腺肿瘤,由致癌基因驱动喀斯特地貌G12D的两个等位基因的突变和失活Trp53加上YFP示踪剂(KPCY小鼠:pdx 1-Cre;LSL克拉斯G12D;Trp53弗洛克斯/弗洛克斯;罗萨26-LSL-YFP);2.来自KPCY小鼠晚期PDAC肿瘤的鼠PDAC类器官(称为KPCY类器官);第三。患者来源的类器官(称为PDO)直接来源于手术切除的PDAC肿瘤,通过测序确定其各自的致癌驱动突变(图。1a).通过与远红色荧光Cy5-缀合的ABPs一起温育,实现了DUBs的凝胶内可视化,KPCY类器官和PDOs都显示了分子量在100 kDa以上和40 kDa以下的蛋白质的强Cy5信号,这在很大程度上分别对应于来自USPs和UCHs家族的DUBs(图。1b,补充图。1a).通过与泛DUB抑制剂PR-619(称为DUBi)的共处理,证实了探针对活性DUB的特异性19。与DUBi的共处理减弱了DUB与探针的结合,但不减弱总蛋白丰度,如Cy5信号的减少和等量的考马斯蓝染色所证明的(图。1b,补充图。1a).为了阐明这些dub的身份,来自KPCY类器官和PDOs的细胞裂解物与生物素缀合的ABPs一起孵育。在对未处理和DUBi处理的样品进行无标记定量后,我们在KPCY类器官和PDO中分别鉴定出28和23个显著活性的dub(图。1c,补充图。1b).无偏途径分析显示,蛋白质去泛素化是与探针相互作用的蛋白质最相关的生物学过程(补充图。1c, d),表明泛素-ABPs对捕获dub是特异性的。为了验证DUBs在原发性PDAC肿瘤中的活性,我们从KPCY小鼠中分离出完整的肿瘤,并用生物素标记的ABPs对其进行标记。在生物复制的中位数标准化后,我们再次观察到泛素-ABPs在复杂组织裂解物中特异性富集DUBs(补充图。1e).总共26个dub在KPCY肿瘤中显著富集(补充图。1e),其中18种还显著富含KPCY类有机化合物和PDOs(图。1d).

图1:使用基于活性的探针蛋白质组学表征PDAC特异性DUBs。
figure 1

a与BioRender.com合作,在PDAC有机体内进行的ABP实验示意图。b患者来源的类器官中Cy5-Ub-ABP标记的DUBs的凝胶内可视化(PDO)。cPDOs中生物素-泛素-ABP标记抗体的质谱分析。火山印迹描述了log的无标记定量(LFQ)10t检验p值与未处理(右侧)和DUBi处理(左侧)样品的比率差异。灰点表示所有已鉴定的蛋白质,红点突出显示所有重要的dub。d维恩图总结了鉴定的dub,来自质谱实验,比较未处理和DUBi处理的样品。源数据作为源数据文件提供。

功能丧失基因筛查确定Usp25为PDAC器官型中的一种重要DUB

为了研究18个最活跃的dub的功能,我们在PDAC类器官中进行了功能丧失的基因筛查(图。2a).我们在pLKO.1载体系统中设计了一个慢病毒shRNA阵列文库,每个基因包含三个经验证的shRNA以及五个不同的对照shRNA。由于我们观察到DUB活性在KPCY类有机化合物和PDO中高度保守,我们选择使用KPCY类有机化合物,因为它们是遗传定义的,显示出均匀的形态,并在我们的高通量分析条件下显示出可再现的生长率。此外,这些类器官表达由Rosa26启动子驱动的YFP荧光蛋白,我们将其用作shRNA对照(shYFP)。当与用非靶向shRNA(称为shNT)转导的类器官相比时,用YFP靶向发夹处理的类器官在选择后显示减少的YFP表达(补充图。2a, b),但器官样生长和生存能力不受影响(补充图。2c, d).接下来,我们使用高含量成像技术评估了长时间的类有机球体生长,观察到KPCY类有机球体的形成和生长在接种后72-90小时达到高峰(补充图。2e, f).在用DUB shRNA文库转导和选择后的表型监测后,系统聚类显示,与独立实验中的对照相比,几种DUB靶向shRNA减少了器官样生长(图。2b),与Usp25消耗产生最明显的抑制作用(图。2c,d).三个都有Usp25靶向shRNAs显著降低了类器官的生长和生存能力(图。2c,d),这与Usp25基因表达(图。2e).

图2:基因敲除筛选将USP25鉴定为PDAC类器官中的基本DUB。
figure 2

a由BioRender.com创建的KPCY organoids基因敲除屏幕示意图。b在嘌呤霉素选择后78小时,通过高含量成像系统测量的全孔生长汇合百分比的热图(%汇合)。显示了每个单独shRNA靶的生物复制。c器官样生长显示为%汇合,显示为平均标准偏差(SD)。显示了每个基因的单个shRNA(黑圈)值,是三个生物重复的平均值。通过采用Dunnett事后检验的单因素方差分析来确定统计显著性(n= 3个生物学上独立的样本)。d器官样生存力显示为相对于对照shYFPs(红色条)的%,显示为平均值SD。显示了每个基因的单个shRNAs(黑圈),是三个生物重复的平均值。通过采用Dunnett事后检验的单因素方差分析来确定统计显著性(n= 3个生物学上独立的样本)。e相对于三个独立shYFPs的平均值,通过qPCR对每个基因的每个个体shRNA的mRNA表达的热图。统计显著性由双尾学生的t使用Holm–Sidak针对多项测试的事后校正进行测试(n= 3个生物学上独立的样本)。源数据作为源数据文件提供。

与正常胰腺组织相比,USP25在PDAC高表达且具有酶活性,这与较差的患者存活率相关

为了评估Usp25在PDAC的作用,我们首先比较了它在PDAC和健康胰腺组织中的表达和酶活性。与正常胰腺组织相比,我们观察到KPCY模型中Usp25蛋白表达显著上调(图。3一,b,补充图。3a)免疫组织化学(IHC)显示在转化的KPCY胰腺中强的胞质Usp25染色,其与YFP谱系示踪剂重叠(图。3c).Usp25在与CK-19共染色的上皮PDAC细胞和分化差的间充质PDAC区均有表达(图。3c).有趣的是,我们观察到Usp25在周围的基质细胞中不存在,这表明Usp25在肿瘤细胞中特异性表达。为了确定Usp25上调是否导致酶活性增加,我们用泛素-ABPs标记KPCY和正常胰腺组织,并观察到许多dub,包括Usp25,在KPCY肿瘤中明显更活跃(图。3d,e).我们接下来评估了USP25在人类PDAC中的作用,发现USP25相对于正常胰腺组织,信使RNA在人类PDAC中高度表达(图。3f).此外,我们在一组PDAC患者样本中检测到USP25的强IHC染色(图。3g,补充图。3b).对公开可用数据集的分析显示USP25信使RNA表达与较短的总生存期有关(n= 177,图。3h).总之,这些发现表明USP25可能在PDAC进展中起重要作用。

图3:与正常胰腺组织相比,USP25在PDAC中高度表达且具有酶活性,这与患者存活率低相关。
figure 3

a正常胰腺和KPCY肿瘤组织中Usp25表达的组织学和免疫组织化学分析。比例尺为100米。bUsp25阳性染色面积的定量(n=每组6只生物学上独立的动物),显示为平均值±标准差。统计显著性由双尾学生的t测试。cKPCY肿瘤组织中Usp25表达的组织学和免疫组织化学分析(n=每组5只生物学上独立的动物)。比例尺为1000米,插页为100米d小鼠正常胰腺与KPCY肿瘤组织中Cy5-Ub-ABP标记的DUBs的凝胶内可视化(n=每组3只生物学上独立的动物)。e正常胰腺和KPCY肿瘤组织中生物素-泛素-ABP标记抗体的质谱分析。对生物复制进行平均,并显示为中值标准化对数10t检验p-正常(左侧)和KPCY肿瘤(右侧)样本的值与比率差异,红点突出显示所有显著的dub。f USP25在PDAC肿瘤和正常组织中的表达基于公开可得的TCGA和GTEx RNA-seq数据集,使用GEPIA在线平台生成,参数为log2倍变化截止值1和p-截止值0.01。在箱线图中,中线反映了中间值。g原发性PDAC肿瘤患者USP25染色的组织学和免疫组织化学分析。比例尺为100米。h表达上述内容的PDAC患者的Kaplan-Meier生存图(n= 51,红色)或以下(n= 126,黑色)级别USP25,使用Kaplan-Meier绘图仪在线平台生成。垂直刻度代表删截事件;秩和检验p= 0.024,双尾对数秩检验。源数据作为源数据文件提供。

耗尽USP25导致患者来源的器官样生存力、存活率降低和体内PDAC肿瘤生长减弱

我们接下来通过沉默其在KPCY类器官中的表达来评估Usp25的生物学作用。四个独立的Usp25靶向shRNAs均诱导类器官形成和生长的显著减少(图。4a,补充图。4a).相对于用对照shRNAs转导的类器官,这种类器官形成的减少导致类器官生存力总体减少71%(图。4b),这与Usp25击倒效率(图。4c,补充图。4b).在shRNA介导的基因敲除中观察到了相似的表型。USP25在四个不同的PDO线(图。4d,e).我们再次发现器官样生存力的丧失与USP25消声效率(补充图。4c).为了揭示这种生长和活力损失背后的机制,我们将shRNA转导的PDOs与细胞可渗透的caspase-3活性探针一起孵育,以测量凋亡介导的细胞死亡。跟随USP25敲除后,我们检测到显著的胱天蛋白酶-3活性(图。4f,g,补充图。4d),预示着细胞凋亡。

图4:耗尽USP25导致体内患者来源的类器官形成、生存力降低和PDAC肿瘤生长减弱。
figure 4

ash的代表形象Usp25KPCY类器官中的沉默。比例尺为800米。bKPCY类器官存活率显示为相对于shYFP对照的百分比(n= 4个生物学上独立的样本)。cKPCY类器官中内源性Usp25的蛋白质印迹。dsh的代表形象USP25PDO防线的沉默。比例尺为800米。e相对于shNT对照,PDO生存力显示为%n= 4个生物学上独立的样本)。f用胱天蛋白酶-3活性探针孵育的PDO细胞系的代表性图像。比例尺为800米。gcaspase-3信号在(f),显示为平均荧光强度(MFI)。每个符号代表一个不同的shRNAUSP25或NT对照,从生物学上独立的实验中平均得到(n= 3).hPDO系(K4T)的代表性图像,显示空载体(EV)对照和CRISPR/Cas9介导的USP25敲除细胞。每个USP25−/−克隆用所示的单引导(sg)靶向外显子来描述。比例尺为400米。i器官样生存力显示为相对于EV的%。j内源性USP25的蛋白质印迹。kPDO父母和USP25的代表图像−/−克隆人。比例尺为400米。l终点时PDOX肿瘤体积。m终点PDOX的组织学分析。比例尺为1000米,插页为100米和50米。中的条形图(b, e, g, i, l)显示为平均值±标准差,而(b, e, i)代表不同的类器官系,来自独立的动物或患者。统计显著性在(g, l)是由双尾学生的t测试,并在(b, e, i)采用单因素方差分析和Dunnett事后检验。源数据作为源数据文件提供。

然后我们生成了多条PDO线USP25使用CRISPR/Cas9,使用三个独立的单引导RNA(SGR nas)对基因进行纯合切除(补充图。4e).我们观察到明显减少的类器官形成和80%的总体生存力降低USP25与空载体(EV)对照类器官相比,在四个独立的PDO系中的敲除(图。4h,i).在存活的类器官克隆扩增后,我们不能产生有活力的USP25−/−来自许多PDO品系的克隆,除了K17T品系,其在靶向外显子处呈现移码突变,并且USP25蛋白表达缺失(图。4j,补充图。4f).有趣的是,我们观察到USP25−/−与EV对照类有机化合物相比,类有机化合物生长为具有降低的生存力的小固体簇(图。4k,补充图。第四代移动通信技术, h).删除USP25不仅在体外削弱了PDO的生长,而且导致体内患者来源的类器官异种移植物(PDOX)生长的显著丧失(图。4l).此外,USP25敲除的PDOXs表现出受损的肿瘤异质性,主要由基质细胞和非常少的肿瘤细胞组成(图。4m).总的来说,这些发现表明USP25在PDAC的生长和维持中起着重要的作用。

PDAC类器官的转录和代谢谱揭示了USP25是HIF-1转录活性和代谢重连的新调节因子

了解PDAC脆弱性的分子机制Usp25/USP25耗尽,我们在shRNA沉默后,但在观察到生存力的显著变化之前,对KPCY类器官进行了RNA测序(RNA-seq)。当比较sh时,系统聚类和主成分分析揭示了不同的基因表达谱Usp25和shYFP对照组(补充图。5a, b).统计分析表明,1880个蛋白质编码转录本差异表达(FDR调整p-值≤0.05并记录2折叠变化0.5 >x两组间> 0.5)。途径分析显示转录物在转录后显著下调Usp25参与缺氧、糖酵解和HIF-1活性途径的基因沉默非常丰富(图。5a–c,补充图。5c–d).

图5:PDAC类器官的转录和代谢谱揭示了USP25作为HIF-1转录活性和代谢重连的新调节剂。
figure 5

ac途径分析来自(a)MSigDB Hallmark 2020,(b)KEGG 2021人类,以及(c)NCI-自然2016年数据集的差异表达基因下调损失Usp25。火山图显示了所选文库中每个基因组的显著性与其优势比。较大的蓝点代表重要术语(p-值< 0.05);较小的灰点代表不重要的术语。点的蓝色越深,意义越大。d顶级KEGG途径的基因表达z分数热图。e与shYFP对照相比,PDOs中的基因表达表现为相对mRNA表达。每个符号代表独立的shRNAs黄色荧光蛋白(黑色圆圈)或USP25(黑色三角形),从生物学独立实验中平均得到(n= 3),并显示为平均值±SD。统计显著性由双尾学生的t使用Holm–Sidak事后校正进行多项测试。f在来自PDO的培养基中测量的葡萄糖浓度(n= 3个生物学上独立的实验),显示为平均值±SD。统计显著性由双尾学生的t测试。g的示意图13sh处理的KPCY类有机化合物中的c-葡萄糖富集分析Usp25,下调的HIF-1靶基因为蓝色,测量的代谢物与shYFP处理的类器官相比未改变(白色)、下调(蓝色)或富集(红色)。hl并入13c-葡萄糖进入(h)细胞内乳酸盐,(i)在培养基中分泌乳酸盐,(j)细胞内PEP,(k)细胞内丝氨酸,以及(l)处理过的KPCY类器官中的细胞内甘氨酸。数据输入(hl)显示为平均值±SD,代表一个重复六次的实验。由于技术限制,统计数据为(hl)在使用双尾学生的技术复制上执行t测试。源数据作为源数据文件提供。

人类PDAC的一个决定性特征是其严重缺氧的微环境20,21。在缺氧期间,转录因子缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是稳定的,并诱导参与糖酵解和缺氧的基因表达。在PDAC,HIF-1α及其靶基因的高表达水平被认为促进了肿瘤的侵袭性、耐药性和较差的患者总生存率22,23,24,25,26,27。有趣的是,我们发现USP25在PDAC患者中,表达与糖酵解和缺氧基因信号正相关(补充图。5e, f).对缺氧、糖酵解/糖异生和HIF-1信号通路相关转录物的分析显示,这些基因的表达在缺氧后显著降低。Usp25耗尽(图5d,补充图。6a).在KPCY类器官和PDOs中,典型HIF-1α靶基因的表达减少。Usp25/USP25静音(图5e,补充图。6b).伴随着参与糖酵解的关键酶的表达减少,葡萄糖转运蛋白的表达SLC2A1(也称为GLUT1)也降低了Usp25/USP25耗尽。这伴随着随着时间的推移,从培养基中摄取的葡萄糖显著减少(图。5f,补充图。6c).

为了了解HIF-1α靶基因的缺失是如何影响细胞葡萄糖代谢的,我们使用13c-葡萄糖(图5g).我们观察到糖酵解的重新布线Usp25静音(图5g),其特征在于乳酸产生和新乳酸分泌都显著减少(图。5h,i).此外,Usp25消耗导致葡萄糖来源的碳大量富集为磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)(图。5j)和丝氨酸和甘氨酸从头合成的显著减少(图。5k,l).这些代谢变化与HIF-1α调节酶的减少一致磷酸甘油酸脱氢酶, Psat1,Psph,Pkm基因在我们的RNA-seq数据集中观察到(图。5d).值得注意的是,这些变化仅限于糖酵解和糖酵解分流途径,因为在标记的丙酮酸或TCA循环代谢物中没有观察到显著变化(补充图。6d, e).这些结果表明,USP25是PDAC HIF-1介导的代谢重新布线所必需的(图。5g).

USP25与HIF-1α相互作用,消除并稳定HIF-1α,并促进其转录活性

为了更详细地阐明USP25和HIF-1α之间的联系,我们测量了多种人类PDAC细胞系和PDO中的缺氧和HIF-1α蛋白水平。在作为2D单层生长的人类PDAC细胞系中,HIF-1α蛋白在USP25用低氧模拟化合物处理时沉默(补充图。7a).有趣的是,在3D基质胶中培养的PDO在常氧条件下本质上是缺氧的(图。6a,补充图。7b),而且对USP25在低氧(1% O)条件下培养时耗尽2)张力(补充图。7c).此外,HIF-1α蛋白在PDOs中很容易检测到(图。6b,补充图。7d)并显著减少USP25PDO中的静音(补充图。7d).这些变化是HIF-1α特有的,因为我们没有观察到其他HIF亚型(即HIF-2和HIF-1β)表达的变化(图。6b,c).此外,我们没有检测到转录因子c-MYC的变化。USP25耗尽(图6b,c),这之前已经与HIF活性和肿瘤代谢相关联28,29,30,31。此外,HIF-1α蛋白丰度的降低发生在翻译后,如USP25删除导致了缺氧诱导因子-1α转录物表达及其转录目标的显著下调基因SLC2A1(图。6c).这些效应在体内得到了反映,因为PDOX肿瘤缺乏USP25显示CK19阳性肿瘤细胞中SLC2A1表达减少(图。6d,e).总之,这些发现表明USP25以翻译后方式调节HIF-1α蛋白丰度。

图6: USP25与HIF-1α相互作用,使HIF-1α去极化并稳定,并促进其转录活性。
figure 6

aPDOs(品系K3T)用细胞可渗透的Image-IT红色低氧试剂处理。比例尺为100米。b亲本、空载体(EV)和USP25中内源蛋白水平的蛋白质印迹−/−克隆PDO品系(K17T品系)。cUSP25中的基因表达−/−PDO线显示为与PDO线相比的相对mRNA表达,显示为平均值±标准差。通过采用Dunnett事后检验的单因素方差分析来确定统计显著性(n= 3个生物学上独立的实验)。dSLC2A1(灰色)、CK19(红色)和DAPI(蓝色)的PDOX免疫荧光染色的代表性图像。比例尺为1000米,插页为50米eCK19和SLC2A1染色面积百分比的量化显示为平均值±标准差。统计显著性由双尾学生的t测试(n= EV中的7只独立动物,以及n= KO组5只独立动物)。f免疫共沉淀的内源性USP25和免疫印迹靶,如HEK293T细胞中所示。g在siRNA介导的敲除下列基因后,对指定的靶进行蛋白质印迹USP25或非靶向(NT)控制。hsiRNA介导的敲除USP25或用25 M MG132处理8小时的NT对照细胞。将裂解物与串联泛素结合实体(试管)偶联的琼脂糖珠一起孵育,并按指示进行免疫印迹。i强力霉素(DOX)诱导USP25野生型(WT)或催化突变体(C178S)表达后内源蛋白水平的蛋白质印迹图像。jDOX诱导表达后的基因表达热图,显示为相对于USP25的倍数变化C178S。统计显著性由双尾学生的t使用Holm–Sidak针对多项测试的事后校正进行测试(n= 4个生物学上独立的实验)。kUSP25中DOX处理后内源性蛋白水平的蛋白质印迹图像−/−用于表达USP25野生型的PDOs。l器官样生存力显示为相对于对照的百分比(shYFP,灰色条),显示为平均值±SD。通过采用Dunnett事后检验的单因素方差分析来确定统计显著性(n= 4个生物学上独立的实验)。m在DOX诱导表达HIF-1α稳定突变体(HIF1A)后,器官样生存力的小提琴图显示为相对于EV未处理对照组的%P402A/P456A).用双向ANOVA和多重比较校正检验进行统计检验(n= 3个生物学独立实验)。nDOX诱导表达后的基因表达热图。数据显示为相对于未处理对照的倍数变化。统计显著性由双尾学生的t使用Holm–Sidak针对多项测试的事后校正进行测试(n= 4个生物学上独立的实验)。源数据作为源数据文件提供。

我们接下来通过进行免疫共沉淀实验来研究USP25是否直接与HIF-1α相互作用。使用异位表达的HIF-1α和USP25,我们在常氧和低氧模拟条件下检测到这两种蛋白之间的强烈相互作用(补充图。8a).同样,内源性USP25与内源性HIF-1α免疫共沉淀(图。6f).为了进一步研究这种调节,我们转向了描述良好的细胞模型系统。在常氧条件下,HIF-1α表达,但被von Hippel-Lindau肿瘤抑制基因产物(pVHL)介导的泛素-蛋白酶体降解持续降解32,33。在常氧条件下,pVHL缺陷型肾癌细胞系RCC-4中HIF-1α的组成性高蛋白水平不受缺氧诱导因子缺失的影响。USP25(补充图8b).然而,当pVHL基因被重新引入时,我们观察到HIF-1α蛋白水平显著下降,并进一步降低USP25静音(图6g).与早期的发现一致(图。6b),我们没有检测到其他HIF亚型HIF-2和HIF-1β的变化(补充图。8c).这些数据表明,USP25特异性地对抗pVHL介导的HIF-1α的泛素化。用蛋白酶体抑制剂MG132处理表达pVHL的RCC-4细胞导致泛素化HIF-1α的积聚(图。6小时).沉默时USP25我们观察到泛素化HIF-1α的增加,表明USP25去泛素化HIF-1α(图。6小时),从而拮抗pVHL介导的泛素化。

我们接下来研究了USP25功能增益对HIF-1α稳定性和核转位的影响。野生型USP25的异位表达(USP25重量(Weight)或WT),但不是无催化活性的USP25突变体(USP25C178S,或CS)导致细胞质和细胞核HIF-1α的稳定性显著增加,在缺氧模拟条件下进一步增强(补充图。8d).这种核内HIF-1α的增加导致其转录靶基因表达的显著上调SLC2A1(补充图8e).这些数据表明,HIF-1α的稳定性和转录活性需要有催化活性的USP25。我们在几个PDO品系中证实了这些发现,通过用USP25重量(Weight)或USP25C178S表情(补充图。8f).在多西环素治疗后,我们检测到USP25表达的强烈上调,并发现只有野生型USP25可以增加HIF-1α蛋白水平(图。6i,补充图。8g)及其靶基因的转录(图。6j).重要的是,将USP25重新引入USP25-耗尽的PDOs挽救了HIF-1α蛋白的表达(图。6k).此外,消音HIF1A表达概括了的影响USP25PDO生长和活力的损失,以及关键糖酵解酶的下调(图。6l和补充图。8h).另一方面,重新引入稳定的HIF-1α突变体(HA标记的HIF1AP402A/P456A)变成USP25-枯竭的PDO线(补充图。8i)部分挽救了器官样生存力(图。6m)和糖酵解靶基因表达(图。6n).总之,这些发现表明PDAC肿瘤需要USP25的功能来促进HIF-1α的稳定性和转录活性。

USP25的药物抑制导致HIF-1α信号的丢失和体内外肿瘤生长的减少

为了研究靶向USP25在PDAC的治疗潜力,我们使用了一种新的USP25临床前药理学抑制剂,称为FT20634。该化合物抑制USP25和USP28,这两者在其催化结构域中共享57%的氨基酸序列同一性35。有趣的是,KPCY类有机物的生长和生存能力对用IC处理FT206敏感50浓度为100 nM时,正常胰腺导管类器官在该浓度下不受影响(图。7a,补充图。9a).此外,对FT206的敏感性依赖于USP25的表达(图。7b),并且与USP28表达水平不相关(补充图。9b, c).我们接下来处理了13个独特的PDO系(补充表1)并观察到几乎所有(12/13)的线都对100纳米的FT206敏感(图。7c,补充图。9d).接下来,我们评估了FT206对USP25的药物抑制是否模拟了Usp25/USP25缺氧诱导因子-1α的活性。在一组KPCY和PDO细胞系中,用FT206治疗导致HIF-1α靶基因显著下调(图。7d和补充图。9e).USP25以前也显示出去泛素化tankyrases,导致规范Wnt-β-连环蛋白信号传导的上调36。因此,我们评估了tankyrase和Wnt信号传导抑制的效果,与FT206处理相比,其显示对KPCY类器官和PDO系几乎没有影响(补充图。9f,g).因此,对USP25的药理学抑制降低了HIF-1α的活性并减弱了PDAC类器官的生长,这不能通过抑制其他已知的USP25底物来概括。

图USP25的药物抑制导致HIF-1α信号的丢失和体内外肿瘤生长的减少。
figure 7

a用指定剂量的FT206处理的类器官72小时。类器官的生存力显示为相对于载体处理的对照的%。统计显著性通过具有Dunnett事后检验的单向ANOVA来确定(n = 3个生物学上独立的实验)。b100 nM FT206处理后的器官样生存力,以相对于处理过的EV载体的%表示。通过双向方差分析确定统计学显著性,并对多重测试进行事后校正(n= 3个生物学上独立的实验)。c显示用指定浓度的FT206处理的PDO系的类器官生存力的热图,以处理的载体的%计算。dPDO品系中的基因表达,显示为与载体处理的对照相比的相对mRNA表达。统计显著性由学生的t使用Holm–Sidak针对多项测试的事后校正进行测试(n= 4个生物学上独立的实验)。e皮下肿瘤体积的生长曲线(毫米3)来自KPCY organoids,用赋形剂或FT206处理(n=每组5只独立的动物)。f皮下肿瘤的代表性3D超声图像在(e).比例尺为3毫米。g皮下肿瘤中活性裂解caspase-3 (C3A)表达的代表性免疫组织化学分析。比例尺为1000米,插页为100米hC3A染色的定量(n=每组8只独立动物)。iPDO系在乙醚常氧(20%氧)或低氧(1%氧)生长条件下生长,并用指定浓度的FT206处理。器官样生存力的小提琴图显示为相对于处理的载体的%n= 3个生物学上独立的实验)。j用载体或FT206处理的PDOXs中DAPI(深蓝色)、CK19(浅蓝色)、αSMA(红色)和SLC2A1(白色)的免疫荧光染色的代表性图像。比例尺为200米。km完整PDOX切片中阳性染色面积的量化(n=每组5只独立动物)k)CK19,(l)SLC2A1,以及(m)αSMA。中的条形图(a, b, d, h, km)代表平均值±标准差。统计显著性在(h, k, l, m)是由双尾学生的t测试。统计显著性在(b, e, i)由双向方差分析确定,并对多重测试进行事后校正。源数据作为源数据文件提供。

FT206之前被证明在小鼠中具有良好的耐受性34因此,我们接下来使用皮下移植PDAC模型在体内探索了Usp25作为PDAC治疗靶点。体内施用FT206在两种KPCY类器官来源的肿瘤中引发了深度生长抑制(图。7e,f和补充图。10a)和两种不同的PDOX模型(补充图。10c–e),无毒(补充图。10b, f).有趣的是,组织学特征显示FT206治疗导致肿瘤核心细胞凋亡显著增加(图。7g,h和补充图。10g).与肿瘤核心更缺氧的想法一致,我们观察到PDO在低氧张力下生长时对FT206治疗更敏感(图。7i).在体内,PDOX模型通过显示高度缺氧再现了原发性PDAC肿瘤(补充图。11a, b),然而在这些低氧PDOX肿瘤中CK19阳性肿瘤细胞显著减少(图。7j,k,补充图。11a).此外,小鼠皮下和PDOX肿瘤中HIF-1α靶基因的组织学特征显示,经FT206处理后,Slc2a1/SLC2A1蛋白水平显著降低(图。7j,l,补充图。11c,d).重要的是,SLC2A1与CK19共染色,并且在α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)阳性基质细胞中不存在,这表明SLC2A1主要存在于PDAC肿瘤细胞中(图。7j–m).在PDAC患者样本中,我们还检测到主要在肿瘤细胞中SLC2A1的强IHC染色,这与USP25蛋白表达正相关(补充图。11g, h).值得注意的是,在用FT206治疗的皮下肿瘤中,我们观察到血管生成减少和内皮细胞标记凝集素可测量的减少(补充图。11c, 英、法),与HIF-1α活性水平降低一致。总之,这些结果表明,USP25的药理学抑制导致PDAC肿瘤细胞中HIF-1α活性的降低,这损害了它们在低氧肿瘤微环境中的存活,并随后导致体内PDAC肿瘤生长的减少(补充图。12).

讨论

在这项研究中,我们使用基于活性的蛋白质组学结合基因功能缺失筛查来确定PDAC维持和存活所需的dub。我们发现了一种新的PDAC对USP25的依赖性。PDAC衍生的类有机化合物缺乏Usp25/USP25严重损害了类器官的生长并降低了生存能力。从机制上讲,我们发现PDAC衍生的类器官本质上是缺氧的,需要USP25来调节HIF-1α蛋白的稳定性、转录活性和糖酵解。重要的是,USP25的基因缺失和药物抑制显著降低了PDOXs的生长,突出了USP 25-HIF-1α-糖酵解轴在PDAC维持中的重要性。

迄今为止,识别新的治疗靶点主要依赖于转录组学和蛋白质组学方法。这些是确定特定基因何时表达和翻译的强大资源,但通常无法显示酶何时活跃并执行其生物学功能。许多理想的药物靶标在翻译后水平受到调节,但是酶的活性状态不能通过测量mRNA或蛋白质丰度来推断。基于活性的蛋白质组学避免了这些限制,并在应用于临床相关的人类和鼠遗传模型时提高了药物发现的效率。我们基于活性的蛋白质组学分析显示,在人类基因组中已知的100个dub中,有18个dub在PDOs以及整个KPCY肿瘤中高度活跃。重要的是,这使我们能够在功能上验证初级PDAC类有机化合物中可控数量的候选靶标。因此,基于活性的蛋白质组学提供了一种策略来识别在特定细胞系统或组织中表达并具有生物学相关性的候选酶靶标,然后将其与集中的遗传和药理学验证研究相结合。在这项研究中,我们集中于识别活性DUBs,它被视为癌症中一类新的可药用酶15,16,17,但在未来,不同的基于机制的ABPs可以用于探索PDAC的其他类别的可药用酶,如激酶或磷酸酶。

PDAC的两个标志性特征是葡萄糖代谢改变和严重缺氧的微环境21。转录因子HIF-1α在调节这些过程中起主要作用,并与PDAC的肿瘤存活、进展和化疗耐药相关22,23,24,26,27。然而,最近的研究也表明HIF1A可能在PDAC启动过程中作为肿瘤抑制因子发挥作用37,38,突出了这种蛋白质的双重功能。我们的研究通过调节HIF-1α的稳定性和转录调节,将USP25鉴定为晚期PDAC代谢重连、维持和存活的新调节因子。此外,这些发现直接依赖于USP25-HIF-1α轴,因为USP25不调节其他HIF亚型的稳定性或活性。当通过USP25靶向HIF-1α时,我们也没有观察到c-MYC的补偿,这种补偿以前与HIF活性有关28,29,30,31并显示在PDAC引发肿瘤模型中上调HIF1A删除37。相反,我们先进的PDAC类器官模型是缺氧的,并且由于代谢神经重连的调节,在体外和体内都依赖USP25-HIF-1α轴存活。我们发现USP25的缺失极大地改变了糖酵解代谢,表现为丝氨酸、甘氨酸和乳酸的生物合成减少。以前曾有报道称,癌细胞使用高达50%的葡萄糖来源的碳来产生丝氨酸和随后的叶酸和核苷酸生物合成,而这种代谢分流的损失导致细胞死亡,特别是在癌细胞中39。此外,KRAS驱动的胰腺模型显示上调参与丝氨酸从头合成的酶,这对PDAC的生长和存活至关重要40。这些观察结果支持了我们的发现,即PDAC类器官,而不是健康的胰腺类器官,对USP25的药物抑制敏感。

在PDAC肿瘤中,USP25高度表达,其活性相对于正常静止胰腺组织显著升高,使其成为有吸引力的治疗候选物。在这项研究中,我们使用了一种USP25的小分子抑制剂,并发现在13个不同的PDO品系中,USP25的抑制作用显著降低了纳摩尔浓度下的类器官生长和生存能力,这表明USP25可能是PDAC一个有前途的治疗靶点。为了支持这一点,体内FT206单一疗法导致鼠KPCY皮下肿瘤和PDOXs的实质性消退,低氧肿瘤核心的肿瘤细胞凋亡增加。此外,FT206处理引发了关键糖酵解酶和葡萄糖转运蛋白SLC2A1的显著下降。有趣的是,无论是USP25还是SLC2A1都没有在周围的基质区室中检测到,我们也没有观察到FT206治疗后基质标记物αSMA的变化。我们的发现表明,USP25-HIF-1α-糖酵解轴是PDAC肿瘤细胞的一个特殊需求和潜在的治疗弱点。在原位肿瘤模型中,PDAC肿瘤细胞是否在治疗上易受USP25丢失的影响,这种肿瘤模型具有更大程度的结缔组织增生和血管生成,还有待于探索和进一步的研究。值得注意的是,FT206与其他已报道的USP25/USP28抑制剂相似41是一种双特异性DUB抑制剂,并且由于它们的结构同源性而抑制USP25和USP28。然而,FT206在PDAC的作用模式依赖于USP25的表达,并显著降低了独立于USP28的类器官的生存能力。此外,FT206处理复制了USP25基因沉默,包括HIF-1α转录信号的丢失,这强烈表明FT206作用于靶基因。尽管我们的数据强调HIF-1α在PDAC是至关重要的USP25底物,但重要的是注意到USP25的功能已被证明调节其他途径。以前,USP25已被证明去泛素化tankyrase,导致规范Wnt-β-连环蛋白信号上调36。然而,这些途径在我们的RNA序列中没有被识别为受到不同的调控Usp25沉默,如在结肠直肠癌中观察到的42。此外,在我们的PDAC类器官模型中,用特异性tankyrase和Wnt信号抑制剂靶向这些途径并不模拟USP25表型。总之,我们的研究表明,USP25通过调节HIF-1α蛋白的稳定性和代谢重连,是PDAC维持和存活的关键介质。USP25代表了一个令人兴奋的治疗靶点,应该被认为是人类胰腺导管腺癌的一种潜在疗法。


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