介绍

半胱氨酸是一种蛋白质氨基酸,通过提供合成谷胱甘肽(GSH)和其他参与抗氧化防御的生物分子的限速前体,在维持细胞氧化还原稳态中发挥关键作用1,2。癌细胞,特别是转移性癌细胞,经常经历高水平的氧化应激,因此对来自细胞外空间的半胱氨酸有很高的需求,以建立它们的抗氧化防御系统3,4,5,6。然而,由于氧化的细胞外环境,细胞外半胱氨酸是不稳定的,并迅速转化为胱氨酸,半胱氨酸的氧化二聚体形式,其在细胞外空间的浓度通常比半胱氨酸的浓度高一个数量级7,8。因此,大多数癌细胞主要依靠胱氨酸转运蛋白溶质载体家族7成员11(slc7a 11;也称为xCT)来输入细胞外胱氨酸9。一旦进入胞质溶胶,胱氨酸就被还原成半胱氨酸,半胱氨酸随后被用来合成谷胱甘肽以进行抗氧化防御9,10。SLC7A11在保护细胞免受氧化应激诱导的细胞死亡(例如,铁下垂)方面具有公认的作用,并且它在许多人类癌症中过表达8.

然而,高胱氨酸摄取也代表了SLC7A11过表达癌细胞的脆弱性11。胱氨酸是最不可溶的普通氨基酸,并且其在胞质溶胶中的异常积累可以是高度细胞毒性的,因为它诱导二硫化物应激,迫使细胞迅速将胱氨酸还原成更易溶解的半胱氨酸11。由于胱氨酸还原成半胱氨酸消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH),一种还原当量,具有高胱氨酸输入率的slc7a 11-过表达细胞需要大量的NADPH来不断地将胱氨酸还原成半胱氨酸并维持细胞内胱氨酸在无毒水平。因此,这种细胞表现出细胞内胱氨酸和其它二硫化物分子的显著积累,并响应葡萄糖饥饿而经历称为二硫化物下垂的快速细胞死亡;在这些条件下,通过戊糖磷酸途径和其他途径的NADPH生成被显著削弱12,13,14。然而,尚不清楚二硫化物应激和由此导致的SLC7A11过表达细胞的死亡是否只发生在葡萄糖饥饿的情况下,或者是否也发生在其他NADPH消耗条件下。解决这个问题将有助于理解SLC7A11过度表达的癌细胞中二硫化物应激诱导的细胞死亡的代谢性质,并确定针对SLC7A11过度表达的癌症的治疗策略。

如上所述,SLC7A11介导的胱氨酸转运在抑制铁下垂中起着重要作用,铁下垂是一种铁依赖性调节细胞死亡的形式,由细胞膜中未受抑制的脂质过氧化引发8。事实上,睑下垂症是从了解erastin(slc7a 11抑制剂)的强效细胞杀伤作用的研究中发现的15。最近的研究已经确定了铁下垂是一种关键的肿瘤抑制机制,并表明SLC7A11在癌细胞中的过表达至少部分通过抑制铁下垂来促进肿瘤生长8,16,17,18。然而,SLC7A11在葡萄糖缺乏细胞中促进细胞死亡的作用也表明其在肿瘤生物学中的作用是复杂的,并且可能是背景依赖性的,尽管SLC7A11可能具有肿瘤抑制功能的确切背景仍然未知。

在这项研究中,我们发现SLC7A11的中度过表达可以保护癌细胞免受H2O2-诱导细胞死亡,与直觉相反,SLC7A11的高过表达在H2O2通过耗尽NADPH和诱导二硫化物应激的治疗。我们进一步表明SLC7A11的高过表达促进原发性肿瘤生长,但抑制肿瘤转移,可能是因为SLC7A11高过表达的转移癌细胞对氧化应激特别敏感。我们的发现表明SLC7A11的表达水平决定了它在介导癌细胞氧化应激反应和肿瘤生物学中的环境依赖性作用。

结果

SLC7A11中度和高度过表达对H2O2-诱导细胞死亡

我们试图了解SLC7A11过表达是否会促进NADPH耗竭条件下的细胞死亡,而不是葡萄糖饥饿。H2O2谷胱甘肽过氧化物酶1 (GPX1)等抗氧化酶可以中和谷胱甘肽诱导的氧化应激2O2到H2o;同时,谷胱甘肽被氧化成谷胱甘肽二硫化物(GSSG),随后通过谷胱甘肽还原酶(GR)转化回谷胱甘肽,消耗NADPH(补充图。1a).因此,H2O2治疗减少了细胞内NADPH的储备5,6。然而,SLC7A11在保护细胞免受H2O2-诱导氧化应激和细胞死亡8。我们推断SLC7A11介导的胱氨酸摄取可能在H。2O2治疗。一方面,胱氨酸还原成半胱氨酸消耗NADPH,这将加剧由H2O2治疗,从而促进二硫化物应激。另一方面,半胱氨酸提供了合成谷胱甘肽的关键前体来中和H2O2-诱导氧化应激(补充图。1a).因此,我们推断SLC7A11的表达水平可能决定了其在H。2O2治疗。

为了验证这一假设,我们分析了一组癌细胞系中SLC7A11的表达和胱氨酸摄取水平。这些分析表明,在这些细胞系中,胱氨酸摄取水平通常与SLC7A11的表达水平相关(但与参与胱氨酸摄取的其他蛋白如SLC7A9和SLC3A1的表达水平无关)(图。1a、b).根据SLC7A11的相对表达和胱氨酸摄取水平,我们进一步将这些细胞系分为SLC7A11低、中和高细胞,其中SLC7A11中(UMRC6、H226、A498和A549)和高细胞(T98G和Hs578T)与SLC7A11低细胞(H1299和786-O)相比,胱氨酸摄取分别增加2-5倍和10倍。

图1:中度和高度过量表达SLC7A11对H有相反的影响2O2诱导细胞死亡。
figure 1

a一组癌细胞系中SLC7A11、SLC7A9和SLC3A1的蛋白水平。纽蛋白用作装载对照。b一组癌细胞系的胱氨酸摄取水平。csgCtrl和sgCtrl中SLC7A11蛋白水平(上调)和胱氨酸摄取水平(下调)SLC7A11敲除T98G细胞。d响应1 mM H的细胞死亡2O2使用PI染色测量具有所示基因型的T98G细胞中24小时的处理(up)或葡萄糖饥饿(down)。eshCtrl和SHC TRL中SLC7A11蛋白水平(上调)和胱氨酸摄取水平(下调)SLC7A11击倒T98G细胞。f响应1 mM H的细胞死亡2O2使用PI染色测量具有所示基因型的T98G细胞中24小时的处理(up)或葡萄糖饥饿(down)。gsgCtrl和sgCtrl中SLC7A11蛋白水平(上调)和胱氨酸摄取水平(下调)SLC7A11敲除Hs578T细胞。h响应1 mM H的细胞死亡2O2使用PI染色测量具有指定基因型的Hs578T细胞中24小时的处理(up)或葡萄糖饥饿(down)。ishCtrl和SHC TRL中SLC7A11蛋白水平(上调)和胱氨酸摄取水平(下调)SLC7A11敲除Hs578T细胞。j响应1 mM H的细胞死亡2O2使用PI染色测量具有指定基因型的Hs578T细胞中24小时的处理(up)或葡萄糖饥饿(down)。kSLC7A11低、中和高H1299细胞中SLC7A11蛋白水平(上调)和胱氨酸摄取水平(下调)。l响应1 mM H的细胞死亡2O2使用PI染色测量SLC7A11低、中和高H1299细胞中20小时的处理(左)或葡萄糖饥饿(右)。mSLC7A11低、中和高786-O细胞中SLC7A11蛋白水平(上调)和相应的胱氨酸摄取水平(下调)。n响应1 mM H的细胞死亡2O2使用PI染色测量SLC7A11低、中和高786-O细胞中的处理(左)或葡萄糖饥饿(右)20小时。数据以平均值±标准差表示;n= 3.n表示独立重复。P价值由双尾不成对学生的决定t测试。源数据作为源数据文件提供。

然后我们在SLC7A11-高T98G细胞中将slc7a 11表达降低到不同水平。我们发现通过CRISPR-Cas9方法减少SLC7A11可减少约90%的胱氨酸摄取(图。1c)并如预期的那样,使T98G细胞对H2O2-诱导细胞死亡(图。1d).令人惊讶的是,击倒SLC7A11使用短发夹RNA(shrna ),适度减少胱氨酸摄取(图。1e)减少了H2O2-处理过的细胞(图1f).我们在另一种SLC7A11高细胞系Hs578T细胞中证实了这些发现(图。1g–j).相比之下,击倒SLC7A11在slc7a 11-中度细胞系(A498,UMRC6,H226和A549)中,H2O2-诱导细胞死亡(补充图。1b,c).

相反,我们诱导SLC7A11在SLC7A11低H1299细胞中不同水平的过度表达(图。1a,k).胱氨酸摄取测量显示,SLC7A11的中度或高度过表达(slc7a 11-中度或高度)分别使胱氨酸摄取增加约5倍和9倍(图。1k),这对应于内源性SLC7A11中度或高度表达的细胞系中的胱氨酸摄取水平(图。1a).(值得注意的是,我们必须在SLC7A11-低细胞中过表达SLC7A11,达到比slc7a 11-中等细胞系中内源性slc7a 11更高的水平,以实现胱氨酸摄取的相应中等增加。SLC7A11需要伴侣蛋白SLC3A2定位在质膜上以介导胱氨酸摄取,SLC3A2也结合其他几种氨基酸转运蛋白19;因此,我们需要在更高水平上过量表达SLC7A11,以便在细胞中与其他转运蛋白竞争SLC3A2。)值得注意的是,虽然SLC7A11的中度过表达抑制了H2O2-诱导细胞死亡,正如所料,SLC7A11的高过表达显著促进了H2O2治疗(图1l).我们在SLC7A11中度或高度过表达的另一种SLC7A11低细胞系786-O细胞中进行了类似的观察(图。1a、m、n).

总之,我们的数据表明SLC7A11的中度和高表达对H。2O2诱导细胞死亡。相反,SLC7A11的中度和高度过表达促进了葡萄糖缺乏的H1299和786-O细胞的死亡(图。1l,n),而两者都有SLC7A11敲除和敲除保护T98G和Hs578T细胞免受葡萄糖饥饿诱导的细胞死亡;此外,SLC7A11基因敲除对葡萄糖饥饿诱导的细胞死亡有更明显的保护作用SLC7A11敲低这些SLC7A11高细胞(图。1d、f、h、j),这与以前报告的调查结果一致11,13,20,21,22。因此,由SLC7A11的差异表达引起的特殊效应仅适用于H2O2-处理过的细胞。

我们接下来检查了在H2O2-处理的slc7a 11-高细胞可以通过任何已知的细胞死亡抑制剂来挽救。我们发现不同的细胞死亡抑制剂,包括细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK,铁凋亡抑制剂ferrostatin-1和坏死凋亡抑制剂necrostatin-1s,对H2O2-在SLC7A11-高癌细胞中诱导细胞死亡,包括slc7a 11和T98G细胞高度过表达的786-O细胞(补充图。1d–h).在这些细胞中,我们证实了Z-VAD-FMK对星形孢菌素诱导的细胞凋亡的拯救作用和铁抑制素-1对RSL3诱导的铁下垂的拯救作用(补充图。1d–h).因为Z-VAD-FMK对星形孢菌素诱导的细胞凋亡的挽救作用在T98G细胞中是部分的(补充图。1e),作为补充方法,我们也删除了基因巴克斯BAK这些slc7a 11-高细胞系中的凋亡诱导是必需的(补充图。1i).我们的结果证实巴克斯/BAK基因消融消除了星形孢菌素诱导的凋亡(补充图。1j)但不影响H2O2治疗(补充图1k).最后,我们证明了H2O2在slc7a 11-低对应体中-诱导的细胞死亡可以通过细胞凋亡和坏死凋亡抑制剂得到部分挽救(补充图。1l),这与最近的一份报告一致23。这些数据表明,虽然H2O2主要在SLC7A11-low细胞中诱导凋亡和坏死2O2在SLC7A11高细胞中诱导不同形式的细胞死亡(不是凋亡、铁下垂或坏死下垂)。我们下面的数据表明,这种细胞死亡最有可能是最近描述的二硫键14(另请参见“讨论”部分)。

SLC7A11高表达诱导H2O2-处理过的细胞

以前,我们发现在SLC7A11中度或高度过表达的癌细胞中,葡萄糖饥饿导致细胞内胱氨酸和其他二硫化物分子的显著积累,以及NADPH耗竭和快速细胞死亡12。因此,我们测量了用载体或H处理的SLC7A11低、中和高786-O细胞(即亲代786-O细胞和SLC7A11中度或高度过表达的同基因衍生物)中细胞内半胱氨酸、胱氨酸和其他二硫化物分子的水平2O2。一旦通过SLC7A11进入细胞,胱氨酸在胞质溶胶中迅速还原成半胱氨酸11,12。与此一致,在用载体处理的SLC7A11低、中和高细胞中,我们观察到细胞内胱氨酸水平没有明显差异,但细胞内半胱氨酸水平随着细胞类型中SLC7A11过表达水平的增加而增加(图。2a,b).值得注意的是,H2O2与slc7a 11-低水平细胞相比,治疗显著增加了slc7a 11-高水平细胞(而不是slc7a 11-中等水平细胞)的细胞内胱氨酸水平(图。2a).值得注意的是,在H。2O2治疗(图2b).我们之前在葡萄糖缺乏的SLC7A11高细胞中进行了类似的观察12。这可能是因为这些压力条件——H2O2治疗和葡萄糖饥饿——抑制下游的半胱氨酸消耗过程,如蛋白质合成;因此,细胞内半胱氨酸水平保持相对稳定,尽管在H2O2治疗。这些观察表明,在这些情况下,半胱氨酸水平的变化不太可能是导致细胞死亡增加的机制。

图SLC7A11的高表达导致H2O2治疗。
figure 2

ae胞内胱氨酸浓度的测量(a)、半胱氨酸(b)、谷胱甘肽(c),GSSG(d),以及GSSG/谷胱甘肽比率(e)在用载体或1 mM H处理的slc7a 11-低、中和-高786-O细胞中2O2持续2 h。f, g细胞内γ-谷氨酰-胱氨酸的相对水平(f)和γ-谷胱甘肽-半胱氨酸(g)在用载体或1 mM H处理的slc7a 11-低、中和-高786-O细胞中2O2持续2 h。h, i胞内胱氨酸浓度的测量(h)和GSSG(i)在用载体或1 mM H处理的T98G细胞中2O2持续8小时。j用载体或1 mM H处理的T98G细胞中细胞内γ-谷胱甘肽-半胱氨酸的相对水平2O2数据以平均值±标准差表示;n= 3.n表示独立重复。P价值由双尾不成对学生的决定t测试。源数据作为源数据文件提供。

进一步的分析显示slc7a 11-高(而不是slc7a 11-中等)细胞显示GSH耗竭(图。2c)但其它二硫化物分子如γ-谷氨酰-胱氨酸和γ-谷胱甘肽-半胱氨酸(分别是γ-谷氨酰-半胱氨酸和GSH的半胱氨酸二硫化物;补充图2),还有GSSG;GSSG/谷胱甘肽比值也在高剂量组有所增加2O2-处理过的细胞(图2d–g).同样,我们观察到H2O2处理增加了T98G细胞内胱氨酸、GSSG和γ-谷胱甘肽-半胱氨酸的水平(图。2h–j),尽管倍数变化不如SLC7A11高过表达的786-O细胞中的明显(图。2a–g).最后,根据最近的一份报告24,我们发现H2O2治疗增加了slc7a 11-低、中和-高细胞的胱氨酸摄取,导致在H。2O2治疗(补充图2c),这可能有助于H2O2-处理过的slc7a 11-高细胞。总的来说,我们的结果表明,在H2O2治疗,SLC7A11的高(但不是中度)过表达导致细胞内二硫化物的积累,这与H。2O2诱导细胞死亡。

抑制SLC7A11介导的胱氨酸摄取和消除二硫键积聚可预防高浓度SLC7A11诱导的细胞死亡2O2处理

我们下一步试图确定SLC7A11介导的胱氨酸摄取和二硫化物积累是否是高浓度SLC7A11诱导的细胞死亡的基础2O2治疗。为此,我们采取了几种方法来防止二硫化物的积累。这些包括(I)用SLC7A11抑制剂erastin治疗以阻断SLC7A11介导的胱氨酸摄取(补充图。3a,b);(ii)用二硫化物还原剂三(2-羧乙基)膦(TCEP)和2-巯基乙醇(2-ME)处理,以将培养基中的胱氨酸还原成半胱氨酸(从而绕过SLC7A11介导的胱氨酸转运)(补充图。3c);(iii)用N-乙酰半胱氨酸(NAC)和青霉胺(包括两者)处理D表示“对象”: analysandL-青霉胺)通过二硫键交换(即Cys-Cys+NAC→Cys+NAC-Cys;Cys-Cys +青霉胺→ Cys +青霉胺-Cys;补充图三维(three dimension的缩写)).这些处理部分或完全消除了H2O2SLC7A11高过表达处理的786-O细胞(图。3a–e)并相应地显著抑制H2O2-在这些细胞中诱导细胞死亡(图。3f–k).同样,这些治疗抑制了H2O2-在slc7a 11-高T98G细胞中诱导细胞死亡(图。3l–q).我们证实erastin治疗有效地抑制了胱氨酸的摄取(补充图。3e)并且用TCEP或2-ME处理增加了细胞外半胱氨酸水平(补充图。3f).(值得注意的是,2-ME对增加细胞外半胱氨酸水平的作用比TCEP更温和。这是因为TCEP和2-ME如何减少细胞外胱氨酸的机制基础有些不同:TCEP直接将胱氨酸切割成两个半胱氨酸分子,而2-ME与胱氨酸反应生成半胱氨酸和2-ME与半胱氨酸的混合二硫化物[即Cys-Cys + 2-ME → Cys + 2-ME-Cys]。因为细胞外的半胱氨酸是不稳定的,它继续与另一个2-ME分子[或2-ME-2-ME二硫化物]反应,最终大多数产物为2-ME-Cys二硫化物,它可以通过L系统被细胞吸收25并随后在细胞内转化回半胱氨酸,从而仍然绕过SLC7A11介导的胱氨酸转运,为GSH合成提供细胞内半胱氨酸(补充图。3c)).

图3:阻断胱氨酸摄取和消除二硫化物压力抑制高SLC7A11诱导的细胞死亡2O2治疗。
figure 3

ac胞内胱氨酸浓度的测量(a),GSSG(b),以及GSSG/谷胱甘肽比率(c)在用载体或1 mM H处理的SLC7A11-low 786-O细胞中2O2对于用载体或1 mM H处理的2 h和slc7a 11-高786-O细胞2O2在有或没有5微米erastin、1 mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)、1mM 2-巯基乙醇(2-ME)、2 mMN乙酰半胱氨酸(NAC),2毫米D-青霉胺(D-Pen),或2毫米L-青霉胺(左旋笔)。d, e细胞内γ-谷氨酰-胱氨酸的相对水平(d)和γ-谷胱甘肽-半胱氨酸(e)在用载体或1 mM H处理的SLC7A11-low 786-O细胞中2O2对于用载体或1 mM H处理的2 h和slc7a 11-高786-O细胞2O2在有或没有5个微米erastin、1毫米TCEP、1毫米2-ME、2毫米NAC、2毫米D-青霉胺,或2毫米L青霉胺。fk响应1 mM H的细胞死亡2O2用或不用5微米erastin处理6小时(f),1毫米TCEP(g),1 mM 2-ME(h),2毫米NAC(i),2毫米D-青霉胺(j),或者2毫米L-青霉胺(k)在slc7a 11-高786-O细胞中,使用碘化丙锭(PI)染色测量。lq响应1 mM H的细胞死亡2O2用或不用5微米erastin处理24小时(l),1毫米TCEP(m),1 mM 2-ME(n),2毫米NAC(o),2毫米D-青霉胺(p),或者2毫米L-青霉胺(q)在T98G细胞中,使用PI染色测量。数据以平均值±标准差表示;n= 3.n表示独立重复。P价值由双尾不成对学生的决定t测试。源数据作为源数据文件提供。

H2O2已知会诱发活性氧(ROS)5,6。因此,我们测量了载体中的活性氧水平2O2-低、中或高SLC7A11表达的经处理的786-O细胞。我们的结果显示,在正常的培养条件下,slc7a 11-中或-高水平的细胞比slc7a 11-低水平的细胞表现出较低水平的活性氧,正如所预期的,slc7a 11-中或-高水平的细胞表现出较高水平的活性氧。2O2治疗增加了活性氧水平(补充图。3g).在H下2O2治疗,SLC7A11的中度过表达抑制ROS水平,而高度过表达显著增加ROS水平(补充图。3g).然后我们研究了ROS水平的增加是否在H2O2-在slc7a 11-高细胞中诱导细胞死亡。我们发现用ROS清除剂Trolox治疗能有效抑制H2O2-诱导活性氧(补充图。3h,我),但没有影响H2O2slc7a 11-高癌细胞中-触发的细胞死亡(补充图。3j,k).相反,erastin治疗显著抑制了H2O2-诱导细胞死亡(图。3f,l),但并没有压制H2O2-诱导活性氧(补充图。3l,m).这些数据因此建立了H2O2SLC7A11高细胞中-诱导的细胞死亡和ROS。总的来说,我们的数据表明在H2O2治疗可能是由SLC7A11介导的胱氨酸转运和二硫化物积聚引起的,而不是由ROS本身引起的。

最后,由于SLC7A11是一种输入胱氨酸和输出谷氨酸盐的反向转运蛋白,细胞内谷氨酸盐水平的降低(由SLC7A11介导的谷氨酸盐输出引起)可能也有助于H。2O2-在slc7a 11-高细胞中诱导细胞死亡。细胞内谷氨酸主要由谷氨酰胺通过谷氨酰胺酶(GLS;补充图4a).因此,这个假说将预测GLS抑制,类似于SLC7A11的高表达,将降低细胞内谷氨酸水平并促进H2O2通过结合GLS抑制和SLC7A11高表达来进一步减少细胞内谷氨酸水平会加剧H2O2诱导细胞死亡。然而,我们发现,在SLC7A11低表达的细胞中,用GLS抑制剂CB-839治疗比SLC7A11高表达引起的细胞内谷氨酸水平下降更多(补充图。4b)却没能提升H2O2-诱导细胞死亡(补充图。4c).此外,尽管CB-839处理进一步降低了SLC7A11高细胞中的细胞内谷氨酸水平(补充图。4b),CB-839连衰减H2O2在slc7a 11-高细胞中诱导细胞死亡(补充图。4c),可能是因为通过CB-839治疗降低细胞内谷氨酸水平抑制了SLC7A11介导的胱氨酸摄取(补充图。4d).综上所述,这些数据表明H。2O2-处理的slc7a 11-高细胞与谷氨酸盐输出没有直接关系。

NADPH的消耗有助于增加对H2O2slc7a 11-高癌细胞

胱氨酸还原成半胱氨酸和抗氧化防御H2O2要求NADPH作为还原当量(补充图。1a).因此,我们测量了SLC7A11低、中、高细胞中NADPH水平2O2治疗。如图所示。4a,H2O2治疗增加了NADP+/NADPH比值在slc7a 11-高水平细胞中比在slc7a 11-低水平或-中等水平细胞中显著增加,表明在H2O2治疗。H2O2治疗也增加了NADP+T98G细胞中的/NADPH比率并敲除SLC7A11使增加的NADP正常化+H下的/NADPH比率2O2治疗(图4b).同样,通过erastin或柳氮磺胺吡啶抑制SLC7A11介导的胱氨酸转运至少部分使增加的NADP正常化+H引起的/NADPH比率2O2在这些SLC7A11高细胞中的治疗(图。4c–e),表明SLC7A11-high细胞中胱氨酸的高摄取率有助于H2O2治疗。

图4: NADPH消耗有助于增加对H的敏感性2O2slc7a 11-高癌细胞中。
figure 4

aNADP的测量+用载体或1 mM H处理的slc7a 11-低、中和-高786-O细胞中的/NADPH比率2O2在指定的时间点。bNADP的测量+shCtrl和中的/NADPH比率SLC7A11用载体或1 mM H处理的敲除T98G细胞2O2持续2 h。cNADP的测量+共处理1 mM H的SLC7A11-high 786-O细胞中的/NADPH比率2O2和5微米伊拉斯汀或10微米柳氮磺胺吡啶。d, eNADP的测量+用1 mM H共处理的T98G细胞中的/NADPH比率2O2和5微米·伊拉斯汀(d)或10微米柳氮磺胺吡啶(SAS)(e). f使用蛋白质印迹法测量slc7a 11-低和-高786-O细胞中GPX1的蛋白水平。纽蛋白用作装载对照。g响应于1 mM H处理的细胞死亡2O2在sgCtrl或sg中持续6小时GPX1使用PI染色测量感染的slc7a 11-低和-高786-O细胞。hjNADP + /NADPH比率的测量(h),相对GSSG水平(i),以及GSSG/谷胱甘肽比值(j)在sgCtrl或sgGPX1感染slc7a 11-低和-高786-O细胞。kslc7a 11-低和-高786-O细胞中Flag-三磷酸吡啶核苷酸氧化酶(TPNOX)的蛋白水平。纽蛋白用作装载对照。lNADP的测量+空载体(EV)或TPNOX过表达的slc7a 11-低和-高786-O细胞中的/NADPH比率2O2治疗。m响应于1 mM H处理的细胞死亡2O2在slc7a 11-低和-高786-O细胞中持续6小时,使用PI染色测量EV或TPNOX过表达。n响应于1 mM H处理的细胞死亡2O2在SLC7A11-high 786-O细胞中用或不用2mm 2-脱氧葡萄糖(2-DG)处理或葡萄糖(Glc-)饥饿6小时,使用PI染色测量。o响应于1 mM H处理的细胞死亡2O2或葡萄糖饥饿24小时,有或没有2 mM 2-DG,在T98G细胞中使用PI染色测量。数据以平均值±标准差表示;n= 3.n表示独立重复。P价值由双尾不成对学生的决定t测试。不重要。源数据作为源数据文件提供。

抗氧化防御H2O2主要由谷胱甘肽依赖性过氧化物酶如GPX1介导。因此,我们研究了GPX1在H2O2-在slc7a 11-高细胞中诱导细胞死亡。我们发现GPX1SLC7A11-low 786-O细胞的缺失增加了H。2O2-诱导的细胞死亡(这与GPX1在H2O2-诱导氧化应激;图。4f,g);有趣的是,GPX1SLC7A11高对应体的缺失具有相反的效果,并适度抑制H。2O2-诱导细胞死亡(图。4f,g).一贯地,GPX1缺失也减轻了NADPH消耗和GSSG水平(以及GSSG/谷胱甘肽比率)的增加2O2-处理的slc7a 11-高细胞(图。4h–j).应该注意的是,细胞死亡的减少是由GPX1H中的删除2O2-处理的slc7a 11-高细胞是中等的(图。第四代移动通信技术),可能是因为GPX1一方面,缺失保留了更多的NADPH,因此保护slc7a 11-高细胞免于二硫化物应激诱导的细胞死亡,但另一方面,仍然使这些细胞易受H2O2-诱导氧化应激,最终导致细胞死亡。

为了进一步研究NADPH消耗在H。2O2-诱导SLC7A11高表达细胞死亡,我们研究了增加NADPH消耗是否可以使SLC7A11低表达细胞对H2O2诱导细胞死亡。为此,我们诱导了遗传编码的、形成水的NADPH氧化酶,三磷酸吡啶核苷酸氧化酶(TPNOX)的表达,该氧化酶氧化胞质NADPH,因此可用作增加NADP的遗传工具+/NADPH比率26)在slc7a 11-低或-高癌细胞中(图。4k).在H下2O2治疗,TPNOX过度表达增加了NADP+slc7a 11-低细胞中的/NADPH比率,而不是slc7a 11-高细胞中的(图。4l),可能是因为SLC7A11高细胞已经表现出高NADP+/NADPH比值。相应地,TPNOX过度表达显著增加了H。2O2-处理slc7a 11-低细胞,但其促进H2O2-处理的slc7a 11-高细胞非常适中(图。4m).

我们先前表明,通过2-脱氧葡萄糖(2-DG)处理增加细胞的NADPH供应可以防止葡萄糖缺乏、SLC7A11过度表达的癌细胞中的二硫化物应激和细胞死亡(作为葡萄糖类似物,2-DG可以被分流到戊糖磷酸途径中以产生NADPH)12。在目前的研究中,我们证实了2-DG治疗阻止了SLC7A11和T98G细胞高过表达的786-O细胞中葡萄糖饥饿诱导的细胞死亡;然而,2-DG处理不能预防H2O2在这些slc7a 11-高细胞系中诱导细胞死亡(图。4n,o).这个结果并不令人惊讶。在葡萄糖饥饿条件下,2-DG代替葡萄糖向细胞提供NADPH,而在H2O2治疗中,细胞在充满葡萄糖的培养基中培养(在这种条件下,葡萄糖继续支持NADPH的生成),这解释了2-DG不能预防H2O2诱导这些细胞死亡。这些结果也强调了在H2O2治疗与葡萄糖缺乏(见后面更详细的讨论)。总之,我们的数据表明SLC7A11的高表达与H2O2治疗耗尽了NADPH,它有可能导致H2O2诱导细胞死亡。

SLC7A11的高过表达促进原发性肿瘤生长,但抑制肿瘤转移

血液中的氧化环境导致了转移的低效性。大多数癌细胞在转移过程中死于氧化应激,少数成功转移的癌细胞通常表现出增强的抗氧化能力,至少部分是通过上调NADPH生成途径4,27。考虑到NADPH与转移的高度相关性,我们检测了SLC7A11低、中或高表达对转移(以及原发性肿瘤生长)的影响。在786-O异种移植肿瘤模型中,与slc7a 11-中度或低度肿瘤相比,slc7a 11-高度肿瘤表现出显著增加的肿瘤生长(图。5a),这与我们和其他人先前揭示SLC7A11在促进肿瘤生长中的作用的发现一致8,16,17,28.

图SLC7A11的高度过表达促进原发性肿瘤生长,但抑制肿瘤转移。
figure 5

a皮下注射后指示的786-O异种移植肿瘤的肿瘤体积的测量(n= 8只小鼠)。b显示小鼠心脏内注射方法的示意图。c在心脏内注射指示的786-O细胞后,在小鼠中的光子通量(每秒光子数)的量化标准化到第0天(n= 9只老鼠)。d心脏内注射指示的786-O细胞5周后小鼠的生物发光图像(左)和全身光子通量(每秒光子数)的统计分析(右) (n= 9只老鼠)。eSLC7A11低、中和高786-O细胞肝转移的代表性图像。f具有肿瘤转移的肝脏的苏木精和曙红(H&E)和免疫组织化学染色(SLC7A11)的代表性图像来自于786-O细胞。比例尺,20 μm“T”代表肿瘤细胞。g在心脏内注射含PBS的slc7a 11-低786-O细胞和用PBS、NAC或Trolox处理的-高786-O细胞后,在小鼠中标准化至第0天的光子通量的量化(n=低+ PBS和高+ Trolox组的4只小鼠,n=高+ PBS和高+ NAC组的5只小鼠)。h在心脏内注射指示的H1299细胞后,在小鼠中的光子通量的量化标准化到第0天(n= 7只老鼠)。i心脏内注射指示的H1299细胞30分钟后小鼠的生物发光图像(左)和全身光子通量的统计分析(右)。(n= 7只老鼠)。jSLC7A11低、中和高H1299细胞肝转移的代表性图像。k对...的分析SLC7A11来自II-III期乳腺癌匹配患者的乳腺原发肿瘤和循环肿瘤细胞(CTCs)之间的表达水平(GSE111842n原发性肿瘤= 12,且n= CTC为16)。l对...的分析SLC7A11雌激素受体阳性表达(ER+)乳腺原发性肿瘤(PTs来自癌症基因组图谱)和CTCs (GSE75367和GSE86978n= 1015用于PTs和n= CTC为99)。数据以平均值±标准差表示。P价值由双尾不成对学生的决定t测试。不重要。源数据作为源数据文件提供。

然后,我们将相同数量的荧光素酶标记的SLC7A11高、中、低表达水平的786-O细胞注射到小鼠心脏内(图。5b).心内注射30分钟后,我们在三组小鼠中观察到相等的全身生物发光信号(补充图。5a;第0天),表明肿瘤细胞已经快速分布在小鼠体内。每周生物发光成像显示,注射后5周,注射了低或中度SLC7A11表达的786-O细胞的小鼠发生了向不同器官的转移,最显著的是肝脏(图。5c,d).引人注目的是,尽管SLC7A11的高过表达促进了原发性肿瘤的生长(图。5a),它显著抑制转移(图。5c,d).在终点的进一步分析显示,注射slc7a 11-低或中度细胞的小鼠的肝脏比注射slc7a 11-高细胞的小鼠的肝脏表现出更大的结节(图。5e).组织病理学分析显示,注射slc7a 11-低或中度癌细胞的小鼠的肝脏标本经常含有大的转移结节,而注射slc7a 11-高癌细胞的小鼠的肝脏标本偶尔含有小的转移结节(图。5f).免疫组织化学分析证实SLC7A11高转移结节中SLC7A11染色强于SLC7A11中或低转移结节(图。5f),但在SLC7A11高、中、低转移结节中Ki67染色没有显著差异(补充图。5b,c);此外,与slc7a 11-中或低结节相比,slc7a 11-高模块显示裂解的胱天蛋白酶-3染色减少(补充图。5b,d),这不能解释SLC7A11高表达肿瘤的转移减少(图。5d).

我们进一步表明,NAC治疗几乎完全恢复slc7a 11-高肿瘤的转移至与载体治疗的slc7a 11-低肿瘤相似的水平,而Trolox对slc7a 11-肿瘤具有最小的挽救作用(图。5g),这与我们的体外数据一致(图。3i,o和补充图。3j,k)并表明促进细胞死亡的作用至少是SLC7A11介导的高转移抑制的部分原因。相反,TPNOX过表达适度减少SLC7A11低表达肿瘤的转移(补充图。5e),这与TPNOX过表达对耗尽NADPH和促进H2O2SLC7A11高过量表达诱导的细胞死亡(见图。4l,m).最后,我们表明,在H1299肿瘤模型中,SLC7A11的高(但不是中度)过表达促进了肿瘤生长(补充图。5f)还抑制了转移(图。5h–j和补充图。5g).

我们的动物研究数据表明,血液中的氧化环境应选择抑制SLC7A11高表达的循环肿瘤细胞(CTC)。为了验证这个假设,我们检查了SLC7A11来自RNA-Seq数据集的表达水平,该数据集具有来自匹配患者的16个CTC和12个可用的原发性乳腺肿瘤样品29。为了支持我们的假设,分析显示SLC7A11在50%(12例中的6例)的原发性肿瘤样本中高表达,但在CTC中只有12%(16例中的2例)(图。5k).因为这项研究的样本量有限,我们进一步比较了SLC7A11来自癌症基因组图谱数据集的原发性乳腺肿瘤样本和来自其他研究的乳腺CTC之间的表达30,31(注意,这些数据集不是从匹配的患者中生成的)。分析再次表明,原发性乳腺肿瘤的SLC7A11表达明显高于乳腺CTC(图。5l).总之,我们的数据表明,至少在我们检测的细胞系或肿瘤模型中,SLC7A11高表达促进原发性肿瘤生长,但抑制转移,可能是因为SLC7A11高表达的癌细胞易受转移过程中氧化应激诱导的细胞死亡的影响。

讨论

以前,我们和其他人表明,在SLC7A11过表达的癌细胞中,胱氨酸还原成半胱氨酸消耗了大量的NADPH。因此,SLC7A11过度表达结合葡萄糖饥饿耗尽细胞内NADPH,并引发二硫化物应激和有效的细胞死亡12,13。这些发现提出了一个问题,SLC7A11过表达是否在其他NADPH耗竭条件下促进二硫化物应激和细胞死亡。在这项研究中,我们发现SLC7A11的高过表达也促进NADPH耗竭,并引发二硫键应激和随后的细胞死亡2O2治疗,一种氧化应激诱导条件,已知消耗NADPH。因此,高SLC7A11诱导的细胞死亡不仅限于葡萄糖饥饿,还可以扩展到其他NADPH消耗条件,这表明这种类型的细胞死亡可以在更广泛的背景下发生。

我们最近发现,在葡萄糖饥饿条件下,slc7a 11-中度/-高度细胞中细胞内二硫化物的过度积累促进了肌动蛋白细胞骨架蛋白中的异常二硫键、F-肌动蛋白塌陷和细胞收缩,并随后诱导了一种独特形式的细胞死亡,我们称之为二硫化物中毒14。H2O2slc7a 11-高细胞中的-诱导的细胞死亡与二硫蛋白沉着症有几个共同的特征,包括(1)在两种条件下的细胞都表现出异常水平的细胞内二硫分子(如胱氨酸);(2)可以通过二硫键还原剂(例如TCEP和2-ME)或通过二硫键交换再生游离硫醇的试剂(例如D-和L-青霉胺)来防止细胞死亡;和(ROS清除剂(如Trolox)或阻断其他形式的细胞死亡(如凋亡和铁下垂)的抑制剂不能挽救细胞死亡。因此,我们建议H2O2slc7a 11-高细胞中-诱导的细胞死亡很可能是细胞凋亡,尽管需要更多的研究来进一步确定这种细胞死亡的特征。

尽管葡萄糖饥饿诱导和H2O2slc7a 11-高细胞中-诱导的细胞死亡是由NADPH耗竭和二硫化物应激触发的,NADPH耗竭的潜在机制在这两种情况下有些不同。在葡萄糖饥饿的情况下,NADPH耗竭是由阻断NADPH生成(通过葡萄糖剥夺)和增加NADPH消耗(通过增强slc7a 11-过表达细胞中胱氨酸的减少)的联合作用引起的。相比之下,在H2O2治疗中,NADPH被两种NADPH消耗过程——H2O2治疗和胱氨酸减少——没有NADPH生成的损害。因此,需要更高的SLC7A11表达来消耗NADPH,使其低于H2O2比在葡萄糖饥饿的情况下。这至少部分解释了为什么SLC7A11的适度过表达不能诱导H2O2但是在葡萄糖饥饿的情况下诱导强烈的细胞死亡。

在目前的文献中,这表明SLC7A11在氧化应激条件下具有保护作用8我们发现SLC7A11过表达促进了H2O2-诱导的细胞死亡是令人惊讶和违反直觉的。我们认为SLC7A11在H2O2治疗。SLC7A11介导的胱氨酸输入增加了细胞内半胱氨酸和谷胱甘肽的储备,这有助于细胞应对H2O2-诱导氧化应激;然而,将胱氨酸还原成半胱氨酸会消耗NADPH,当与H2O2治疗(图6a).我们进一步提出SLC7A11在H2O2治疗由其表达水平决定。具体来说,SLC7A11在癌细胞中的适度过表达似乎是有益的,因为GSH的抗氧化作用似乎比胱氨酸减少的NADPH消耗作用更强;因此,SLC7A11中度过表达抑制H2O2-诱导细胞死亡(图。6b).相反,在高SLC7A11过表达的癌细胞中,H2O2治疗会抵消谷胱甘肽的任何有益作用,导致氧化还原系统崩溃和细胞快速死亡(图。6c).

图6:描述SLC7A11的不同表达水平如何决定癌细胞中对氧化应激的不同反应的工作模型。
figure 6

aSLC7A11将胱氨酸输入细胞产生GSH,可以解毒H2O2。然而,胱氨酸还原成半胱氨酸和GSSG还原成谷胱甘肽都消耗NADPH。b在SLC7A11中度表达的细胞中,GSH解毒H2O2似乎比胱氨酸减少的NADPH消耗作用更强,导致对H2O2. c在SLC7A11高表达和高胱氨酸摄取的细胞中,H2O2治疗导致细胞内胱氨酸和其他二硫化物分子的急剧积累和NADPH的耗竭,这抵消了GSH的有益作用,并引发快速二硫化物中毒。这解释了为什么对H2O2在slc7a 11-高细胞中。NADPH烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,GSH还原型谷胱甘肽,GSSG谷胱甘肽二硫化物。

有趣的是,增加胱氨酸的输入也显示出促进H2O2-诱导细胞死亡大肠杆菌;值得注意的是,SLC7A11在大肠杆菌,它使用不同的转运蛋白cysB来介导胱氨酸的输入32。从机理上讲,有人提出,一旦细胞内的胱氨酸被还原成半胱氨酸,高水平的半胱氨酸可能会促进H2O2通过芬顿反应转化为高毒性的羟基自由基,从而促进细胞死亡32。然而,我们发现用铁螯合剂去铁胺(DFO)治疗未能挽救H2O2在我们的研究中使用的slc7a 11-高癌细胞中诱导细胞死亡(补充图。6a);作为对照,DFO处理消除了这些细胞系中RSL3诱导的铁下垂(补充图。6b).因此,高胱氨酸输入在H2O2治疗在进化上是保守的,但细胞显然在进化过程中发展了不同的潜在机制。

SLC7A11介导的胱氨酸摄取在抗氧化防御中起重要作用,包括减轻对肿瘤生长有益的睑下垂,SLC7A11在多种人类癌症中过表达8。与此一致,我们的数据显示SLC7A11的高过表达促进了原发性肿瘤的生长。然而,我们的研究也揭示了SLC7A11的高过表达抑制了肿瘤转移,CTCs表现出比来自患者的原发性肿瘤样本更低的SLC7A11表达,鉴于SLC7A11已确立的肿瘤促进作用,这似乎是违反直觉的。我们认为这可能是由于slc7a 11-高癌细胞在转移过程中对氧化应激诱导的细胞死亡过度敏感。值得注意的是,虽然原发性癌细胞通常表现出高氧化应激,但转移的癌细胞由于它们脱离原发性肿瘤并迁移到体内远处时所面临的不利微环境而经常遭遇甚至更大的氧化应激4,27。因此,slc7a 11-高癌细胞对氧化应激的敏感性在转移癌细胞中可能比在原发肿瘤细胞中更明显。这可能有助于解释,至少部分地,SLC7A11高过表达在原发性肿瘤生长和肿瘤转移中的不同作用。我们目前的数据进一步表明,SLC7A11高表达的癌细胞在原发性肿瘤中被正向选择,但在转移性肿瘤中被负向选择。值得注意的是,完全去除SLC7A11表达也抑制了肿瘤转移33,表明SLC7A11的中等表达水平可能对肿瘤转移最有利,尽管需要进一步的研究来完全检验这一假设。进一步了解SLC7A11在癌症中的这种环境依赖性功能可能会为某些SLC7A11高水平癌症中二硫化物应激诱导的代谢脆弱性的治疗靶向提供重要的见解。