主要的

实体瘤的转移进展是癌症患者死亡的主要原因1。下一代测序(NGS)研究提供了转移性癌症基因组景观的详细注释;然而,我们对特定基因组事件在驱动具有转移能力的克隆出现中的作用的理解仍然难以捉摸1,2。在不同的肿瘤类型中,转移性肾细胞癌(RCC)是研究特定基因组事件在肿瘤进展中的作用以及从功能上建立基因型-表型进化图的极好的癌症模型2,3。RCC是相对惰性的肿瘤,可以用保守策略有效治疗;然而,多达三分之一的患者出现或发展为以广泛的系统性传播为特征的疾病的侵袭性形式4。因此,理解导致肾癌侵袭性和转移性扩散的病理生理学驱动因素至关重要5。晚期肾细胞癌的NGS分析和通过多区域测序进行的肿瘤进化的系统发育重建已经确定了与转移谱系出现相关的遗传损伤和模式,包括表观遗传调节剂的破坏(集合2, BAP1),细胞周期检查点的调节因子(TP53, CDKN2A/B)和细胞命运(NF2, FAT1),以及多克隆驱动因子和复杂核型特征(14q和9p缺失)的存在3,6,7,8,9,10,11,12(扩展数据图。1a–l和补充表格1),提供了一个极好的模型来从功能上剖析基因组-现象组关联,并理解这些事件是功能性转移驱动因素还是随机癌症进化的附带现象13。因此,我们将利用基于CRISPR–cas 9的基因组编辑,建立高通量的体细胞镶嵌基因工程小鼠模型(SM-GEMM)体内和离体平台,以功能性地捕捉转移性肾细胞癌的进化模式和临床特征。这种方法使我们能够探索特定的基因组重排及其对获得转移能力的影响。SM-GEMM的基因组注释揭示了人类和鼠模型中转移播散改变的常见模式,通过对复发基因组特征的跨物种分析得到了证实。我们的研究从功能上证明了通过染色体不稳定性(CIN)获得的非整倍体进化保守模式在驱动肾癌恶性进展中的作用。我们发现,通过干扰干扰素信号通路,肾肿瘤集中于获得“CIN耐受”表型。这些发现为导致惰性肿瘤转移进展的常见进化保守途径提供了重要见解。

结果

9p缺失驱动RCC转移能力的获得

为了研究肾细胞癌转移潜能的获得,我们设计了驱动肾细胞癌进展的最常见肿瘤抑制基因(TSG)的鼠直向同源物的组织特异性体细胞敲除组合(Vhl, Nf2, 集合2, Bap1Trp53)通过肾包膜下施用携带单导向RNA(SGR nas)的腺相关病毒(AAV)颗粒,靶向表达组织特异性条件性Cas9等位基因和用于示踪目的的荧光报告基因的小鼠的肾上皮(图。1a–d).这些常见TSG的组合始终产生惰性肿瘤,其特征在于低外显率、长潜伏期和有限的侵袭潜力,具有高分化癌的组织病理学特征,这表明上述基因的体细胞失活不足以促进侵袭性疾病和转移扩散(图。1e,f).因此,我们设计了一对针对细胞周期调节基因的sgRNAsCdkn2aCdkn2b在与人9p21.3同线的鼠4号染色体上(4q9p21),这是一种与受RCC影响的患者的转移进展相关的复发性染色体异常3。引人注目的是,体细胞基因操纵4q9p21与...结合的位置Nf2集合2击倒对手或Vhl集合2通过临床和组织病理学分析评估,敲除导致快速致命性肿瘤的出现,并具有广泛全身播散和广泛肉瘤样分化的显著趋势(肉瘤样肾细胞癌,sRCC )(图。1g–k2a,b).这些特征与侵袭性肾细胞癌一致,并密切反映了晚期患者的转移扩散模式14(图。2c,d).

图1:肾细胞癌的SM-GEMM。
figure 1

a,显示SM-GEMM设计的示意图。癌症特异性功能缺失突变是通过脑实质内递送携带特异性sgRNA组合的AAV颗粒而引入的。b代表E14Pax8Cre/+ -R26LSL-TdT/+胚胎。在发育中的后脑、脊索和肾中可以容易地理解荧光报道基因TdT的激活。n= 5个胚胎。c的示意图,显示了携带FLEx-GFP报告序列的基于AAV的追踪系统。用GFP特异性抗体染色的代表性FFPE切片的IHC分析。n= 5只老鼠。d,T7-核酸内切酶分析验证sgRNATrp53(一),Nf2(二),Bap1(c),集合2(d),Cdkn2a(五),Cdkn2b(f)和阴性对照(*)。图像代表n= 3个独立实验。e,通过体细胞镶嵌敲除获得的鼠RCC的病理学特征Nf2集合2。(I)转导后8个月收集的大体标本;(II)在转导后8个月,轴向T2 MRI扫描显示小的皮质损伤;以及(III)和(IV)分别在转导后6个月和8个月收集的分化良好的肿瘤的苏木精和伊红(H&E)染色切片。f,Kaplan–Meier分析受Nf2KO驱动的肿瘤影响的小鼠的癌症特异性存活率。: Nf2击倒取胜-Bap1击倒取胜 (n= 40只小鼠);纳秒: Nf2击倒取胜-集合2击倒取胜 (n= 20只小鼠);(美)国家标准局(National Bureau of Standards): Nf2击倒取胜-集合2击倒取胜-Trp53击倒取胜 (n= 24只小鼠)。P= 0.23, 0.054, 0.12.g上图,转导后3个月的代表性冠状T2 MRI扫描Nf2击倒取胜-集合2击倒取胜-4q9p21老鼠。红色箭头,原发肿瘤块;红色虚线表示肺转移。下图是老鼠器官的代表性发光扫描。1、原发肿瘤;2、肺转移;3、肝转移。图像代表n= 2次实验。h,表征Nf2击倒取胜在遗传靶向与人9p21.3同线的鼠基因座(4q9p21):代表性宏观图像(上图)、H&E、IHC和IF分析(下图)。图像代表n= 2次实验。i,Kaplan–Meier分析受以下因素影响的小鼠的癌症特异性存活率Vhl击倒取胜-驱动的肿瘤,具有(n= 20只小鼠)或没有(n= 20只小鼠)4q9p21损失,P= 1.18 × 10−8. j,k,表征Vhl击倒取胜基因靶向的小鼠肿瘤4q9p21轨迹:代表性宏观图像(j),显示了特定透明细胞RCC标记物(PAX8和CD31)的H&E和IHC分析(k).PT,原发肿瘤;LuM,肺转移;LiM,肝转移;PaM,胰腺转移;MeM,肠系膜转移;暗淡,膈肌转移。图像代表n= 2次实验。NS,不显著;****P < 0.0001 by log-rank (Mantel–Cox) test. Scale bar, 200 μm. BF, brightfield; E, embryonic day; FFPE, formalin-fixed paraffin-embedded; IF, immunofluorescence; MRI, magnetic resonance imaging; RLU, renilla luciferase.

源数据

图2: CIN是侵袭性转移性肾细胞癌的一个特征。
figure 2

a,卡普兰-迈耶的生存分析Nf2击倒取胜-驱动的肿瘤,具有(n= 99只小鼠)和没有(n= 84只小鼠)4q9p21目标是sgRNAs。P < 1 × 10−15. b、方框图和须状图显示了4q9p21 (n= 69只小鼠)和4q重量 (n= 15只小鼠)模型;数据以平均值±标准差表示,P= 1.16 × 10−6. c,d位点特异性转移的跨物种比较(c)和疾病负担(d);嗯,家鼠, n= 79只小鼠;Hs,智人. e,显示WES结果的汇总热图(n=来自19只小鼠的81份样品)(补充表格)1). f在SM-GEMM中,人类与小鼠染色体区域的共线性图发生了显著改变。统计数据来源于n= 81个样本。g,柱状图显示了原发部位(上图)和转移部位(下图)的私人和躯干躯体事件的百分比。h密度图显示了观察到的体细胞突变的VAF。i,cGAS(红色)和DAPI(蓝色)(中图和下图)的正常后期(左上)和异常中期(右上)的组织学高倍视野放大。箭头表示微核。比例尺,30 μm。图像代表n= 3次实验。j,k、显示具有异常有丝分裂的肿瘤细胞百分比的方框图和须状图(j),数据表示为中值、最小值和最大值(对于第2组分别为26.6、20、56.6,对于第1组分别为70、88和95);和微核(k),数据表示为中值、最小值和最大值(第2组分别为3、1、6,第1组分别为8.5、4和12)。n=每种情况下8个肿瘤(j), n=每种情况下12个肿瘤(k); P= 1.80 × 10−7 (j)和1.34 × 10−6 (k). l,m,卡普兰-迈耶生存分析(l)和转移病灶计数(m)在聚类1和聚类2中RCC GEM模型移植;P= 3.08 × 10−10 (l, n= 57只小鼠)且< 1 × 10−15 (m, n= 109只小鼠)。n,小提琴图显示非整倍体分数与9p地位和WGD (9p, n= 212肿瘤;9p重量, n= 710肿瘤);P < 1 × 10−15P= 3.07 × 10−2. o,显示9p年WGD流行率的条形图重量和9pTCGA和MSKCC数据集的案例(n= 922肿瘤);P < 1 × 10−15. *P < 0.05, ****P < 0.0001 by log-rank (Mantel–Cox) test (a,l),双尾t-测试(b,j,k,m),双尾曼-惠特尼检验(n)和双边费希尔精确检验(o).鲁,肺;m,鼠标;RDR,读深度比;Sp,内脏。

源数据

肾细胞癌的趋同基因组进化

为了剖析侵袭性鼠肾细胞癌的分子驱动因素,我们开始通过多区域全外显子组测序(WES)进行基因组表征,并在选定的情况下,对来自19个不同SM-gemm的总共100个样本(50个原发病灶,21个转移部位,10个肿瘤衍生细胞系和19个匹配的健康对照)进行全基因组测序(WGS)。我们把基因组分析的重点放在Nf2-设置2-4q9p21-驱动模型(补充表1).体内体细胞镶嵌工程揭示了高效的体内编辑,允许检测4q9p21由于纯合子缺失或缺失跨越造成的破坏Cdkn2aCdkn2b基因(扩展数据图。2a–d和补充表格1).此外,我们研究了鼠肿瘤的突变谱,揭示了与人类肾细胞癌的显著相似性,包括相对较低的突变负荷(0.34体细胞突变,外显子突变;变异等位基因频率(VAF)≥0.1/Mb)和原发部位和转移部位突变特征的高度一致性(扩展数据图)。3a–c).具体来说,由自发胞苷脱氨作用组成的信号1 (C>T)的相对流行提示在肾细胞癌中出现的突变过程中的跨物种趋同进化15。接下来,我们对原发肿瘤和转移部位进行了拷贝数变异(CNV)分析;引人注目的是,我们发现了高度重复的CNV事件的出现,例如12号和16号染色体的丢失和5号染色体的获得(图。2e和扩展数据图。4a、b跨物种基因组分析证明了小鼠和人RCC之间的显著相似性,如同线基因组区域的比较检查所证明的(图。2f).为了进一步表征转移性肾细胞癌的基因组决定因素,特别是这些特定核型出现的时间,我们通过分析杂合单核苷酸多态性(SNPs)推断肿瘤倍性,并确定全基因组重复(WGD)事件先于特定染色体改变的出现(扩展数据图。4c–h).这些观察结果以及躯干单核苷酸变异(SNV)事件的最小存在与异常核型的早期选择和固定以及具有高适应性的克隆的快速扩增是一致的3,16(图。2g,h和扩展数据图。5a).

复杂核型通过CIN的出现一直与各种癌症类型的更差预后和对治疗的不良反应一致相关;然而,对于特定的改变是否有助于转移能力,或者更确切地说是一种附带现象,功能证据有限1,17。鼠肿瘤的基因组特征鉴定了两个不同的基因组簇,其特征在于CNVs的复发模式和相对不稳定的基因组(簇1)或少数全染色体改变和CNVs的不一致模式(簇2)。对1号簇和2号簇肿瘤的细胞学分析揭示,在前者中,异常有丝分裂的增加和微核的存在导致通过细胞质DNA积累参与cGAS/STING途径(图。2i–k)18。表型分析表明,从第1组原发性肿瘤建立的肿瘤外植体的特征在于具有较高外显率、较短生存期和转移负担显著增加的侵袭性临床过程(图。2l,m).为了进一步证实复杂核型和侵袭性肾细胞癌之间的联系,我们分析了癌症基因组图谱(TCGA)肾细胞癌队列的基因组和临床数据,结果显示9p21缺失肿瘤的特征在于高比例的拷贝数改变(fCNA)基因组和WGD的存在(图。2n,o).总之,这些数据表明基因组不稳定性的获得普遍存在于9p21RCCs改变,导致侵袭性肿瘤细胞群的出现。

侵袭性肾细胞癌的功能异质性

解剖肾细胞癌进展的分子通路4q9p21损失,我们产生了基因工程肾脏器官(GEKOs ),携带体细胞敲除Nf2集合2TSGs随着失活Cdkn2a/b染色体上4q9p21并进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析,旨在提供RCC进化中9p缺失的动态多维景观(图。3a和扩展数据图。6a).在质量过滤之后,从13个样本中检索到87,718个细胞,在18个不同亚型中聚类。GEKO细胞推测轨迹的计算解卷积揭示了多种途径的转录异质性。4q9p21跨越两个独立的算法19,20(图。3b,c扩展数据图。6b方法).尽管如从基因组分析中观察到的,遗传异质性水平普遍较低,并且早期选择了具有高适合度和复杂核型的恶性克隆,但scRNA-seq数据表明,CIN倾向于在侵袭性类器官模型(Nf2击倒取胜-集合2击倒取胜-4q9p21)和转录组异质性的总体增加Nf2击倒取胜-集合2击倒取胜类器官。此外,4q9p21类器官表现出与细胞周期进程相关的基因的显著富集,具有S或G2/M期转录组特征的细胞比例较高,同时具有间充质可塑性和肉瘤样分化的标志。这些证据支持我们之前在SM-GEMMs中的观察,并且与来自患者的数据一致21(扩展数据图。6c–e).

图3:染色体16q缺失允许侵袭性肿瘤的出现。
figure 3

a,示意图显示了GEKOs世代的GEM模型设计(左)和实验时间线(右)(深紫色,Nf2击倒取胜-集合2击倒取胜-4q9p21;紫色,Nf2 击倒取胜-集合2 击倒取胜;粉色,空矢量)。b显示3个不同实验组的18个不同簇中细胞分布的条形图。c87,718个GEKO衍生细胞的三维分布;颜色标尺基于伪时间值。d、根据伪时间值的单个样品的分布图(左图)和沿着三个不同实验组的伪时间的三维分布图(右图)。e具有整倍体的细胞在假时间上的三维分布16q (Nf2击倒取胜-集合2击倒取胜-4q9p2116q整倍体,粉色)并与16q (Nf2击倒取胜-集合2击倒取胜-4q9p2116q,绿色)。n= 87,718个单元格。f显示四个不同基因组中伪时间分布的Violin图;P < 1 × 10−15. g在肾脏中原位接种SM-GEMM衍生细胞系的CB17SC-F SCID小鼠的Kaplan-Meier生存分析,16q (n= 10只小鼠)或16q整倍体 (n= 10只小鼠);P= 3.23 × 10−6. ****P < 0.0001 by two-tailed Mann–Whitney test (f)和对数秩(Mantel–Cox)检验(g).

源数据

单细胞轨迹的分析揭示了两个主要的子类4q9p21实验组,以进化差异作为从路线起点推断距离的度量(图。三维(three dimension的缩写)).结构变体的跨平台注释,如从类器官上的scRNA-seq推断的,鉴定了鼠16号染色体的缺失(16q)作为恶性进展和分子分化的基因组决定因素,证实了SM-GEMMs的多区域WES数据(扩展数据图。6f).单细胞转录组分析表明,获得16号染色体自发丢失的细胞显示出离途径起点的距离增加,表明该基因组是鼠RCC的进化终点(图。3e、f).这些观察促使我们假设,如果4q9p21允许CIN克隆人的出现,16q丢失可能促进对非整倍性的耐受性,并最终允许具有复杂核型的克隆的扩增。为了验证这一假设,我们进行了体内功能分析,显示短期传代产生的移植物16q克隆表现出更具攻击性的行为,导致存活率下降16q整倍体同基因移植(图。3g),从而证实了16q是肾癌中癌细胞适应性和侵袭性生物学特征的功能性驱动因素。值得注意的是,跨物种共线性分析显示了鼠16号染色体和人类21号染色体之间的高度同源性,包括保守的~200千碱基基因组区域,该区域含有干扰素受体(IFNR)簇基因,该簇基因显示参与I型、II型和III型干扰素应答(IFNAR1, IL10RB, IFNAR2, IFNGR2)(图。4a).因此,单细胞转录组分析证实16q群体的特征是干扰素信号反应的显著抑制16整倍体单元格(P < 0.0001), together with activated programs involved in the mitotic checkpoint and regulation of cell-cycle progression (Fig. 4b–f和扩展数据图。6g–I).因此,这些证据表明,在非整倍性的情况下,干扰素应答的脱离允许侵袭性癌细胞的扩增,并有助于肿瘤异质性和功能性克隆多样化(图。第四代移动通信技术).利用多种实体瘤亚型的人类癌细胞系公开数据库(癌细胞系百科全书,CCLE)和具有病理学和基因组注释的RCC患者队列(TCGA;通过治疗追踪肾癌进展;纪念斯隆·凯特林转移瘤,MSK-Met),我们利用WGD和fCNA基因组等非整倍体评分指标,证实了IFNR簇丢失和非整倍体之间的显著相关性。对多个数据集的分析以及人和小鼠RCC数据的整合显示了干扰素信号传导和CIN之间的负相关(图。4h,我5a–g和补充表格1).因此,具有高水平CIN的RCC通过21号染色体上IFNR簇的遗传丢失,表现出抑制干扰素反应途径的选择性进化压力。

图4:干扰素信号抑制驱动非整倍体RCC克隆的扩增。
figure 4

a,由同系门户的SynCircos功能生成的,在SM-GEMM肿瘤小鼠中显着丢失的染色体区域的人-小鼠同系图的Circos图。人类21号染色体区域的放大显示了IFNR簇的基因组位置和坐标。b显示了根据基因组数据聚类的四个不同组计算的干扰素(Ifn)分数的Violin图(P < 1 × 10−15, n= 87,718个单元)。c,显示表达式值的Violin图Isg15(上)和Irf7(底部)针对由基因组数据聚类的四个不同组进行计算(P < 1 × 10−15n = 87,718个单元)。d所有细胞的Ifn分数值的三维分布。e,具有高Ifn分值(左图)和低Ifn分值(右图)的两个亚群的三维表示,显示了在四个不同基因组和假时间值中的分布。n= 87,718个单元格。fIfn低和Ifn高组中涉及染色体稳定性和有丝分裂检查点的两个基因的表达值;P  < 1 × 10−15. n= 37,624个单元格。g显示“Ifn高”和“Ifn低”组中的CNV分数的小提琴图;P < 1 × 10−15. n= 37,624个单元格。h显示不同肿瘤的fCNA值的Violin图还是9p和21q,有或没有WGD,在两个不同的队列中:TCGA-基潘(左图),P= 2.76 × 10−7, 1.67 × 10−2和1.46 × 10−5;MSKCC(右面板),P= 1.76 × 10−4和5.77 × 10−5. n= 922肿瘤。i,火山图显示上调和下调的主要途径,比较9p和21q肿瘤对9pTCGA-基潘转录组数据集中的肿瘤。n= 788肿瘤。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001 by two-tailed Mann–Whitney test (b,fh).瑞吉。,拒绝;resp。,回应;TGCA-基潘,TCGA泛肾。

源数据

图5: CIN与RCC中干扰素信号抑制相关。
figure 5

a,点状图显示的是IFNAR2根据癌细胞系百科全书(CCLE)计算的来自非血液恶性肿瘤的跨人类细胞系的基因。细胞系根据它们的非整倍性分数进行划分;P= 0.0099.b,点状图显示的是IL10RB基因,和a有相同的细胞株。P= 0.0099,n= 789个细胞系。c,点状图显示的是IFNAR1基因,和a有相同的细胞株。P= 0.00992,n= 789个细胞系。d,点状图显示的是IFNGR2基因,和a有相同的细胞株。P= 0.015,n= 789个细胞系。e位于特定缺失的21号染色体区域的两个IFNR基因的散点图拷贝数对数值;P < 1 × 10−15. n= 789个细胞系。f显示MSKCC RCC群组(左上图)、TRACERx RCC群组(左下图)和TCGA-基潘群组(右上图)特定特征的临床、组织学和基因组注释的热图。g柱状图显示了在三个不同的临床队列中21q丢失和9p丢失的共现;从左到右,P= 1.04 × 10−4和0.0016。从左到右,n= 788,101和134肿瘤。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001 by two-sided Mann–Whitney test (ad)、皮尔逊相关(e)和双侧Fisher精确卡方检验(g).不适用;WT,野生型。

源数据

IFNR集群是RCC进展的看门人

通过利用全基因组CRISPR筛选的功能基因组方法,进一步对IFNR簇缺失在促进CIN耐受性中的作用进行了正交验证16q16q整倍体等基因系。具体来说,富集的sgRNAs的去卷积与基因靶的富集途径分析相结合,证实了干扰素信号通路在肾癌进展中有效的细胞自主性肿瘤抑制作用,以及抑制肾癌中干扰素反应的选择性压力。16q整倍体细胞(图6a、b扩展数据图。7a和补充表格1).为了证实CRISPR筛选数据并阐明属于IFNR簇的基因的功能效应,我们设计了sgRNA靶向Ifnar1Ifngr2。单基因敲除Ifnar1Ifngr2,JAK1/2抑制剂(baricitinib)的药理学途径抑制和外源性干扰素-α (IFN-α)和-γ (IFN-γ)的治疗证实了体外试验中IFNR信号传导的肿瘤抑制作用(扩展数据图。7b8a–h);在分子水平上,如预期的那样,该途径的遗传操作导致STAT1磷酸化的显著下调(扩展数据图。8i–l).同样,体内移植研究表明,基因敲除Ifnar1或者Ifngr2和JAK/STAT信号通路的抑制在染色体16的整倍体拷贝中赋予了促肿瘤发生和促转移表型(图。6c–e和扩展数据图。9a–f).这些实验证据表明小鼠同线区缺失的细胞自主作用16q和人类21q在耐受干扰素对有丝分裂应激下细胞存活的有害作用中,通过JAK/STAT信号在IFNR途径和具有CIN的细胞增殖之间建立推定的因果相互作用22。全面概述的职能作用16qRCC进展中的缺失和IFNR,我们设计了肾器官样细胞和正常肾小管细胞系的功能获得性研究,这些细胞系建立于16号染色体部分三体的唐氏综合征鼠模型,该模型跨越IFNR簇(Ts65Dn)23。通过野生型和Ts65Dn GEKOs的基因组工程,我们引入了Nf2集合2TSGs与染色体基因组断裂4q9p21通过携带框内Cas9-GFP盒(Ad-Cas9-GFP)的AAV和腺病毒颗粒的共转导(图。6f,g).移植实验证实了干扰素信号对肿瘤发生和发展的剂量依赖性负作用(图。6小时和扩展数据图。10a–e).13例糖尿病周围神经病变分析Nf2击倒取胜-集合2击倒取胜-4q9p21在晚期收集的工程改造的野生型和Ts65Dn-GEKO衍生的原发性肿瘤显示,尽管预先存在基因组异常,RCC进化向非整倍体的复发模式收敛(获得染色体5q染色体的丢失12q16q),但更重要的是,这些数据表明,肿瘤的发展始终与两者的丧失相关16q以及额外复制的染色体16q。(图。6i).值得注意的是,JAK-STAT信号通路的慢性药物抑制挽救了这种表型,来自工程化Ts65Dn类器官的肿瘤保留了人工染色体(图。6j和扩展数据图。10f).这些数据证实了干扰素信号和IFNR簇剂量在肾脏肿瘤发生中的关键作用。进一步的实验证据表明,额外拷贝的IFNR簇足以通过激活有效的衰老反应而显著削弱SM-GEMM衍生的肾小管细胞的体内肿瘤发生和体外增殖,该衰老反应通过利用JAK抑制剂baricitinib对IFNR途径的药理学抑制而被完全挽救(图。6k和扩展数据图。10g–j).

图6: IFNR驱动限制RCC进展的衰老反应。
figure 6

a,体外CRISPR筛选示意图。b火山图显示了丰富的路径16q16q整倍体使用排名最高的2000个TSG作为输入的细胞系。n= 60个差异表达的途径。c,生存曲线16q整倍体敲除任一基因的荷瘤小鼠Ifnar1或者Ifngr2; P= 3.44 × 10−5和4.20 × 10−5. n= 26只老鼠。d,e肿瘤尺寸和转移数目;数据表示为中值、最小值和最大值(sgCTR: 1,702.5, 198, 6,394; sgIfnar1: 750, 405, 2,176; sgIfngr2肿瘤尺寸:1,702.5,607,6,250;n=每组9个肿瘤;和sgCTR: 21, 10, 34; sgIfnar1: 42, 35, 64; sgIfngr2:46,20,57表示转移瘤数目;n=每组8个肿瘤) (d);以及原发性肿瘤中IFNAR1和IFNGR2的IHC(e). P= 6.33 × 10−4, 2.72 × 10−3, 0.17, 0.63.比例尺,100 μmf,Ts65Dn模型的实验设计和GEKO生成示意图。g,野生型(左上)和Ts65Dn(右上)GEKOs共感染Ad-Cas9-GFP,有或没有AAV的显微图像Nf2击倒取胜-集合2击倒取胜- 4q9p21。比例尺,30 μm。图像代表n= 2次实验。h皮下移植的转化野生型和Ts65Dn GEKOs的生长曲线;数据表示为平均值±标准差(野生型,n= 5个肿瘤;Ts65Dn,n= 5个肿瘤),P= 3.28 × 10−9. i,GEKO野生型和Ts65Dn衍生肿瘤的散点图;红色箭头,放大;蓝色箭头,删除部分。j显示扩增和缺失区域的16号和17号染色体图;从左至右:来自Ts65Dn的正常组织对来自野生型小鼠的正常组织;用载体治疗的来自Ts65Dn的CRISPR诱导的肿瘤与来自Ts65Dn的正常组织的比较;baricitinib治疗的Ts65Dn的CRISPR诱导肿瘤与Ts65Dn的正常组织的比较。方框代表Ts65Dn模型中受部分三体性影响的基因组区域。k、量化(左)和来自野生型和Ts65dn小鼠的GEKTCs的代表性图片(右),用赋形剂或baricitinib处理。n=每个条件10个字段,P= 2.10 × 10−8。箭头表示衰老细胞中存在多个细胞核。比例尺,30 μml的示意图,提出21号染色体丢失是晚期肾细胞癌CIN耐受性和进化的细胞自主机制。**P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001 by log-rank (Mantel–Cox) test, (c)双向方差分析(h)和双尾学生的t-测试(d,k).SA-β-半乳糖苷酶。

源数据

讨论

总之,我们建立了功能证明的核心作用9p确定转移性疾病模式的损失。尽管先前已经产生了肾癌的其他GEM模型24在本研究中,通过工程9p21体内缺失,我们建立了侵袭性和转移性肾细胞癌的免疫活性体细胞镶嵌模型。因此,我们证明了特定基因组事件在触发CIN和促进具有显著转移行为的侵袭性亚群的快速扩张中的关键作用3,25,26,27.

韦斯和WGS的分析提供了对遗传进化模式的见解9p损失驱动的肿瘤,揭示了WGD,CIN定义的克隆的早期出现和快速选择,以及非整倍性的高度保守模式。这些特征符合间断平衡的模型,其中宏观进化事件的爆发驱动快速克隆扫描和高适应性细胞的选择28。有趣的是,提出的模型告知收敛进化轨迹的存在29跨物种基因型-表型分析证实了这一点,并表明,如果存在适当的起始致癌驱动因素,形成癌症基因组的进化瓶颈在不同物种之间是一致的。这项工作与最近的论文相一致,这些论文证明了鼠和人胰腺癌的趋同进化轨迹,在这种情况下,自发丢失的胰腺癌细胞数量减少。CDKN2A/B, TP53SMAD4代表了恶性发展的限制途径30,31.

对scRNA-seq数据的分析显示了在基因缺失时的异源转录动力学。9p21,打开了细胞状态数量的增加,因此更高程度的肿瘤熵。更重要的是,这项研究揭示了干扰素信号通路在晚期和转移性肾细胞癌进展中的高度保守和关键的肿瘤抑制作用,特别是在具有高CIN的肿瘤中32(图。6l).我们的发现与临床证据相一致,临床证据表明,唐氏综合征患者IFNR簇基因座的基因剂量增加与以促衰老细胞表型和促炎环境为代价的发展实体瘤的终生风险降低相关,导致全身性炎症和自身免疫性疾病发生的风险增加33,34,35,36。已经观察到I型干扰素信号传导的缺失在恶性进展为转移性播散时发生,并且作为免疫逃避的机制,特别是作为对恶性黑色素瘤和上皮癌中免疫检查点阻断的适应性反应,通过染色体上I型干扰素配体簇的缺失9p或者通过突变JAK1/2(参考文献。37,38,39).在这里,我们提供了失去IFNR集群的关键作用的函数证明21q在肾癌进展中的作用以及在其他肿瘤类型中的潜在作用的理论基础。值得注意的是,当与I型配体簇上的损失相比时9p(参考37), 21q损失驱动I型和II型受体的抑制,最终集中在STAT1减少的激活上。这些证据表明,I型和II型反应都是RCC中关键的肿瘤抑制途径,特别是作为对CIN的过继反应。因此,需要进一步的研究来剖析组织特异性和癌症特异性的相关性。总之,我们的工作支持在不同的基因组背景下导致转移扩散的趋同进化模式,表明通过分析特定的驱动因素可以在很大程度上预测转移和侵袭性肿瘤的进展。