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脂肪酸转运蛋白4将饱和超长链脂肪酸掺入表皮神经酰胺和单酰基甘油

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发表时间:2019-09-16 14:25作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

脂肪酸转运蛋白4将饱和超长链脂肪酸掺入表皮神经酰胺和单酰基甘油


摘要

脂肪酸转运蛋白4是哺乳动物皮肤正常通透性屏障所需的酰基辅酶a合成酶。FATP4(SLC27A4)突变导致鱼鳞病早熟综合征,一种非致命性疾病。相比之下,Fatp4/老鼠新生时死于有缺陷的屏障。这里我们使用电子显微镜和脂质组学来表征Fatp4/老鼠。突变体显示板层体、角质细胞脂质包膜和角化包膜异常。脂质组学鉴定了以前推测存在于小鼠表皮的两种脂质,鞘氨醇β-羟基神经酰胺和单酰基甘油;突变体显示这些和两类神经酰胺类的比例降低,这两类神经酰胺类携带被认为对屏障功能至关重要的超长链酰胺连接脂肪酸、未结合的ω-O-酰基神经酰胺和结合的ω-羟基神经酰胺,后者构成角质细胞脂质包膜的主要成分。其他异常包括鞘氨醇α-羟基神经酰胺、植物鞘氨醇非羟基神经酰胺和1-O-酰基神经酰胺的含量升高。神经酰胺中酰基链长度的改变也暗示了FATP4在酯化至少含25个碳的饱和非羟基和β-羟基FAs以及至少含30个碳的饱和或不饱和ω-羟基FAs为CoA中的作用。我们的脂质组学分析是这类研究中最彻底的Fatp4/迄今为止的小鼠皮肤屏障,提供了关于FATP4如何通过调节各种屏障脂质中的脂肪酰基部分来促进屏障功能的信息。

介绍

哺乳动物的皮肤可以抵御生物、化学和机械的攻击,并起到防止水分流失的屏障作用。它的渗透性屏障是通过一系列分化事件建立的,形成最外面的、有三个组分的角质化层。(1)死的扁平角质细胞的角质外壳1是一种坚韧、不溶于水的蛋白质囊,包裹角蛋白纤维。(2)粒细胞板层体分泌和加工的脂质形成细胞间脂质板层2。(3)角质细胞脂质包膜与角质包膜中的总蛋白共价连接,用作组织细胞间脂质层的支架,用于角质细胞间的粘附,或用作半透膜3

脂质薄片由三种主要类型的脂质组成——游离脂肪酸、神经酰胺和胆固醇——它们的摩尔比大致相等4。神经酰胺由脂肪酸和作为长链碱的鞘氨醇组成。经过许多可能的修饰,神经酰胺是一大类脂质5。表皮FAs可促进复杂脂质的形成或以游离形式存在。有几种蛋白质参与促进长链脂肪酸的吸收(LCFA;C12-C20)在哺乳动物细胞中6,包括脂肪酸转运蛋白家族,也称为超长链酰基辅酶a合成酶7,8。临床发现和动物模型研究表明这些候选转运蛋白在皮肤中发挥重要作用6

FATP家族包括六种膜蛋白,它们介导LCFA和超长链脂肪酸的摄取;≥ C22)9,10,11,12。最后进近和起飞区显示不同的亚细胞定位,包括血浆和细胞器膜13,14。脂肪酶显示酰基辅酶a合成酶活性,并通过载体酰化促进FAs的摄取15。脂肪酶在皮肤中的沉积变化很大16

我们之前确定了抗皱的携带反转座子插入突变的小鼠Slc27a4,编码FATP4的基因17。缺少FATP4的小鼠(Fatp4/老鼠)出生时皮肤厚而紧,“无皱纹”且皮肤屏障功能失调,新生时会因运动受限和脱水而死亡。Fatp4+/—小鼠在表型上是正常的。类似的表型在独立的Fatp4突变体18,19。Fatp4或Fatp1转基因在基底上角质形成细胞中的表达可恢复新生细胞的致死性,并拯救皮肤表型Fatp4突变体,表现出共同的底物偏好、酶活性和生物功能14,20

在患有鱼鳞病早产儿综合征的患者中发现了破坏人脂肪酶4的突变,表现为早产、呼吸系统症状和皮肤肿胀,伴有严重的干酪样结垢21,22,23。幸存的患者在儿童期恢复并表现出无鳞鱼鳞病,皮肤干燥瘙痒,经常伴有呼吸道和/或食物过敏24

表皮脂质分析Fatp4/新生小鼠显示携带26个或更多碳的脂肪酰基链的神经酰胺水平降低,而携带24个或更少碳的神经酰胺水平升高19,20。与这些结果一致,Fatp4突变表皮显示FFA含量增加,这可能是由于突变角质形成细胞不能将长链FAs激活为酰基辅酶a形式,以及FFA在细胞内的积累14

研究游离脂肪酸活化中的缺陷Fatp4/表皮影响脂肪酸合成神经酰胺,我们通过薄层色谱和电喷雾电离质谱对新生表皮中游离的、可提取的脂质和蛋白质结合的脂质进行脂质分析。我们鉴定了以前推测正常小鼠存在的两种脂质类型,并鉴定了几种脂质类型的异常。Fatp4/脂质异常通过Fatp4或Fatp1转基因的基底上角质细胞表达来修复。与这些结果相一致,超微结构分析显示转基因衍生的FATP4或FATP1可以改善Fatp4/表皮,包括板层体分泌系统和角质细胞脂质包膜的形成。我们的结果提供了关于脂肪P4缺乏如何改变各种屏障脂质中脂肪酰基部分以及随后皮肤渗透性屏障功能的见解。我们的数据也支持我们之前的推测,即FATP4和FATP1在促进超长链脂肪酸(ULCFA≥ C25)。

结果

的超微结构分析Fatp4 /皮肤

超微结构分析显示在颗粒层和角质化层中有弯曲的多层膜状结构Fatp4/新生小鼠(图1b插图)也存在于鱼鳞病早产儿综合征患者中25Fatp4/皮肤也显示层状体分泌系统的多种异常,包括较高密度的层状体(图1b)薄层含量(黑色箭头)相对于对照(图1a白色箭头)。相比之下,层状体与质膜的融合、脂质内容物向胞外空间的分泌以及分泌后处理似乎正常(数据未显示)。然而,与对照相比,正常出现的层状双层的总量减少,并伴随有广泛的非层状相分离(图1e,f)。转基因脂肪酶4或脂肪酶1在突变的基底上角质形成细胞中的表达挽救了大多数超微结构异常,部分纠正了板层体含量(图1c,d)和层状双层的数量和结构的标准化(图1g,h)。Fatp4与对照组相比,突变体几乎没有可见的角质细胞脂质包膜(图2a’,b’),其通过FATP4或FATP1的转基因表达被还原(图2c’,d’)。

图1
figure1

中的缺陷Fatp4/层状体分泌系统超微结构。层状体结构(ad)、固定后减少的四氧化锇)和细胞外脂质加工((eh),四氧化钌后固定)通过透射电子显微镜进行评估。典型的异常弯曲膜结构,仅见于Fatp4/表皮,如中的插图所示(b)。Fatp4/层状体(b)形状不规则且填充不完全(黑色箭头)a)和Fatp4/用最后进近和起飞区4营救(c)或FATP1(d)(白色箭头表示正常的层状体)。分泌脂质于Fatp4/数量减少,如薄片状脂质(f)、黑色箭头),并且与对照相比表现出广泛的相分离(白盒)e)和Fatp4/用最后进近和起飞区4营救(g)或FATP1(h)(白色箭头表示正常加工的层状脂质)。代表性的图像来自每种基因型的两只小鼠。

图2
figure2

Fatp4超微结构缺陷/角质细胞脂质包膜(CLE)和角质包膜(CE)。如材料和方法中所述,通过透射电子显微镜检查CLE和毛细管电泳。中的盒装区域ad放大了' a '' d '分别是。白色箭头表示典型的CLE形态:毛细管电泳外表面有一条规则的4纳米厚的透明带(黑色箭头)。Fatp4/角质层(' b ')的特征在于与对照相比没有可见的CLE和薄的毛细管电泳(' a '),最后进近和起飞区4-(' c '),以及最后进近和起飞区1-(' d ')获救的老鼠。代表性的图像来自每种基因型的两只小鼠。毛细管电泳厚度被量化(e)如材料和方法中所述,并注明n个数字、标准偏差和统计显著性(***P%3C 0.001)。IVL,总苞启动子。

除了脂质结构的变化,Fatp4与对照相比,突变皮肤显示蛋白角质化包膜的厚度显著减少(定量如图2所示2e)。与此相一致,用离子洗涤剂和还原剂煮沸皮肤后残留的角质包膜在Fatp4从胚胎第16.5天开始的突变体(胚胎第17.5天如图3d)与对照组相比(图3a–c)。外源性脂肪酶4和脂肪酶1改善了角质化包膜的大小缺陷(图3e,f)。FATP1表达式恢复了角质化包膜的厚度,而FATP4表达式增加了角质化包膜的厚度Fatp4突变体的程度略高于对照(图2)。

图3
figure3

中的缺陷Fatp4/檐口信封。毛细管电泳从17.5天胚胎的背部皮肤分离,并在相差显微镜下观察。行政长官在2000年变小了Fatp4突变体(d)与对照相比(ac)但是被转基因衍生的FATP4归一化(e)和FATP1(f)。从每种基因型的至少两只小鼠中显示了代表性的图像。IVL,总苞启动子。

中未结合脂质的变化Fatp4 /表皮

为了解决如何在Fatp4/表皮影响脂肪酸合成神经酰胺,我们用薄层色谱和高分辨率电喷雾质谱对新生表皮中游离的、可提取的和蛋白结合的脂质进行脂质分析。与以前的报道一致,我们对对照的薄层色谱分析显示表皮游离的、可提取的脂质部分中有五个主要的神经酰胺带(图。4a)。从质谱的薄层色谱板中回收后,证实五个神经酰胺带是:1)ω-O-酰基神经酰胺(Cer(EOS));2)具有至少22个碳的脂肪酰基链(Cer(NS) ≥ C22)的鞘氨醇非羟基神经酰胺和二氢鞘氨醇非羟基神经酰胺(Cer(NdS))的混合物;3)鞘氨醇β-羟基神经酰胺;4)具有至少22个碳的脂肪酰基链的鞘氨醇α-羟基神经酰胺(Cer(AS)≥C22);和5)具有16个碳酰基链的碳当量(C16)。Cer(BS)带以前被称为植物鞘氨醇(4-羟基鞘氨醇)非羟基神经酰胺(Cer(NP))26,但是用电喷雾质谱,我们证实了这个带是在人角质层中发现的Cer27,与最初的推测一致28

图4
figure4

中未结合表皮脂质库的改变Fatp4/老鼠。新生小鼠表皮中的游离、可提取脂质通过薄层色谱(a)并以每毫克干燥表皮的克数进行量化(b)。年观测到的OAHFA、Cer、MAG/Cer C16、Cer和GlcCer波段强度降低,Cer(1-O-ENS)、Cer(NP)、Cer(AS) ≥ C22、Cer(AS)C16和脂质X水平升高Fatp4/小鼠通过表达Fatp1(Fatp4/;Tg(IVL-Fatp1) ina,左侧;b顶部)和Fatp4(Fatp4/;Tg(IVL-Fatp4) ina,对;b(底部)转基因。脂质标准(a左边)和未结合的表皮脂质类型(箭头所示)。量化数据(b)是从两个独立的研究中获得的,显示了标准偏差和统计显著性(*P% 3C 0.05;**P% 3C 0.01;***P%3C 0.001)。每个研究包含4个对照,Fatp4/和转基因拯救的小鼠。甘油磷脂、鞘磷脂和以前报道的胆固醇酯、三酰甘油、FAs和胆固醇14不包括在内b。GlcCer 1、2和3是指紧接GlcCer(EOS)频带后面的三个频带,如所示(a)。a中显示的薄层色谱结果来自两个单独的薄层色谱实验;显示了完整的垂直长度。IVL,总苞启动子。

与对照相比,Fatp4/表皮显示几种神经酰胺类的异常模式,包括Cer(EOS)和Cer(BS)的显著减少(图。4a,b)。Cer(EOS)含有酰胺连接的超低碳脂肪酸,其末端带有ω-羟基,并被另外的脂肪酸(主要是亚油酸)进一步酯化,被认为是屏障功能的关键29,30。在两项单独的研究中,Cer(EOS)的定量显示,在Fatp4/表皮。Cer(EOS)的减少伴随着一种特殊脂肪酸水平的显著降低,这种脂肪酸在薄层色谱中以极性脂质的溶剂系统直接迁移到胆固醇带的前面(图。4a)。该脂肪酸带以前被鉴定为0-酰基-ω-羟基脂肪酸31,一种独特类型的ULCFA,构成Cer(EOS)中的脂肪酰基部分。它的身份在这里被电喷雾质谱证实

Fatp4/表皮显示一个离散的带,紧接着在Cer之前移动,在对照组中几乎看不见(图4a)。电喷雾质谱鉴定这是核证的排减量。Fatp4/表皮也显示出显著增加的Cer(AS) ≥ C22和Cer(AS)C16水平(图。4a,b)。相比之下,含Cer(NS) ≥ C22和Cer(NdS)的条带数量在Fatp4/一项研究中的表皮没有变化(图4b)。

对照表皮中的神经酰胺在薄层色谱上被分成五个主要条带,而储存在粒细胞层状体中的糖基化前体葡糖神经酰胺被分成四个条带(图1)。4a)。如前所述,利用电喷雾质谱,我们分别验证了四个极谱带中的最小极谱带和最大极谱带是C1626,28,32。另外两个GlcCer条带被鉴定为≥ C22的GlcCer、GlcCer和GlcCer的混合物,以及≥ C22的GlcCer C16、GlcCer和GlcCer的混合物。与减少的Cer(EOS)一致,Fatp4/表皮也显示出葡萄糖氧化酶的减少(图4a,b)。其他GlcCer条带的定量没有揭示突变体中的显著变化,除了图1中GlcCer(NS) ≥ C22、GlcCer(NdS)和GlcCer(NP)混合物的减少。4b)在Fatp4/同一项研究显示表皮细胞Cer(NS) ≥ C22和Cer(NdS)减少。

除了这些神经酰胺和GlcCer类外,小鼠表皮脂质通常含有极性较低的神经酰胺,其酯连接的脂肪酸连接到长链碱基的1-羟基上(图。4a)28。通过对从薄层色谱板中提取的条带进行电喷雾质谱分析,我们最近鉴定出这种神经酰胺酯是1-O-酰基神经酰胺(Cer(1-O-ENS)33,与前一份报告一致34Fatp4/表皮显示Cer(1-O-ENS)水平增加,一个未知的神经酰胺带(脂质X)在GlcCer(EOS)带之前移动(图。4a,b)。Fatp4/表皮也显示出明显减少的紧接在Cer带后面迁移的带(图4a,b)。通过质谱,我们确定这主要是单酰基甘油35,与最初的推测一致32。这一波段包含C16核证的排减量作为次要成分,与前一份报告所述的主要成分形成对比26。在Fatp4/表达转基因FATP1或FATP4的小鼠(图4b),未结合脂质中观察到的异常都得到纠正。

中蛋白质结合脂质的变化Fatp4 /表皮

薄层色谱分析显示对照新生儿表皮提取物中有两条主要的蛋白结合脂质带(图5a)。质谱鉴定它们为鞘氨醇ω-羟基神经酰胺(Cer(OS))和ω-羟基FAs (OHFA),后者是蛋白质结合Cer(OS)中的脂肪酰基部分,与其他报道一致26,36。突变体显示蛋白结合核因子(OS)和OHFA (Fig .5b)。其他人报告的另一个更快迁移的FA波段在一些Fatp4/样品已检查,但不在质控品中(图右面板5a)。表皮脂肪酶1或脂肪酶4的表达弥补了OHFA和Cer的异常(图5b)。

图5
figure5

中蛋白质结合的表皮脂质库的改变Fatp4/老鼠。新生小鼠表皮蛋白结合脂质与标准品和游离表皮脂质(a)并以每毫克干燥表皮的克数来量化(b)。OHFA和核证的排减量Fatp4/小鼠通过Fatp1(Fatp4/;Tg(IVL-Fatp1) ina,左侧;b左侧)和Fatp4(Fatp4/;Tg(IVL-Fatp4) ina,对;b(右)转基因。在一些地方可以看到更快的迁移荧光带Fatp4/样本。脂质标准(a左图)和蛋白质结合的表皮脂质(箭头所示)。量化数据(b)是从两个独立的研究中获得的,显示了标准偏差和统计显著性(**P% 3C 0.01;***P%3C 0.001)。每个研究包含6个对照,Fatp4/和转基因拯救的突变小鼠。薄层色谱结果如所示a来自两个独立薄层色谱实验;显示了完整的垂直长度。IVL,总苞启动子。

未结合脂质中游离脂肪酸和脂肪酰基部分的变化Fatp4 /表皮

游离脂肪酸

我们之前展示过Fatp4/表皮显示游离脂质部分中游离脂肪酸含量增加,可能是由于Fatp4/角质形成细胞未能将ULCFA活化成酰基辅酶a形式,随后在细胞内积累游离脂肪酸14。研究游离脂肪酸池升高的光谱以及游离脂肪酸结合到游离脂质中的影响Fatp4/表皮、未结合的脂质提取物用固相萃取柱分离成游离脂肪酸和各种脂质部分,并进行高分辨率电喷雾质谱(图S1,S2,S3)。结果表明,高游离脂肪酸池(材料和方法中的级分4和5)在Fatp4/表皮主要由含有18-24个碳的饱和非羟基脂肪酸(NHFA)组成(图6a)和含有20-34个碳的单不饱和NHFA(图6b)。含有24个碳的饱和和不饱和α-羟基脂肪酸(AHFA)的量也显著增加(图6c)。相反,饱和OHFA的比例(图6d)和携带饱和脂肪酰基骨架的OAHFA(图6e)急剧下降;OHFA和审调处的鉴定实例如图第四心音,表面抗原-5

图6
figure6

未结合表皮脂质中游离脂肪酸含量的变化Fatp4/老鼠。新生儿未结合表皮脂质的混合级分4和5通过电喷雾质谱分析为[·迈赫]负离子模式下的离子,并以任意单位量化。Fatp4/小鼠显示饱和NHFA (C18-C24)和单不饱和NHFA (C20-C34)水平增加(a,b),饱和OHFA和具有饱和脂肪酰基骨架的OAHFA水平降低(d,e),以及AHFA和六六六的异常水平(c)。几乎所有这些缺陷都被Fatp1转基因标准化了。数据分别从以下4项中获得Fatp4+/—(控制)。Fatp4/和FATP1拯救的突变体,显示m/z比率、标准偏差和统计显著性(*P% 3C 0.05;**P% 3C 0.01;***P%3C 0.001)。术语见材料和方法。

非羟基神经酰胺

来自对照表皮的未结合脂质部分3的质谱鉴定出携带16至32个碳的酰基链的Cer(NS)类(图7a;图。S6)和带有24-26个碳的酰基链的Cer类(图7b;图。正常人血清中的一种蛋白质成分)。而薄层色谱中含有这两类神经酰胺的条带Fatp4/表皮仅在我们的两项研究中的一项中显示了改变的水平,通过质谱显示了改变的酰基链长度分布Fatp4/表皮显示含有25个或更多碳的饱和酰基部分的Cer(NS)比例显著降低;例如,两种主要的Cer物种d17:1/26:0和d18:1/26:0分别减少了4.7倍和3.0倍。相比之下,Fatp4/表皮显示含有较短饱和酰基链或不饱和酰基链的Cer物种比例增加。在对照表皮中鉴定的所有Cer(NdS)物种都携带饱和酰基链,它们的水平在Fatp4/表皮,尤其是d18:0/26:0,显示16.0倍的变化。对照中鉴定的次要脂质Cer(NP)包含一个带有22至26个碳的饱和酰基链。突变体中Cer(NP)的增加反映在带有22-24个碳的酰基部分的物种中(图7c;图。S8)。

图7
figure7

中未结合表皮脂质神经酰胺含量的变化Fatp4/老鼠。新生小鼠未结合表皮脂质的3级分用电喷雾质谱分析为[分子负离子模式下的离子,并以任意单位量化。Fatp4/小鼠向饱和酰基链较短的Cer物种转移(a),含有饱和酰基链的Cer(NdS)和Cer(OS)物种的水平降低(b,e)和所有Cer(EOS)物种(f)以及Cer(NP)和Cer(AS)中几种物种水平的增加(c,d)。这些缺陷都被Fatp1转基因标准化了。数据分别从以下4项中获得Fatp4+/—(控制)。Fatp4/和FATP1拯救的突变体,显示m/z比率、标准偏差和统计显著性(*P% 3C 0.05;**P% 3C 0.01;***P%3C 0.001)。术语见材料和方法。

羟基神经酰胺

薄层色谱法Fatp4/表皮显示未结合脂质部分中Cer减少,Cer≥C22和Cer C16两个相对极性的神经酰胺类水平增加。质谱鉴定了来自对照的组分3中的三种Cer(BS)物种,它们都携带相同的α-羟基脂肪酸(BHFA) 26:0,但各自具有不同的长链碱基d16:1、d17:1或d18:1(图。7d)。对照中的核证的排减量包含一个携带16至28个碳的AHFA链(图7d)。所有三个被鉴定的核证的排减量物种与其相应的核证的排减量异构体具有相同的m/z比率,例如d18:1/βh26:0 & d18:1/αh26:0,当被检测为[·M-H时,m/z比率均为692.66]离子,使得很难单独评估突变体中这些神经酰胺的确切变化。在m/z比不与Cer相同的其他Cer物种中,一些物种在突变体中增加,如d18:1/αh22:0和d18:1/αh26:1。薄层色谱法Fatp4/表皮显示C16核证的减少;然而,通过质谱鉴定,两种C16核证的排减量的变化在统计学上并不显著。分数3的质谱还显示Cer(AdS)和Cer(OS)为对照中的次要神经酰胺类(图7d,e;图。S9)。唯一携带饱和酰基链d18:1/ωh32:0的Cer物种在Fatp4/表皮。

ω-O-酰基神经酰胺

从对照中未结合脂质的部分3,质谱还鉴定出在OHFA主链中携带30-36个碳的Cer(EOS)类(图。7f)。据其他人报道,Cer的OHFA部分主要用亚油酸(18:2)酯化。中减少的Cer(EOS)Fatp4/薄层色谱检测到的表皮归因于带有饱和OHFA主链的减少的Cer物种和带有不饱和OHFA主链的物种。例如,对照小鼠中两个最丰富的物种,d18:1/ϖh34:1-18:2和d18:1/ϖh32:0-18:2,在Fatp4/表皮分别有4.8倍和11.9倍的变化。

单酰基耶洛

除神经酰胺类外,质谱还鉴定了来自对照表皮的未结合脂质部分3中的几种MAG物种。它们带有22到30个碳的饱和脂肪酰基链,其中24:0是主要的(图8a),与前一份报告一致32Fatp4/表皮显示所有MAG物种的水平显著降低。

图8
figure8

非结合表皮脂质中MAG和1-O-酰基神经酰胺含量的变化Fatp4/老鼠。用电喷雾质谱在正离子模式下分析新生小鼠游离表皮脂质的组分3和2,为[M + NH4]+离子(a)和[M + H]+离子(b),并以任意单位量化。MAG物种水平的下降见于Fatp4/小鼠都通过Fatp1转基因(a)。Fatp4/小鼠显示许多Cer(1-O-ENS)物种的水平增加,其两个酰基链中携带48个或更少的总碳,几乎所有这些都被Fatp1转基因(b)。数据分别从以下4项中获得Fatp4+/—(控制)。Fatp4/和FATP1拯救的突变体,显示m/z比率、标准偏差和统计显著性(*P% 3C 0.05;**P% 3C 0.01;***P%3C 0.001)。术语见材料和方法。MAG物种按其酰基列出。在对照中发现的相同m/z比率的Cer(1-O-ENS)物种按数量降序排列。

1-O-酰基神经酰胺

Cer(1-O-ENS)是我们研究中极性最小的神经酰胺,通过质谱从对照表皮的级分2中鉴定(图8b)。2000年的Cer(1-O-ENS)水平增加Fatp4/薄层色谱分析显示,许多在两个酰基链中携带48个或更少碳原子的人的表皮水平急剧上升。相比之下,Fatp4/表皮显示具有两个饱和的较长酰基链的那些细胞水平显著降低,例如25:0-d18:1/26:0。

葡糖苷酰鞘氨醇

来自对照的未结合脂质部分6的质谱显示了在我们的研究中鉴定的大多数神经酰胺物种的糖基化前体(图S10)。所有三种植物(图9b)和几乎所有的类属物种(图9f)减少了Fatp4/表皮,相当于相应Cer(EOS)物种的减少。例如,由于d18:1/ϖh32:0-18:2的GlcCer(EOS)物种在突变体中显示出最显著的减少(6.6倍的变化),其相应的加工Cer(EOS)物种也显示出最显著的减少(11.9倍的变化)。除了那些带有16个碳的酰基链的物种之外,具有不同m/z比的几种GlcCer物种的比例显示出与它们相应的Cer物种相似的变化(图1)。9d)。相比之下,其他GlcCer类的丰度变化与Cer的相应处理形式的变化没有显示出良好的相关性。例如,尽管突变体中GlcCer(NS)的数据反映了含有25个或更多碳的饱和脂肪酰基部分的Cer(NS)物种的比例显著降低,但它们没有揭示含有不饱和酰基链或较短饱和酰基链的Cer(NS)物种的比例相应增加(图1)。9a)。也Fatp4/表皮显示带有25个或更多碳的饱和酰基部分的GlcCer(NP)物种减少,与之形成对比的是相应Cer(NP)物种的丰度没有变化(图。9c)。

图9
figure9

中未结合表皮脂质GlcCer含量的变化Fatp4/老鼠。新生小鼠未结合表皮脂质的组分6用电喷雾质谱分析为[分子负离子模式下的离子,并以任意单位量化。Fatp4/小鼠显示含有较长饱和酰基链(a,b,c),属于几种常见的物种(e),以及几乎所有的地球观测卫星物种(f)和几种葡萄糖受体(AS)物种的水平增加(d)。几乎所有这些缺陷都被Fatp1转基因标准化了。数据分别从5个Fatp4+/—(控制)。Fatp4/和FATP1拯救的突变体,显示m/z比率、标准偏差和统计显著性(*P% 3C 0.05;**P% 3C 0.01;***P%3C 0.001)。术语见材料和方法。

转基因FATP1在粒细胞中的表达改善了几乎所有未结合表皮脂质中检测到的成分异常Fatp4/老鼠(无花果69)。

年蛋白质结合脂质中OHFA和脂肪酰基部分的变化Fatp4 /表皮

来自对照表皮的蛋白质结合脂质的混合级分4和5的质谱鉴定出OHFA含有32至36个碳,所有碳都带有一个或两个不饱和键,ωh34:1和ωh32:1最丰富(图1)。10a)。Fatp4/表皮显示几乎所有OHFA物种的比例显著下降。来自对照表皮的蛋白质结合脂质的级分3的质谱显示Cer物种携带28至36个碳的饱和或不饱和OHFA链(图1)。10b),与蛋白质结合的OHFA形成对比,后者都带有一两个不饱和键。Fatp4/表皮显示所有饱和Cer(OS)物种的水平降低,特别是d18:1/ωh32:0,这表明丰度降低170倍以上,而不饱和物种的水平增加或不变。粒细胞中转基因FATP1的表达使几乎所有观察到的蛋白质结合表皮脂质的组成不规则性标准化Fatp4/老鼠(图10)。

图10
figure10

中国人蛋白质结合表皮脂质中脂肪酸和神经酰胺含量的变化Fatp4/老鼠。混合分数4和5(a)和分数3(b)的蛋白结合表皮脂质进行电喷雾质谱分析负离子模式下的离子,并以任意单位量化。几乎所有OHFA物种(a)和所有饱和的Cer物种(b)见于Fatp4/小鼠大多被Fatp1转基因标准化。数据分别从以下4项中获得Fatp4+/—(控制)。Fatp4/和FATP1拯救的突变体,显示m/z比率、标准偏差和统计显著性(*P% 3C 0.05;**P% 3C 0.01;***P%3C 0.001)。术语见材料和方法。

讨论

Fatp4/表皮在板层体分泌系统中显示出多个超微结构异常,一个有缺陷的角质细胞脂质包膜和一个变薄的角质包膜。这些异常反映了在未结合和蛋白质结合的表皮脂质中观察到的脂质组成变化Fatp4/小鼠,通常分别构成细胞间脂质层和角质细胞脂质包膜。

我们对正常新生小鼠表皮脂质未结合部分的薄层色谱和电喷雾质谱分析确定了五个主要神经酰胺类,Cer(EOS)、Cer(NS)、Cer(NdS)、Cer(BS)、Cer(AS),以及三个次要类,Cer(1-O-ENS)、Cer(NP)和Cer(OS)。与以前的报道相比,我们的研究是独特的,因为我们鉴定了Cer和非神经酰胺类脂MAG26,28,32,34。基于薄层色谱和化学反应性,表皮细胞癌和巨噬细胞癌在近三十年前首次在新生小鼠中被报道28但是直到现在还没有被微软证实。我们对未结合脂质的定量结果显示Fatp4/新生表皮显示OAHFA、Cer、MAG/Cer(C16)、Cer(英国)和GlcCer(美国)的比例显著降低,Cer(1-O-ENS)、Cer(挪威)、Cer(美国)≥ C22、Cer(C16)和未知脂质x的比例增加Fatp4/表皮在OHFA和Cer(OS)中显示出显著下降的比例,Cer是角质细胞脂质包膜的两个主要组成部分。

我们对未结合脂质部分的分析也揭示了Fatp4/表皮(见表中的摘要1)。Fatp4/表皮显示所有携带至少30个碳的饱和或不饱和OHFA主链的Cer(EOS)物种的产量大幅下降。第二,其他几类神经酰胺的变化显示了向含有至少25个碳的饱和酰基链的神经酰胺丰度降低和含有较短饱和酰基链的神经酰胺丰度增加的组合物的转变。综上所述,我们的结果表明,渗透率屏障结构的疏水性较低Fatp4/表皮。我们的数据还显示了脂肪酶4在吸收和/或活化至少含25个碳原子的饱和NHFA和六六六以及至少含30个碳原子的饱和或不饱和OHFA中的关键作用,以便随后合成相应类别的神经酰胺。例如,在细胞色素P450 CYP4F22催化的FAs羟基化后,脂肪酶P4激活OHFA成辅酶a形式,而这种催化作用因极低分子量的CFA蛋白4 (ELOVL4)的延伸而延长,这是产生Cer(EOS)的假设25,37,38

表1总结了中未结合和蛋白结合表皮脂质中脂肪酰基链长度和饱和度的变化Fatp4/老鼠。

Fatp4/新生表皮显示转向疏水性较低的脂质成分与我们之前报道的缺陷屏障一致39。脂质组成和皮肤屏障之间的相关性使人想起我们以前的发现,即由皮脂腺合成的二型二酯蜡表达低于正常水平的脂肪P4,具有较短碳链长度和较高不饱和度的脂肪酰基部分。这些变化导致皮脂流动性增加,毛皮防水性降低40

来自其他几个动物模型的数据也支持Cer(EOS)在渗透性屏障功能和围产期存活中的重要性,包括缺乏ELOVL4的小鼠31,41,42,43,神经酰胺合酶344含patatin样磷脂酶结构域1 (PNPLA1)45,46,47,48,酰基CoA:二酰基甘油酰基转移酶249,含有蛋白质5 (ABHD5)的α/β水解酶结构域36,硬脂酰CoA去饱和酶250和鞘脂激活蛋白前体/前aposin26。这些蛋白质都参与了Cer(EOS)合成或利用的途径。相比之下,显示非致死表型和相对温和屏障缺陷的动物模型不显示表皮Cer(EOS)水平的变化。例如,然而Fatp4/与对照组相比,小鼠经皮失水增加了至少200%14,Acbp/老鼠51缺乏酰基CoA结合蛋白和Elovl3/老鼠52缺乏将脂肪酰基链延长至24个碳的酶53仅分别增加约50%和约70%的经皮失水。

本研究中Cer和MAG的鉴定以及我们最近关于人角质层脂质的报告中Cer的鉴定27是独一无二的。据我们所知,人类或其他哺乳动物的皮肤中尚未发现Cer和MAG。Fatp4/表皮显示所有MAG物种中携带22-30个碳的饱和酰基链的比例急剧下降。在一个在试管内研究表明,含有22-26个碳的饱和酰基链的MAG物质的混合物显示出比含有碳氢化合物混合物的凡士林更好的封闭性,表明MAG在皮肤屏障中的作用54。表皮MAG不太可能主要由三酰基甘油和二酰基甘油的酶促或非酶促脂解产生。首先,我们的质谱分析显示,对照组小鼠的表皮三酰基甘油在酯化至甘油骨架的三个脂肪酰基链中总共仅包含46至56个碳(数据未显示),其中携带52和54个碳的是最丰富的物种,表明三酰基甘油中的酰基链比MAG中的短。第二,军事检察长的级别降低Fatp4/表皮伴有未改变水平的三酰基甘油,如我们之前的研究所示14这意味着这两种脂质之间的产量没有相关性。表皮MAG的来源还有待研究。

在角质层脂质模型中,据报道缺乏Cer或用较短链长的脂肪酸替代FFA会导致脂质薄片组织改变和渗透性增加55,56,57。扰乱的脂质组成对细胞间脂质薄片组织和/或屏障功能的影响已在人类皮肤病如特应性湿疹和尼日顿综合征中被揭示58,59,60两种炎症性疾病,表现为皮肤屏障缺陷和过敏特征。在中也观察到了这些疾病共有的一些脂质成分缺陷Fatp4/表皮,包括长链神经酰胺水平降低和短链神经酰胺、Cer和单不饱和脂肪酸水平升高。

突变体中Cer(EOS)和几个C22物种丰度的变化很好地反映在它们相应的GlcCer前体中,而Cer(NS)、Cer(NP)和Cer(AS)C16的变化则没有。这表明GlcCer不是这些神经酰胺的唯一前体,这与小鼠和人表皮脂质中的发现一致,即神经酰胺2 (Cer(NS))和5 (Cer(AS)C16)也可以来自包装在层状体中的鞘磷脂61

我们的数据显示Fatp4/表皮显著减少,并从疏水性更强的成分转变为疏水性更弱的成分。我们最近从表皮脂质合成突变的患者和动物模型中获得的数据表明,角质细胞脂质包膜来源于板层体的界膜,并作为细胞间脂质板层和角质包膜形成的双向支架25。因此,结合核证的异常很可能是导致中有缺陷的屏障的原因Fatp4/老鼠。其他几个显示皮肤屏障缺陷的动物模型也显示角膜细胞脂质包膜超微结构的改变,或结合细胞因子水平的减少或减少26,36,41,44,45,62,63。在12R-脂氧合酶-和ABHD5-缺乏的表皮中,饱和和不饱和结合的Cer物种都显著减少。相反,FATP4缺乏的表皮在所有饱和结合Cer(OS)物种中显示耗尽,但在不饱和Cer(OS)物种中显示各种变化。

随着底物对饱和NHFA和BHFA (≥C25)和饱和或不饱和OHFA (≥C30)的偏好,预计这些游离脂肪酸分子将在内部积累Fatp4由于细胞不能驱动其酰基辅酶a衍生物的形成和使用而导致的突变角质细胞。然而,在2006年,伦敦金融管理局显示了最引人注目的高度Fatp4/表皮为不饱和NHFA (≥C26)。这可能是由于饱和NHFAs转化为不饱和NHFAs以防止脂肪毒性所致(见下文)。或者,在Fatp4/表皮也可能是由于未知机制使FAs更快地传递到细胞中,FAs合成增加,或其他脂质降解成FFA增加。在其他动物模型中也有FFA在皮肤中积累的报道。例如,在PNPLA1缺陷小鼠中观察到对受损Cer合成和皮肤屏障的类似代偿反应46

观察到的游离脂肪酸异常可改变角质层的酸碱度或引起细胞毒性6。例如,2000年的FFA水平下降Acbp/小鼠角质层的酸碱度增加,这可能会影响FAs的离子化,导致层状膜的不稳定性和屏障的缺陷51。据报道,在培养细胞中,饱和LCFA像棕榈酸通过脂质重塑、氧化应激或内质网应激导致细胞死亡,而不饱和脂肪酸像油酸保护细胞免受脂质毒性64,65。脂肪毒性也可能是由过量游离脂肪酸与钙的去污剂作用造成的66

综上所述,我们通过高分辨率质谱获得表皮脂质数据,以获得准确的结果,通过质谱验证表皮细胞因子(BS)和MAG的存在,并验证薄层色谱板上细胞因子(NP)的脂质带。我们的脂质组学分析也代表了最彻底的渗透性屏障研究Fatp4/迄今为止的小鼠,提供了关于FATP4如何通过调节包括神经酰胺和MAG在内的各种屏障脂质中的脂肪酰基部分来促进屏障功能的信息。了解FATP4如何调节脂质代谢对于阐明鱼鳞病早产儿综合征及相关疾病的发病机制和潜在治疗方法非常重要。

材料和方法

老鼠

Fatp4突变体(Slc27a4wrfr)和人渐开线蛋白启动子驱动的Fatp4和Fatp1转基因小鼠14。所有动物实验都符合美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南,并获得华盛顿大学动物护理和使用机构委员会的批准。

电子显微镜

电镜超微结构分析按上述方法进行25。为了观察角质细胞脂质包膜并量化角质包膜尺寸,皮肤样品在室温下在绝对吡啶中快速冷冻和解冻2小时。标准固定后,样品在环氧树脂包埋前在还原的四氧化锇或四氧化钌中后固定。样品在徕卡超切切片机(徕卡显微系统有限公司,德国威兹拉尔)上切割,并使用Gatan数码相机在JEOL 100CX透射电子显微镜(日本东京JOEL)上成像。为了定量,在来自每种基因型的两只小鼠的角质层中部的5张随机高能电子显微照片中的至少25个随机选择的位置测量角化包膜的厚度。记录这些测量结果的观察者对这些组视而不见。

檐口围护结构的隔离

胚胎第16.5天或更老小鼠胚胎的背部皮肤(5 × 5毫米)用剃刀刀片切碎,并在200升含有0.1 M Tris、pH8.5、2% SDS、20毫米DTT、5毫米乙二胺四乙酸、pH8.0的提取缓冲液中煮沸5分钟67

表皮脂质的提取

为了获得游离的可提取脂质,按照所述制备冻干的10毫克表皮样品14在离心管中的0.8毫升水中浸泡5分钟,并加入3毫升氯仿/甲醇(1∶2,v∶v)。在室温下涡旋30秒和摇动2小时后,加入另外1毫升氯仿和1毫升水。将提取管再涡旋30秒,以2000转/分钟离心5分钟,将下层有机层和表皮分别转移到新的管中。有机层在1毫升氯仿、1毫升甲醇和0.9毫升水中通过涡旋和离心再次提取。将有机相转移到小瓶中,用氮气蒸发器干燥(马萨诸塞州柏林有机化协会有限公司),重新悬浮在200升氯仿/甲醇(2∶1)中,并在20℃下储存

为了提取蛋白质结合的脂质,通过在2 ml氯仿/甲醇混合物中以1∶1、1∶2和0∶2的比例依次摇动1小时,从上述提取中获得的表皮被除去残留的游离脂质。弃去提取物后,将1毫升50毫摩尔甲醇氢氧化钠加入表皮,然后在56℃孵育2小时,偶尔混合。然后用30升2 N盐酸中和反应,并在2 ml氯仿和2 ml水中提取。有机层收集在小瓶中。用2 ml氯仿再次提取上相和表皮,收集有机相并与之前的提取物合并。如上所述干燥、重悬和储存合并的提取物。

为了通过质谱定量可提取的游离脂质,在提取开始时将脂质标准加入样品,如下所示:1g 1-油酰-N-十七烷基-D--鞘氨醇(18:1-d18:1/17:0-Cer(1-O-ENS);860526来自两代情极地类脂公司,雪花石膏,铝)的Cer(1-O-ENS);3 g十三酸(13:0-脂肪酸;宾夕法尼亚州普莱森特盖普马特里亚有限责任公司的1161英镑)。2 g正癸酰基-D--鞘氨醇(d18:1/10:0-Cer(NS);Cer(NS)、Cer(NdS)和Cer(EOS)的Matreya 1333;11克单聚腺苷酸(17:0-MAG;明尼苏达州伊利西亚努契克准备公司生产的m-159);1克N-α-羟基十二烷基-D--鞘氨醇(d18:1/αh12:0-Cer(AS);Cer(AS)、Cer(AdS)、Cer(BS)、Cer(OS)和Cer(NP)的Matreya 2042;和0.2 g右旋葡萄糖基-β1-1’-正十二烷基-右旋-鞘氨醇(d18:1/12:0-GLccer);来自两代情的860543便士)。

为了通过质谱定量蛋白质结合的脂质,在碱性溶液中孵育开始时将脂质标准加入样品,如下所示:1g 17-羟基十七烷酸(ωh17:0-OHFA;1760年从马特里亚)前往OHFA;和1g N-α-羟基十二烷基-D--用于Cer(操作系统)的鞘氨醇。

脂质的薄层色谱分析和定量

使用前,将柔性硅胶60板(西格玛、圣路易斯、密苏里州)在烘箱中于100℃烘烤30分钟。将游离的可提取或结合蛋白质的脂质以及脂质标准物施加到板上,并在预平衡罐中在氯仿/甲醇/水(40∶10∶1)的溶剂混合物中溶解,直到溶剂前沿从板底部移动7厘米。将板风干5分钟,并在氯仿/甲醇/冰醋酸(95∶4.5∶0.5)的混合物中再分解两次,直到溶剂前沿到达板的顶部,在两次显影之间风干5分钟。干燥分离的平板,通过在8%磷酸中喷洒3%乙酸铜,然后在180℃炭化15分钟,观察脂质斑点68

为了定量脂质类型,扫描烧焦的薄层色谱板上的脂质斑点,并在图像j(http://rsbweb.nih.gov/ij/)共色谱标准如下:油酸(18:1-脂肪酸;努赤的U-46A)在0.5至4 g的范围内,用于量化审调处,在0.5至8 g的范围内,用于OAHFA单油酸甘油酯(18:1-MAG;西格玛的1787-1AMP)在0.5至4 g范围内。牛神经酰胺,NHFA (1056,马特里亚公司)的Cer(1-O-ENS)、Cer(EOS)和Cer(NS)在0.265至2.12克范围内;含有AHFA的牛神经酰胺(马特里亚的1056种),其含量范围为0.235-1.88克(含砷)、砷、砷和脂质,0.235-3.76克(含氧);和牛半乳糖神经酰胺(1128来自马特里亚)在0.5至4 g的范围内。每个脂质带的量以干表皮重量的克/毫克表示。

脂类分馏

脂质的分级如前所述进行,但做了一些修改69。将粗脂质干燥,重新溶解在500升氯仿中,并装载到3毫升/500毫克马谢尔-内格尔(德国杜伦)氨基苯并二氢吡喃-Sep-Pak柱上,用2 × 3毫升己烷预洗涤。首先用3毫升己烷∶乙醚(90∶10)(馏分1)洗脱该柱,然后用3毫升己烷∶乙酸乙酯(75∶25)(馏分2)、3毫升氯仿∶甲醇(15∶1)(馏分3)、2 × 3毫升二异丙醚∶乙酸(98∶5)(馏分4和5)、3毫升丙酮∶甲醇(9∶1.4)(馏分6)、3毫升氯仿∶甲醇(2∶1)(馏分7)洗脱,最后用3毫升氯仿∶甲醇(1∶2)(馏分8)重力洗脱。洗脱液在氮气中干燥,重新溶解在氯仿(对于级分1至5)或氯仿/甲醇(2∶1)(对于级分6至8)中,并储存在-20℃

从薄层色谱板中回收脂质

为了从薄层色谱中回收脂质带,粗脂质或分级脂质在薄层色谱板上被分离,薄层色谱板在氯仿/甲醇(1∶1)中空白显影过夜以除去杂质。拆分条件如上所述,不同之处在于将馏分2脂质的制备板在氯仿/甲醇/冰乙酸的混合物(95∶4.5∶0.5)中拆分,直到溶剂前沿从板底部移动16厘米,然后在己烷/乙醚/乙酸的混合物(75∶25∶1)中拆分,直到溶剂前沿到达板的顶部。从盘子上切下一条分辨出的样品通道,作为信托标记烧焦。对准烧焦的泳道,用铅笔标记不带电板上感兴趣的脂质带,用剃刀刮出,并通过在氯仿∶甲醇(2∶1;1.5毫升/厘米2刮去凝胶)30秒,然后离心。然后收集提取物,干燥,再悬浮在氯仿或氯仿/甲醇(2∶1)中,并在20℃下储存

质谱脂质分析和定量

脂质分析是在热科学公司(加利福尼亚州圣何塞)的LTQ轨道速度质谱仪上进行的,该质谱仪具有如上所述的Xcalibur操作系统27。分级脂质或从薄层色谱板回收的脂质用1%氨水稀释在甲醇中4使用内置注射泵将氢氧化物和回路注入电喷雾电离源,注射泵输送恒定流量的甲醇和1%的氢氧化物4以15升/分钟的流速运行。电喷雾电离针设置为4.0千伏,加热毛细管的温度为300℃。离子阱的自动增益控制设置为5 × 104氦气用作缓冲气体和碰撞气体,压力为1 × 10—3毫巴(0.75毫托)。微软n(n = 2,3)获得光谱用于结构鉴定27并且实验是在30-45%范围内的优化相对碰撞能量下进行的,活化q值为0.25,活化时间为10 ms,以留下最小的前体离子剩余丰度(约20%)。前体离子的质量选择窗口设置为1 Da宽,以允许单同位素离子进入离子阱,用于离子阱中的单位分辨率检测或轨道阱质量分析器中的高分辨率精确质量检测。质谱以简档模式累积,质谱通常持续2-10分钟n光谱(n = 2–4)。脂质定量是通过高分辨率电喷雾质谱测定脂质部分实现的,在提取前加入内标物。所有神经酰胺都被分析为[分子]处于负离子模式的离子,但1-O-酰基神经酰胺除外,它们被分析为[M + H]+正离子模式下的离子。MAG被检测为[M + NH4]+正离子模式下的离子。计算单个脂质种类与内标物的强度比,标准化为干燥表皮重量,并且以任意单位绘制单个脂质种类的丰度。

术语

IUPAC推荐的以下名称和缩写(https://www.qmul.ac.uk/sbcs/iupac/lipid/)被使用。神经酰胺的名称是d(或t)长链碱/FA的形式,d表示二羟基,t表示三羟基长链碱。因此,例如,鞘氨醇(鞘氨醇-4-烯)和鞘氨醇长链碱基分别被指定为d18:1和d18:0。带有或不带有羟基取代基的脂肪酰基部分分别表示为hFA或nFA,带有α-、β-或ω-羟基脂肪酰基取代基的鞘氨醇神经酰胺分别表示为d18:1/αhFA-Cer、d18:1/βhFA-Cer、d18:1/ωhFA-Cer。因此,例如,N-α-、N-β-和N-ω-羟基棕榈酰-鞘氨醇分别被指定为d18:1/αh16:0-Cer、d18:1/βh16:0-Cer、d18:1/ωh16:0-Cer。为了分类神经酰胺亚科,莫塔命名法以及其他人70,由罗布森扩展以及其他人71和马苏卡瓦以及其他人72,被收养。鞘氨醇碱基S、dS、P和H的首字母分别代表鞘氨醇、二氢鞘氨醇、植物鞘氨醇和6-羟基鞘氨醇,FA残基N、A、B和O分别代表非羟基化酰基、α-羟基酰基、β-羟基酰基和ω-羟基酰基。因此,例如,d18:0/16:0-Cer、d18:1/βh16:0-Cer和d18:1/ωh16:0-Cer分别属于Cer(NdS)、Cer(BS)和Cer(OS)子家族。

统计分析

双尾不成对学生的t-测试用于确定角质化包络测量的统计差异。双向混合模型方差分析用于通过薄层色谱和电喷雾质谱定量脂质P%3C 0.05。


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