CCS中的EWSR1-ATF1结合位点不同于内源性野生型ATF1 为了研究EWSR1-ATF1在CCS中的功能，我们首先在两种成熟的CCS细胞系(DTC1和SU-CCS-1)中鉴定了EWSR1-ATF1结合位点。假定wt ATF1在CCS细胞中表达，我们通过将EWS R1(N-末端)的芯片测序(ChIP-seq)结果与at f1(C-末端)的信号重叠来定义EWSR1-ATF1结合位点。该方法定义了一组2385个EWSR1-ATF1峰(补充图。 1a ).大多数EWSR1-ATF1峰(84%)与远端区域相关，其余16%的峰位于基因启动子(ts)处(图。 1a ).相反，60%由wt ATF1结合的峰(含有ATF1信号，但没有EWSR1信号)位于启动子处(补充图。 1b ).为了进一步评估EWSR1-ATF1和wt ATF1之间基因组分布的差异，我们检测了HepG2和K562细胞中ENCODE财团产生的wt ATF1的ChIP-seq谱。这些图谱还显示结合主要发生在TSS区域(HepG2: 77%，K562: 70%，补充图。 1b ).此外，EWSR1-ATF1结合的远端位点在其他细胞类型中观察到的频率较低，因为它们在ENCODE (GSE29692)分析的113种人类细胞类型中显示较低的平均DNAse I信号 20 ，与wt ATF1位点相比(图。 1b ).这些观察表明，尽管共享相同的DNA结合结构域，EWSR1-ATF1结合一组不同的增强子元件。值得注意的是，在原发性CCS肿瘤中也观察到相同的EWSR1-ATF1结合谱(图。 1c ).这些发现使人想起尤因肉瘤中的EWSR1-FLI1融合蛋白，其中EWSR1的朊病毒样结构域使其能够与一组新的肿瘤特异性位点结合 21 ，并表明EWSR1-ATF1也可能获得类似的表观遗传重塑特性。FUS、TAF15和EWSR1蛋白的N-末端部分已被证明直接与SWI/SNF染色质重塑复合物相互作用 22 ，表明EWSR1-ATF1也可能与这种复合物相互作用。为了验证这一假设，我们在DTC1细胞中进行了免疫共沉淀(co-IP)研究，研究EWSR1-ATF1 / wt ATF1与核心SWI/SNF成分BRG1之间的相互作用。虽然ATF1 C抗体能够与EWSR1-ATF1和wt ATF1一起共IP BRG1，但BRG1抗体选择性地拉低EWSR1-ATF1(补充图。 1c )，表明与SWI/SNF复合物的相互作用是融合蛋白的一种新形态特性，这至少可以部分解释其独特的染色质结合模式。
图1:与wt ATF1相比，EWSR1-ATF1显示出独特的结合模式。 a DTC1和SU-CCS-1细胞系共有的2385个共有EWSR1-ATF1结合位点的基因组分布，说明EWSR1-ATF1优先结合远端基因组区域。 b 2011远端EWSR1-ATF1位点和516 wt ATF1结合的远端位点之间的DNAse I超敏反应图谱比较，横跨113种不同的细胞类型，显示在其他细胞类型中融合蛋白结合位点的DNA可及性模式更受限制。 c 顶部面板: 热图描绘了在DTC1和SU-CCS-1细胞系以及三个原发性CCS肿瘤中2011 EWSR1-ATF1结合远端位点的EWSR1 N、ATF1 C、H3K4me1、H3K27ac和ATAC信号强度。 底截镶板 :374个TSS相关的EWSR1-ATF1结合位点的EWSR1 N、ATF1 C、H3K4me3、H3K27ac和ATAC信号强度。对于每个热图，显示了以EWSR1-ATF1峰为中心的20 kb区域。信号按ATF1 C强度排序。 d 2011远端EWSR1-ATF1结合区的从头基序富集分析。显示了鉴定的前三个基序。二项式p值由模体富集软件HOMER给出。 e ，MERTK和ID4基因组基因座的ChIP-seq track，说明DTC1和初级CCS肿瘤细胞之间相似的EWSR1-ATF1结合和染色质活性分布，以及在EWR1-ATF1位点存在TFAP2A、SOX10和MITF。
为了确定与EWSR1-ATF1结合位点相关的染色质状态，我们接下来在两个复制的DTC1和SU-CCS-1以及原代CCS中分析了主要组蛋白修饰H3K4me1、H3K27ac和H3K4me3。此外，我们使用ATAC序列生成了DTC1和SU-CCS-1细胞的染色质可及性图谱。发现大多数EWSR1-ATF1远端结合位点与活性增强子元件相关，以H3K4me1、H3K27ac和ATAC信号的存在为标志 23 ,24 (图。 1c ).类似地，TSSs的EWSR1-ATF1结合位点与H3K4me3、H3K27ac和ATAC信号相关(图。 1c )，这与融合蛋白在两个调控区都表现为转录激活因子的概念相一致。值得注意的是，三种原发性肿瘤CCS1-CCS3在EWSR1-ATF1峰处显示相似的染色质状态分布图(图。 1c ).鉴于EWSR1-ATF1在其他肿瘤类型中的表达已被确定，我们在两种原发性AFH肿瘤中进行了类似的染色质轮廓分析。AFH和CCS在组织学和行为学水平上有显著差异。AFH既没有表现出透明细胞形态，也没有表现出黑素细胞分化表型，临床病程相对缓慢，很少发生转移。因此，AFH患者的预后明显好于被诊断为CCS的患者 25 。有趣的是，2385 EWSR1-ATF1结合位点的AFH染色质图谱与原代CCS和CCS细胞系中的仅有部分相似性(补充图。 1d 左边的 ).H3K4me1和H3K27ac峰的全基因组调查揭示了高质量的信号，排除了这些结果可能反映AFH较低的ChIP-seq质量的可能性(补充图。 1d 正确 ).因此，我们的观察表明，EWSR1-ATF1的作用可能受肿瘤及其来源细胞的固有特性的制约。
在远端EWSR1-ATF1结合位点最高度富集的基序是共有的CRE基序，其次是TFAP2和SOX相关基序(图。 1d ).因为CREB家族的转录因子识别基因组中的CRE半位点(TGACG/CGTCA) 26 ，对未被鉴定为具有完整CRE位点(TGACGTCA)的EWSR1-ATF1峰区域的短CRE基序(4，5，6 nt)的富集进行了查询。事实上，CRE半位点被确定为这些区域中的顶级基序(补充图。 1e ).我们的结果与以前发表的研究一致，这些研究表明EWSR1-ATF1的DNA结合特异性是由ATF1 DNA结合结构域赋予的。 8 ,11 。TFAP2A(又名AP-2α)和SOX10在神经嵴干细胞的生物学中起着重要作用 27 EWSR1-ATF1调控元件上这些基序的富集可能反映了未分化NC衍生物中CCS的推测来源 8 。52%的带有CRE基序的EWSR1-ATF1结合位点和50%的含有CRE半位点的位点共富集TFAP2和/或SOX基序(补充图。 1f )，表明这些TF可能与融合蛋白一致地结合那些基因组位点。为了研究融合蛋白和NCSC相关TF之间的潜在协同作用，我们通过ChIP-seq对两种CCS细胞系中的TFAP2A和SOX10结合位点进行了分析，并观察到这两种TF存在于2385个EWSR1-ATF1结合位点的大部分(TFA p2a:dt C1中59 %, SU-CCS-1中82 %, so X10:dt C1中56 %, SU-CCS-1中83%,补充图。 第一代 ).此外，已知TFAP2A / SOX10和MITF在调节黑素细胞分化方面的功能协同作用 28 考虑到这一专题小组在CCS发展中的关键作用 15 我们还在两种细胞系中生成了MITF的DNA结合图谱。与TFAP2A和SOX10相似，MITF在EWSR1-ATF1结合位点显示出显著的共占用(DTC1为73%，SU-CCS-1为89%，补充图。 第一代 ).值得注意的是，发现与EWSR1-ATF1以及TFAP2A、SOX10和MITF结合的增强子接近基因，例如 默克 和 ID4 (图。 1e )与其他软组织肉瘤和黑色素瘤相比，先前已显示在CCS中选择性表达 29 ，以及许多新颖的目标。总之，这些结果表明，融合蛋白可能劫持肿瘤前体细胞预先存在的TF网络，以建立其致癌程序。
EWSR1-ATF1敲除显示对染色质激活状态的显著影响 接下来，我们试图确定EWSR1-ATF1对染色质活性的功能影响。为此，我们使用了基于siRNA的策略来减少DTC1和SU-CCS-1细胞系中的融合转录物。选定的siRNA专门针对 EWSR1-ATF1 断点序列而不改变wt的表达 ATF1 (补充图 2a )，正如在早期研究中观察到的 10 。转染后96小时观察到最佳敲除(KD)效率(图。 2a )，为所有后续分析提供时间点。EWSR1-ATF1缺失细胞的染色质分布显示所有结合位点的ATF1 C信号显著减少(图。 2b，c 左边的 )，验证我们的EWSR1-ATF1参比峰组的相关性。总的来说，这两种细胞系对EWSR1-ATF1缺失的反应相似，增强子活性显著降低，如远端结合位点H3K4me1和H3K27ac信号的降低所示(图。 2c 中间 )，以及在TSS位点H3K4me3和H3K27ac信号的减少(补充图。 2b ).重要的是，染色质活化的减少与相同基因组区域的DNA可及性的显著降低相关，如ATAC-seq所评估的(图。 2c 正确 和补充图。 2b ).因此，我们观察到接近CCS特异性基因的增强子的活性和可及性降低 默克 和 ID4 (图。 2d ).相反，全基因组H3K27ac信号显示EWSR1-ATF1缺失的DTC1和SU-CCS-1肿瘤细胞减少和增加(补充图。 2c )，证明了它们全球表观遗传景观的深刻变化。这些结果证实了EWSR1-ATF1在其结合位点诱导染色质活化的能力，并进一步表明融合蛋白在维持基础(H3K4me1)和活化(H3K27ac)增强子状态中的作用。观察到的ATAC信号的减少也表明EWSR1-ATF1可能通过类似于在EwS中对EWSR1-FLI1所鉴定的开创性特性参与了产生新的远端调控元件 2
图2: EWSR1-ATF1缺失降低了染色质活化和DNA可及性。 a 用靶向融合基因(siEA 72小时和96小时)或不相关序列(siCTL 96小时)的siRNA转染的DTC1和SU-CCS-1细胞系中EWSR1-ATF1蛋白水平的蛋白质印迹分析。微管蛋白水平用作加载对照。该实验独立重复了两次，结果相似。源图像在源数据文件中提供。 b 显示用siEA或siCTL siRNAs转染96小时的DTC1和SU-CCS-1细胞中2385 EWSR1-ATF1结合位点的ATF1 C ChIP-seq信号显著减少的复合图 c 左侧面板 :热图描绘了在96小时时，在siEA或siCTL处理的DTC1和SU-CCS-1细胞中，ATF1 C ChIP-seq信号在2011 EWSR1-ATF1结合的远端位点上的分布。热图显示了以EWSR1-ATF1峰为中心的20 kb基因组区域，其由ATF1 C信号强度排序。 中间面板 :H3K4me1的合成图( 上部面板 )和H3K27ac( 下面板 s)信号在siEA或siCTL处理的DTC1和SU-CCS-1细胞中的2011 EWSR1-ATF1结合的远端位点，在96小时，显示EWSR1-ATF1缺失时两种增强子标记的减少。 右侧面板 :96小时时siEA或siCTL转染的DTC1和SU-CCS-1细胞中ATAC信号的合成图，显示与融合蛋白丢失相关的染色质可及性降低。 d 在MERTK和ID4基因组座位上的ChIP-seq和ATAC-seq轨迹(如图。 1e )在siEA或siCTL处理的DTC1细胞中，显示了由EWSR1-ATF1的缺失诱导的染色质活性和可及性的降低。EWSR1-ATF1结合区域以灰色突出显示。
EWSR1-ATF1缺失后观察到的残留染色质激活可能是由于我们实验的时间框架短，或者可能是由于协同调节EWSR1-ATF1活性的TF。为了研究EWSR1-ATF1和它的协同TF网络之间的相互依赖性，我们在EWSR1-ATF1缺失的SU-CCS-1细胞中产生了TFAP2A、SOX10和MITF的全基因组结合谱。与融合蛋白招募这些TF并劫持肿瘤前体细胞的转录网络的概念一致，在去除融合蛋白后，所有三种TF都从EWSR1-ATF1结合位点被显著置换(补充图。 2d ).总之，这些结果定义了一个与EWSR1-ATF1相关的TF网络，其染色质占据部分依赖于融合蛋白的存在。
野生型ATF1存在于EWSR1-ATF1结合位点的子集 从封闭的染色质状态到完全活跃的染色质状态的转变需要协同的TFs和染色质重塑复合物和共激活物之间的相互作用 24 。基于wt ATF1在其他细胞模型中作为激活剂的作用 13 ,30 我们推断，它在CCS中表达的维持，加上在EWSR1-ATF1结合位点ATF1基序的富集，可能有利于EWSR1-ATF1和wt ATF1在染色质激活中的合作。为了验证这一假设，我们在DTC1和SU-CCS-1细胞系以及一个原代CCS中，使用特异性靶向融合蛋白中丢失的ATF1 N-末端部分(at f1 N)的抗体，通过ChIP-seq评估了wt ATF1在EWSR1-ATF1结合位点的占据程度。发现Wt ATF1存在于两种细胞系的大多数EWSR1-ATF1结合位点(DTC1中62.5%，SU-CCS-1中75%，图。 3a )，并在原发性CCS1肿瘤中得到证实，尽管EWSR1-ATF1位点的百分比较低(38%，图。 3a )，这种差异可能与在冷冻肿瘤样品中分析TF的技术挑战有关。有趣的是，当在EWSR1-ATF1 KD细胞中描绘wt ATF1占据时，我们观察到在大多数EWSR1-ATF1结合位点ATF1 N信号显著降低(图。 3b ).值得注意的是，这种减少是在融合蛋白的结合位点选择性观察到的，因为我们没有观察到在不与EWSR1-ATF1共结合的基因组区域(定义为显示重叠的ATF1 C和ATF1 N，但缺乏EWSR1 N信号的区域)ATF1 N信号的显著变化(图。 3b
图3: wt ATF1存在于大多数EWSR1-ATF1结合位点。 a 描述SU-CCS-1和原发性CCS1肿瘤细胞中2011个远端和374个近端EWSR1-ATF1结合位点的EWSR1 N、ATF1 C和ATF1 N ChIP-seq信号强度的热图，说明wt ATF1 TF在融合蛋白结合位点的基因组共占。对于每个热图，显示了以EWSR1-ATF1峰为中心的20 kb区域。信号按ATF1 C强度排序。 b 显示ATF1 N相关峰的ChIP-seq信号变化的合成图( 左边的 )还是不( 正确 )与用靶向融合基因(siEA)或对照(siCTL) siRNAs的siRNA转染的SU-CCS-1细胞中的EWSR1-ATF1结合。融合蛋白的丢失仅在EWSR1-ATF1结合位点与ATF1 N信号的降低相关，表明融合蛋白募集了wt ATF1。 c 免疫共沉淀(Co-IP)分析显示在293 T( 左边的 )和DTC1单元格( 正确 ).用V5标记的EWSR1-ATF1 (EA-CV5)或空载体(CTL)构建体转染293 T细胞。使用抗V5标签抗体进行IP，使用抗V5( 顶端 )或抗ATF1 C( 底部 )抗体。与对照(CTL) IgG相比，使用抗ATF1 C或-ATF1 N抗体进行DTC1 IPs，使用抗ATF1 C抗体进行蛋白质印迹。该实验独立重复了两次，结果相似。 d 2011年远端区域的EWSR1 N、ATF1 N和H3K27ac ChIP-seq得分的相关图，显示H3K27ac沉积和wt ATF1存在之间的相关性强于EWSR1-ATF1存在(分别由ATF1 N和EWSR1 N信号表示)。 e ATF1 N和p300的散点图( 左边的 )，或者EWSR1 N和p300( 正确 )ChIP-seq得分，说明wt ATF1的存在比EWSR1-ATF1更好地与p300占用率相关。 f 在慢病毒感染后72小时，用靶向wt ATF1转录物(shATF1)或不相关序列(shCTL)的shRNA感染的DTC1和SU-CCS-1细胞系中EWSR1-ATF1和wt ATF1蛋白水平的蛋白质印迹分析。微管蛋白水平用作加载对照。该实验独立重复了两次，结果相似。 g qPCR分析显示 重量ATF1 慢病毒感染后72小时，shATF1- vs shCTL感染的SU-CCS-1 (S)和DTC1 (D)细胞中的转录物，以及一组EWSR1-ATF1 / wt ATF1共调节的靶转录物。每个条件的三个重复用于计算平均Ct值，然后根据2计算平均相对表达值 -δδCt 方法相对于shCTL样本值，并标准化为内源性对照基因 磷酸甘油醛脱氢酶 。误差线显示平均值的标准偏差( n = 3个样品重复)。该实验独立重复了两次，结果相似。源数据在源数据文件中提供。
这些观察表明，wt ATF1在EWSR1-ATF1结合位点的占据取决于融合蛋白本身的存在，并且至少可以部分解释在CCS细胞中观察到的wt ATF1向远端基因组区域的重定位。为了验证EWSR1-ATF1和wt ATF1之间的物理相互作用，我们用编码C-末端V5标记的EWSR1-ATF1 (EA-CV5)的表达构建体转染HEK293T细胞，并用抗V5标记抗体进行co-IP。这种方法证实了EWSR1-ATF1和内源性wt ATF1之间的相互作用，内源性wt at f1在表达EA-CV5但不是空载体感染的293 T细胞(CTL)中共免疫沉淀(图。 3c 左边的 ).我们还通过使用抗ATF1 C或-ATF1 N抗体进行co-IP，证实了CCS细胞中内源性EWSR1-ATF1和wt ATF1蛋白之间的直接相互作用，表明wt ATF1特异性抗ATF1 N抗体降低了EWSR1-ATF1(图。 3c 正确 ).我们的结果支持EWSR1-ATF1将wt ATF1募集到其结合位点的观点。因为EWSR1-ATF1结合位点比wt ATF1的结合位点位于更远的位置(补充图。 1b )，这种相互作用导致wt ATF1的基因组重新分布。
EWSR1-ATF1募集野生型ATF1用于染色质活化 我们接下来考虑wt ATF1的募集是否可能在其结合位点支持EWSR1-ATF1的功能。为此，我们通过计算EWSR1 N、ATF1 N和H3K27ac ChIP-seq评分之间的相关性，研究了DTC1和SU-CCS-1细胞中产生的ChIP-seq数据，以确定EWSR1-ATF1远端位点的wt ATF1占用率和H3K27ac信号强度之间的关联。EWSR1 N与ATF1 N评分呈显著相关( r = 0.48, p -值7.4e 115)(图 三维（three dimension的缩写） )，支持EWSR1-ATF1和wt ATF1在那些结合位点的共定位。有趣的是，H3K27ac分数与ATF1 N( r = 0.42, p -值3.54e-88)比EWSR1 N( r = 0.08, p -值0.0002)(图。 三维（three dimension的缩写） )，表明wt ATF1占据可能构成促进增强子活性的重要因素。为了获得更深入的了解，我们在CCS细胞系中进行了p300芯片序列分析，发现p300评分与ATF1 N( r = 0.71, p -值3.51 e286)比EWSR1 N( r = 0.54, p -值1.67 e137)在EWSR1-ATF1远端部位(图。 3e ).这些结果表明EWSR1-ATF1对wt ATF1的募集可能通过增强p300募集和H3K27ac在融合蛋白结合位点的沉积而参与染色质激活过程。为了验证这一假设，我们选择了一种慢病毒shRNA，特异性靶向wt的5’端序列 ATF1 抄本，不包括在 EWSR1-ATF1 以及来自DTC1和SU-CCS-1细胞的耗尽的wt ATF1。实现完全敲除的第一次尝试导致大量细胞凋亡，阻止了任何进一步的下游分析。因此，为了避免这个问题，我们决定微调慢病毒载量和实验时间，以在慢病毒感染后72小时获得部分但显著的wt ATF1缺失，而不影响融合蛋白的表达(图。 3f ).尽管在EWSR1-ATF1结合位点ATF1 N信号适度减少，我们观察到H3K27ac信号伴随减少(补充图。 3 )，以及一组基因的表达水平，这些基因的调控元件显示EWSR1-ATF1和wt ATF1在两个CCS系中共占(图。 3g )，支持wt ATF1参与EWSR1-ATF1转录活性的观点。
为了进一步阐明EWSR1-ATF1的功能贡献及其与wt ATF1的相互作用，我们转向了原代儿科间充质干细胞(hpMSCs)，一种人类肉瘤亚群的假定前体模型。重要的是，MSCs对EWSR1-ATF1驱动的转化的允许性已经在转基因CCS鼠模型中得到证实 9 。我们将C-末端标记的EWSR1-ATF1 (EA-CV5)引入hpMSCs(补充图。 4a )并用抗V5标签、-ATF1 N、-H3K27ac、-H3K4me3和p300抗体通过ChIP-seq以及ATAC-seq分析这些细胞。V5 ChIP-seq鉴定了在CCS细胞中观察到的60%的EWSR1-ATF1结合位点(图。 4a )，这显示了对结合远端位置的类似偏向(82%远端和18% TSS相关)(补充图)。 4a
图4: EWSR1-ATF1远端结合和wt ATF1募集依赖于EWSR1朊病毒样结构域。 a hpMSCs和CCS细胞系之间共有的1432个EWSR1-ATF1-V5峰(EA-CV5)的EWSR1 N和ATF1 C ChIP-seq得分散点图，显示了V5信号在所有位点的均匀分布(EA ref峰)。 b 热图( 左边的 )描绘了分别在395和340处的ATF1 N信号强度，没有ATF1和从头，在hpMSCs (EA-CV5)与对照(CTL)细胞中EWSR1-ATF1-V5结合远端位点，说明了wt ATF1的从头募集。显示了以EWSR1-ATF1峰为中心的20 kb区域。描绘ATAC、H3K27ac和p300在No ATF1和新远端位点的信号强度的复合图，显示融合蛋白募集的wt ATF1增强了其染色质激活特性。 c hpMSCs中1174个远端EWSR1-ATF1-V5结合位点的V5、ATF1 N和H3K27ac ChIP-seq评分的相关图，证实在CCS细胞系中观察到的融合蛋白结合位点，H3K27ac沉积与wt ATF1 (ATF1 N)存在的相关性好于与EWSR1-ATF1 (V5)存在的相关性。 d 在113种不同的细胞类型中，在无ATF1、新ATF1和预先存在的hpMSCs EWSR1-ATF1-V5远端结合位点之间的DNA酶I超敏性图谱比较，显示了最初缺乏wt ATF1占据的基因组区域的限制性DNA可及性模式。 e 柱状图描述了在MSCs中EWSR1-ATF1 (EA-CV5)、EWSR1(YS37)-ATF1 (E(YS37)A-CV5)和wt ATF1 (ATF1-CV5)结合位点的基因组分布，使用抗V5抗体通过ChIP-seq进行评估。 f ChIP-seq和ATAC-seq追踪显示了野生型ATF1募集、DNA可及性和染色质活性变化的不同模式 左边的 )和重新( 正确 )hpMSCs中的EWSR1-ATF1-V5结合位点(以灰色突出显示)。
首先，我们研究了与CCS共享的EA-CV5 hpMSCs中EWSR1-ATF1结合位点的wt ATF1的存在。我们将峰分为3类:由EWSR1-ATF1唯一占据的峰(没有ATF1，n = 449)或由融合蛋白和wt ATF1共同占据的峰，如果对照细胞中缺少ATF1峰，则定义为从头开始( n = 398)，或者如果ATF1存在则预先存在( n = 475).没有ATF1和从头位点在更大程度上位于远端基因组区域(88%， n = 395，而85%， n = 340)，相比之前存在的网站(77%， n = 364)(补充图。 4b )，并在EA-CV5细胞中显示增加的ATAC信号(图。 4b ).然而，这两个类别在H3K27ac激活标记信号上不同。虽然新位点显示H3K27ac信号与p300募集配对明显增加，但ATF1位点没有缺乏这两种标记的积累(图。 4b ).先前存在的位点也表现为EA-CV5细胞中ATAC、H3K27ac和p300信号的增加(补充图。 4c ).然而，H3K27ac信号的增加不太明显，可能是由于可变的预先存在的H3K27ac水平可能调节它们对EWSR1-ATF1介导的激活的反应性。使用N-末端V5标记的EWSR1-ATF1 (NV5-EA)获得了无ATF1、从头峰和预先存在的峰类别的类似结果(补充图。 4d ).综上所述，这些结果表明，为了实现染色质的完全激活，EWSR1-ATF1需要wt ATF1的补充及其直接结合位点的协同性。通过计算EWSR1-ATF1、ATF1和H3K27ac之间的芯片评分相关性，观察到类似的模式。类似于我们在CCS细胞系中的分析(图。 三维（three dimension的缩写） )，H3K27ac与ATF1 N( r = 0.59，p值6.44e-112)比V5( r = 0.24, p -值1.86 e17)(图 4c )，表明在EWSR1-ATF1结合位点的H3K27ac沉积可能确实需要wt ATF1协同作用。
EWSR1-ATF1在远端位点的结合依赖于EWSR1朊病毒样结构域 在图1中使用的113种不同细胞类型的相同编码组中，询问EWSR1-ATF1位点的三个子集的DNAse I信号。 1b 揭示了与先前存在的位点相比，ATF1和从头位点在其他细胞类型中没有明显较低的DNAse I敏感性信号(图。 4d ).相反，与wt ATF1预先结合的预先存在的位点在大多数其他细胞类型中显示出很强的DNAse I信号，表明这种TF可以更广泛地进入基因组区域。鉴于wt ATF1在CCS中的普遍表达及其通过融合蛋白进行的基因组再分布，这些结果可能反映了EWSR1-ATF1将wt ATF1募集到基因组区域的能力，在没有融合蛋白的情况下，这些区域将保持部分不可接近。他们还提出了EWSR1向EWSR1-ATF1功能提供潜在新形态特性的问题，包括与SWI/SNF重塑复合体相互作用的能力(补充图。 1c
我们先前证明了EWSR1的朊病毒样无序结构域使EWSR1-FLI1尤文肉瘤融合蛋白能够激活wt FLI1不能到达的基因组位置 21 。这些特性被改变EWSR1 (EWSR1-FLI1 YS37突变体)相变特性的突变所消除。为了研究野生型ATF1向远端位点的基因组重定位是否存在类似的机制，我们产生了一种EWSR1-ATF1 YS37突变体，并在hpMSCs中表达，同时表达的还有EWSR1-ATF1和野生型ATF1(补充图。 4e ).重要的是，发现EWSR1-ATF1 YS37突变体保留了与wt ATF1相互作用的能力(补充图。 4f )，尽管失去了β-异x诱导的沉淀特性(补充图。 第四代移动通信技术 ).为了研究这三种TF的基因组分布，使用抗V5抗体通过ChIP-seq对hpMSCs进行分析，因为所有三种构建体在其C末端都包含V5标签。与我们之前的结果一致，EWSR1-ATF1的结合模式主要局限于远端基因组区域(TSS的7%)，而YS37突变体显示启动子结合显著增加(TSS的56%)，接近wt ATF1的结合模式(TSS的60%)(图。 4e
总之，我们的结果表明EWSR1-ATF1可以结合非活性位点，在wt ATF1募集后重新启动染色质激活(图。 4f )，而在wt ATF1预先标记的活性基因组区域，EWSR1-ATF1导致染色质活性和wt ATF1占用率的适度增加。我们的hpMSCs结果还说明了EWSR1-ATF1与CCS细胞系中确定的远端位点的优先结合模式如何依赖于相变特性，并强烈促进wt ATF1的再靶向。
CCS中EWSR1-ATF1结合位点的三维连接性鉴定 鉴于绝大多数EWSR1-ATF1结合位点位于远端基因组区域，我们接下来试图通过H3K27ac Hi-ChIP对DTC1和SU-CCS-1肿瘤细胞进行3D染色质构象分析来更好地确定融合蛋白的3D连接性。该技术允许确定与激活标记H3K27ac相关的成环模式，因此提供了识别活性远端调节位点的3D相互作用的手段 31 。我们在SU-CCS-1和DTC1细胞中分别鉴定出总共79497和41325个染色质环(图。 5a、b 和补充图。 5a )，其中48%和32%与EWSR1-ATF1相关。这些观察强调了融合蛋白在塑造染色质活性和构象方面的重要性，因为EWSR1-ATF1结合位点代表了两种细胞系中H3K27ac峰的少数，但却是Hi-ChIP检测到的大部分染色质环的一部分(图。 5c 和补充图。 5b ).值得注意的是，与其他H3K27ac峰相比，融合蛋白结合位点与更高数量的环相关，并且这些环更长，具有更高的读数(图。 5d 和补充图。 5c，d
图5: EWSR1-ATF1相关的连接性主导了CCS肿瘤细胞的3D景观。 a SU-CCS-1肿瘤细胞中EWSR1-ATF1相关(EA环，红色)或非相关(非EA环，蓝色)染色质环的三维连接，显示融合蛋白连接环的远端-远端相互作用模式。 b 左边的 :circos图描绘了全基因组范围内所有与EWSR1-ATF1相关或独立的染色质环。circos内部蓝色和红色信号的高度对应于log10标度中描述的环路长度。 对吧 :20号染色体放大倍数较高，说明与所有其他环相比，EWSR1-ATF1相关环的长度增加。 c 显示H3K27ac峰关联的柱状图( 左边的 )和染色质环( 正确 )带有EA循环(分别为5121和38095)或非EA循环(分别为22654和41402)。 d 描绘中位数的箱线图( 左边的 )和强度( 正确 )的染色质环相关( n = 38095)或不( n = 41402)，具有EWSR1-ATF1结合位点。下铰链和上铰链对应于第一和第三四分位数(第25和第75个百分位数)。上须从铰链延伸到离铰链不超过1.5 * IQR的最大值(其中IQR是四分位数范围)。下须从铰链延伸到最小值，至多为铰链的1.5 * IQR。统计显著性通过双侧t检验( n = 4181对于ATF1锚， n = 16756表示没有ATF1锚)。 e 文氏图显示了Hi-ChIP鉴定的与SU-CCS-1和DTC1肿瘤细胞中2385 EWSR1-ATF1结合位点相连的直接靶基因的数量。 f 芯片交互图( 顶端 )和染色质环轮廓( 底部 )用于SU-CCS-1肿瘤细胞中的RRM2基因组座位。还显示了EWSR1-ATF1 (EA)结合位点和H3K27ac ChIP-seq信号( 中间 ).下图中的染色质环根据其与融合蛋白结合位点的关联(EA环，红色)或不关联(非EA环，蓝色)进行颜色编码。
然后，我们使用Hi-ChIP谱来定义两种细胞系中每个EWSR1-ATF1结合位点的直接靶基因，并产生一组在SU-CCS-1和DTC1细胞之间共享的2014直接靶基因(图。 5e ，f，补充数据 1 ).在DTC1和SU-CCS-1 Hi-ChIP鉴定的2014个直接靶基因中，有535个在siEA细胞中差异表达(图。 6a )，而大多数( n = 417)在EWSR1-ATF1缺失时表达减少。值得注意的是，对417个下调基因的功能分析揭示了它们强烈参与细胞周期调节，与融合蛋白的促癌活性一致(图。 6b 左边的 ，补充数据 1 ).该基因表达程序在我们的hpMSCs模型中也被激活，其中siEA细胞中下调的大多数直接靶显示出对EWSR1-ATF1表达的诱导(图。 6b 正确 ).此外，当比较CCS和AFH原发性肿瘤的转录谱时，我们观察到我们下调的靶基因库在CCS样品中表达更高(图。 6b 正确 )，尽管在两种肿瘤类型中存在相同的融合基因。
图6: EWSR1-ATF1连接的环调节细胞增殖程序。 a 火山图显示了在FC = 1.5(虚线)时EWSR1-ATF1缺失(siEA)的细胞相对于对照(siCTL)细胞的基因表达变化，并进行调整 p -value = 0.05 (3693个基因)。EWSR1-ATF1直接靶基因。 5e 在FC = 1.5时差异表达的( n = 535)用红色标记。双面的 p -数值由lmFit多重线性拟合模型给出，并通过Benjamini & Hochberg校正对多重测试进行调整。 b 左边的 :EWSR1-ATF1缺失后下调的417个基因的功能分析，如( a )的生物过程(GO: BP)和规范途径(CP: Reactome)，显示它们参与细胞周期调节。 右: 热图描绘了来自( a )，在表达融合蛋白的HP MSCS(EA-CV5和NV5-EA)与对照(CTL)中，或在原发性CCS和AFH肿瘤中。 c 散点图显示了siCTL和siEA转染的SU-CCS-1细胞之间H3K27ac相关环的变化。显示两倍以上变化的环数以红色(诱导)和蓝色(抑制)显示。 d 条形图显示EWSR1-ATF1相关(EA结合，橙色和红色)或独立(非EA，蓝色)环的环数变化。 e 对照中ST8SIA4A基因组基因座的Hi-ChIP和ChIP-seq信号轨迹(siCTL， 左边的 )或EWS R1-at f1-耗尽(siEA， 正确 )SU-CCS-1细胞。
接下来，我们试图确定CCS肿瘤细胞中融合蛋白丢失所诱导的连接性变化。为此，通过H3K27ac Hi-ChIP对用siCTL或siEA转染的SU-CCS-1细胞进行分析，以鉴定成环模式的差异。标准化后，我们在去除了EWSR1-ATF1的SU-CCS-1细胞中发现了25008个减少的环和19107个增加的环(2倍阈值)(图。 6c ).在EWSR1-ATF1相关环中观察到的环数减少最多(图。 6d，e )，支持融合蛋白在染色质激活中的作用。相比之下，大多数染色质相互作用的增加与缺乏EWSR1-ATF1结合位点的基因组区域相关(图。 6d 顶端 ).
三维连接和染色质活性的协同变化指向候选的CCS起源细胞 我们的小组和其他小组先前已经表明EWSR1-FLI1缺失导致了与MSCs相关的表达程序的出现，MSCs被认为是这种肿瘤的起源细胞 32 。因此，我们推断，在EWSR1-ATF1缺失细胞中发现的新的3D连接可能是由调控元件驱动的，这些调控元件控制着与来源的候选CCS细胞相关的转录程序。为了评估这一假设，对siCTL和siEA转染的SU-CCS-1细胞的H3K27ac谱进行了“从头”H3K27ac区的调查，h3k 27 AC区被定义为在siCTL细胞中显示少于5个读数，而在siEA细胞中增加至少4倍的峰。该分析在EWSR1-ATF1缺失的SU-CCS-1细胞中分别产生了4063和1465个“从头”远端和近端位点(图。 7a ).然后使用这些位点的基因组坐标来询问匹配的H3K27ac Hi-ChIP图谱，并定义它们的直接靶基因(图。 7b ).使用调整后的p值0.05和FC 1.5截止值，我们在DTC1和SU-CCS-1细胞中鉴定了157个与“从头”H3K27ac位点相关的基因，这些基因在去除EWSR1-ATF1后被诱导(图。 7c ).令人惊讶的是，在诱导的转录物中，我们观察到与EWSR1-ATF1直接结合位点共定位的转录物相关的转录物，包括TFAP2A、SOX10和MITF(图。 7d 和补充数据 1 ).此外，当调查siEA转染的DTC1和SU-CCS-1细胞的整体RNA-seq谱时，我们还发现了参与黑素体生物发生和黑素沉着的基因的诱导，包括与终末分化的黑素细胞相关的MLANA、TYRP1和PMEL(图。 7d 和补充数据 1 ).重要的是，MITF、TFAP和SOX TF家族的DNA基序也在图1所示的“从头”远端位点得到了富集。 7a (图。 7e ).这表明在去除EWSR1-ATF1后，CCS细胞可能经历由一组也在融合蛋白结合位点发现的TF驱动的分化变化。与这些观察结果一致，对157个诱导转录物的基因本体分析揭示了它们富集了与NCSC分化和染色质调节相关的功能(图。 7f 和补充数据 1 ).
图7:EWS R1-at f1耗尽点与候选CCS前体细胞的3D连接性变化。 a 描绘远端H3K27ac信号的热图( 顶部面板 )和近端( 底部面板 )SU-CCS-1细胞中的位点，用对照(siCTL， 左边的 )或EWSR1-ATF1靶向(siEA， 正确 )siRNAs，说明了在EWSR1-ATF1缺失的细胞中“从头”位点的诱导。对于每个热图，显示了以H3K27ac信号为中心的20 kb区域。通过siEA转染的SU-CCS-1细胞中的H3K27ac强度对信号进行分级。 b 芯片交互图( 顶端 )和染色质环轮廓( 底部 )用于siCTL或siEA处理的SU-CCS-1肿瘤细胞中的RHOBTB1基因组座位。还示出了H3K27ac芯片序列信号( 底部 ).下图中的染色质环根据其与融合蛋白结合位点的关联(EA环，红色)或不关联(非EA环，蓝色)进行颜色编码。 c DTC1和SU-CCS-1细胞中的基因表达z得分热图，用于鉴定作为“从头”调节位点的靶的157个转录物，如在( a )，在EWSR1-ATF1耗尽时，在两种细胞系中显示FC > 1.5的上调和p值< 0.05。 d 参与黑素细胞分化的基因的表达z得分，显示在siEA转染的DTC1 (D)和SU-CCS-1 (S)细胞中有较高的表达。粗体标记的基因是( c ). e 4063个“从头”远端位点的Homer基序分析显示于( a ).二项式p值由模体富集软件HOMER给出。 f 对Wiki途径(WP)、生物过程(GO: BP)和分子功能(GO: MF)的相同157个基因进行功能分析，显示该基因库参与NCSC分化和染色质重塑。 g 来自五个健康人皮肤样品(包括表皮和真皮层)的168，103个单细胞的表达谱的UMAP表示。标准化的log2分数用于UMAP生成。黑素细胞、许旺细胞和间质许旺细胞用虚线圆圈标记。 h 描绘下调的EWSR1-ATF1靶基因的富集分数的箱线图( 底部 , n = 393)或上调的“从头”基因签名( 顶端 , n = 154)在16个不同的细胞群中表达。融合蛋白去除后，肿瘤细胞获得更分化的表型，使人想起黑素细胞和间质施万细胞。箱形图显示了1 标准时间 到3 注册营养师 显示中间值的数据的四分位数(25–75%)。
鉴于CCS通常出现在皮肤深层，为了更好地了解这些分化变化的本质，我们研究了人类皮肤单细胞图谱 32 对于富含417个下调的直接靶基因的原代细胞类型。 6A ，或图1中的157个“从头”基因。 7a 。该图谱包括来自五个健康人皮肤样本的168，103个单细胞，并包括黑素细胞和许旺细胞(SchC)，这些细胞以前被认为是CCS的起源细胞(图。 7g ).有趣的是，尽管EWSR1-ATF1靶基因库在组成该图谱的23种不同细胞类型中没有显著富集(图。 7h 底部 )，黑素细胞和基质干细胞中的“从头”基因标记得分(图。 7h 顶端 ).为了进一步研究EWSR1-ATF1缺失诱导的分化变化，我们用电子显微镜分析了siEA和siCTL转染的SU-CCS-1细胞，以评估黑素体的存在。黑素体是在表皮黑素细胞中发现的细胞器，黑色素在其中合成和储存，它们的存在与终末黑素细胞分化有关。有趣的是，在EWSR1-ATF1缺失的细胞中，每个细胞的黑素体数量显著增加(p < 0.0001，补充图。 6 ).这些结果与在EWSR1-ATF1缺失的细胞中观察到的参与黑素体生物发生和成熟的基因表达增加一致，支持CCS可能起源于神经嵴谱系的前体细胞的观点，并表明融合蛋白可能通过将谱系特异性TFs TFAP2A、SOX10和MITF从其原始结合位点重新定位而诱导细胞重编程为更未分化的状态。
