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PICOT与染色质相关的EED结合通过增加CCND2基因启动子的H3K27me3负调节细胞周期蛋白D2的表达

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发表时间:2019-09-17 10:07作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

PICOT与染色质相关的EED结合通过增加CCND2基因启动子的H3K27me3负调节细胞周期蛋白D2的表达


摘要

硫氧还蛋白的蛋白激酶C (PKC)相互作用的表兄(用小环装饰; 也称为glutaredoxin 3 (Grx3; Glrx3))是一个无处不在的蛋白质,这种蛋白质可以与胚胎外胚层发育(EED)蛋白通过其两个c端皮科/ Grx同源域。 由于速度是Polycomb-Group polycomb专制复杂的蛋白质和核心组件2 (PRC2),我们测试了用小环装饰的参与监管的PRC2-mediated H3赖氨酸27 trimethylation (H3K27me3),选择PRC2目标基因的转录和翻译。 细胞的一小部分用小环饰边的细胞核蛋白被发现白血病细胞系,与染色质。 此外,皮科coimmunoprecipitated chromatin-residing速度来源于Jurkat和COS-7细胞核。 用小环装饰击倒导致减少H3K27me3马克和速度和EZH2下降CCND2基因启动子。 在协议中,PICOT-deficient T细胞表现出显著增加CCND2信使rna和蛋白质表达。 表达水平升高以来皮科曾在数个不同的肿瘤,在当前相关研究与降低转录和翻译的CCND2基因,我们测试是否相反的关联存在于人类癌症。 癌症基因组图谱的数据(TCGA)数据库显示统计上显著的负相关性用小环装饰CCND2八个不同的人类肿瘤中最高的相关性是肺(p10 = 8.67 e−)和胰腺(pe = 1.06−5)腺癌。 此外,高表达用小环装饰和低表达的CCND2与病人生存在五种不同类型的人类肿瘤。 结果表明,皮科绑定chromatin-associated速度调节在H3K27me3水平CCND2基因启动子可能是一个潜在的机制调节细胞周期蛋白D2表达肿瘤。 这些发现还表明,低用小环装饰/ CCND2表达率可能作为很好的预测病人生存选择的人类癌症。

介绍

蛋白激酶C (PKC)-硫氧还蛋白的相互作用表兄(用小环装饰,也称为glutaredoxin 3 (Grx3; Glrx3)),在2000年被发现在搜索PKCθ绑定蛋白1。 皮科拥有三个进化保守域包括氨基硫氧还蛋白(硫氧还蛋白)同源域和串联重复序列的皮科/ glutaredoxin (Grx)同源域2,3.。 然而,硫氧还蛋白和Grx相比,具有两个redox-active半胱氨酸催化部位,用小环装饰只拥有一个假定的催化区域的半胱氨酸残基的三个领域,因此缺乏经典的硫氧还蛋白或Grx催化活动。

而用小环装饰的确切生物学作用尚未解决,其关键作用在皮科缺陷小鼠胚胎发育进行验证表明生长迟缓和形态缺陷在开发期间,导致死亡后coitum ~ 12.5天4,5

用小环装饰是一种广泛表达蛋白,主要居住在细胞质中6。 但是,它也存在于细胞核6在给定的时间,其亚细胞分布取决于细胞类型和激活/分化阶段7

用小环装饰调节c-Jun氨基端激酶(物)/ AP-1 NF-κB通路在T细胞,它与PKCθcolocalizes1。 其表达式是调节心脏肌肉肥厚性刺激反应中皮科变弱的压力overload-induced心脏肥大和增加心室功能和心肌细胞收缩性5,8。 进一步的研究表明,用小环装饰在细胞铁代谢和生物转化过程中发挥作用的Fe / S蛋白和血红蛋白成熟9,10。 用小环装饰表达水平增强mitogen-stimulated或antigen-stimulated T细胞11,以及在不同肿瘤细胞系11。 此外,高表达水平的皮科观察体内多种癌症,包括霍奇金淋巴瘤11和乳房7、结肠癌和肺癌12

利用一个完整的人用小环装饰互补脱氧核糖核酸酵母二者混合屏幕的Jurkat T细胞cDNA库透露,皮科与胚胎外胚层交互发展(EED)的蛋白质13。 用小环装饰与速度的交互验证了在不同的人类细胞系,并得到使用销售税拉化验,互惠coimmunoprecipitation和免疫荧光成像13。 绑定的皮科的速度是由每个两个c端皮科/ Grx同源域13

速度属于Polycomb-Group (PcG)的蛋白质14,15关键的染色质重塑和表观遗传基因沉默16。 速度作为核心组件的polycomb压制复杂2 (PRC2)催化组蛋白H3 trimethylation在赖氨酸27日(H3K27me3),多种基因的转录镇压的标志17

基于以上信息,我们推测,速度可能会用小环装饰交互影响PRC2目标基因的转录过程。 初步研究支持这一假说,证明用小环装饰混战Jurkat T细胞导致减少H3K27me3 PRC2目标基因,髓鞘转录因子1(MYT1)13

在目前的研究中,我们进一步分析了潜在的参与皮科的规定PRC2-mediated H3K27 trimethylation。 我们也分析了影响皮科PRC2选择目标基因的转录和翻译测试和本条例的潜在相关性癌症恶化。

结果

核用小环装饰部分colocalizes白血病细胞的速度

分析是否用小环装饰colocalizes核速度在白血病细胞,我们进行免疫荧光染色的皮科和速度在四个不同的人类白血病细胞系。 激光扫描共焦显微镜重新染色细胞的主要核本地化速度和证明,皮科驻留在细胞质和细胞核(无花果。1)。 有趣的是,覆盖图像显示的部分colocalization主要两种蛋白质在细胞核的细胞系(无花果。1),建议用小环装饰和速度可能在核函数。 的程度PICOT-EED colocalization细胞系的计算使用ImageJ colocalization JACoP ImageJ插件18和值图所示。1

图1:核用小环装饰部分colocalizes白血病细胞的速度。
figure1

Jurkat u - 937, MOLT4 THP1细胞(1.5×106/组)被播种在poly-L-lysine-coated 8日µ-slide (ibidi有限公司)和沉积在1200转离心5分钟。 这些细胞被固定,permeabilized和孵化的鼠标anti-PICOT马伯和兔anti-EED多克隆Abs在室温下1 h。 细胞被染色使用Cy3-conjugated anti-mouse Abs和Cy5-conjugated anti-rabbit Abs、加上核与DAPI复染色(PBS 1µg /毫升)1 h在黑暗中,在室温下。 细胞使用共焦显微镜进行分析(1000年奥林巴斯Flouview激光扫描共焦显微镜)。 PICOT-EED colocalization演示了在一个面板颜色叠加,和一个选择区域,一个红色的盒子,放大显示在右面板。 进行比较的量化PICOT-EED colocalization使用ImageJ colocalizationJACoP imageJ插件18。 皮尔森系数值和曼德的系数值(M1 =红与绿; M2 =绿色与红色)对每个面板上表示

特异性的anti-PICOT Abs被缺乏免疫荧光染色PICOT-deficient Jurkat T细胞(Jurkat.1A)(图中未显示),而特异性anti-EED Abs的证明在EED-deficient Jurkat T细胞通过转染EED-specific小干扰RNA (si)19

用小环装饰驻留在肿瘤细胞株的染色质分数

随着核皮科colocalizes速度,PRC2的核心组成部分,同事与染色质和维护其专制状态13,我们测试是否用小环装饰也可以与染色质。

暂时COS-7细胞转染HA-PICOT,FLAG-EED或控制FLAG-CMV表达载体之后,染色质隔离,显示在标准的染色质免疫沉淀反应(芯片)的测定。 免疫印迹分析表明染色质分数包括内源和外源皮科蛋白(无花果。2 a, b),以及内源和外源速度蛋白质(无花果。2 c, d)。

图2:用小环装饰驻留在肿瘤细胞的染色质分数。
figure2

暂时COS-7细胞转染表示向量表达式使用裴试剂。 染色质溶解产物从转染和untransfected COS-7细胞准备使用蛋白质芯片的协议,煮,进行sds - page(5µg / lane)在两个平行的12.5%减少条件下凝胶。 蛋白质被electroblotted到两个平行硝基免疫印迹膜,用鼠标anti-PICOT马伯(一个),或者兔子anti-HA多克隆Abs (b),其次是开发利用immunoperoxidase发射极耦合逻辑检测系统和放射自显影法。 然后免疫印迹膜和兔anti-EED Abs (c),鼠标anti-FLAG马伯(d)和鼠标anti-Histone H3 Abs (e),它作为一种蛋白质加载控制。 在类似的实验中,染色质溶解产物是由七种不同的细胞系和样本与小鼠免疫印迹anti-PICOT马伯(f)和鼠标anti-Histone H3马伯(g)。 细胞系的来源如下表中表示

进一步分析是否存在皮科在染色质溶解产物是一个普遍的现象,我们从七种不同的细胞系其次是孤立的染色质sds - page分离。 免疫印迹分析显示,用小环装饰驻留在所有测试的染色质分数细胞系(无花果。2 f),这表明核皮科在染色质调节功能的作用。

用小环装饰与染色质驻留速度

测试是否用小环装饰与chromatin-associated交互速度,我们执行特定co-immunoprecipitation染色质部分使用PICOT-specific Abs Jurkat T细胞溶解产物。我们发现速度coimmunoprecipitated用小环装饰,而正常免疫球蛋白作为控制没有免疫沉淀反应速度(无花果。3)。 相比之下,anti-PICOT Abs没有coimmunoprecipitate其他PRC2核心组件,如EZH2(无花果。3 b)或SUZ12(无花果。3 c)。

图3:PICOT-EED交互在染色质间共存。
figure3

Jurkat COS-7细胞(20×106/组)被固定在1%甲醛在室温和染色质溶解产物离心10分钟准备使用蛋白质芯片的协议。 蛋白质G-sepharose珠子的染色质样本事先批准,孵化一夜之间在4°C与G蛋白琼脂糖bead-immobilized鼠标anti-PICOT马伯或鼠标正常免疫球蛋白(10×106细胞每组)。 蛋白质被筛选了β-mercaptoethanol-containing珠子的再悬浮样品的样品缓冲(180µl)和煮30分钟。 离心后,上清液(1.5×106细胞相当于20µl)受到sds - page凝胶10%减少的条件下。 染色质溶解产物(5µg / lane)煮并行和电泳。 在硝化纤维膜,蛋白质被electroblotted顺序与兔免疫印迹anti-EED多克隆Abs (一个,f)和兔anti-EZH2马伯(b,g)。 平行膜是顺序与兔免疫印迹anti-SUZ12马伯(c),鼠标anti-PICOT马伯(d,h)和鼠标anti-histone H3马伯(e,)。 蛋白质乐队被可视化使用immunoperoxidase发射极耦合逻辑检测系统和放射自显影法。 免疫沉淀反应使用免疫球蛋白马伯作为消极的控制。 特定的蛋白质乐队的位置由箭头表示。 结果是代表三个独立的实验。 IP,免疫沉淀反应; IB,免疫印迹

技术控制,皮科免疫沉淀反应,与anti-PICOT Abs显示有效复苏的皮科蛋白质免疫印迹染色质溶解产物(图。3 d)。 此外,这些结果是重复使用COS-7细胞,速度(无花果。3 f),但不是EZH2(无花果。3 g用小环装饰)coimmunoprecipitated。

为了进一步证实这些发现,我们进行互惠coimmunoprecipitation Jurkat T细胞染色质溶解产物,发现anti-EED-Abs coimmunoprecipitated皮科(图。1 sa)和EZH2(无花果。1某人)。 倒数coimmunoprecipitation研究(图。1)表明,chromatin-associated速度可以用小环装饰和EZH2交互。 然而,PICOT-associated速度不绑定EZH2(无花果。3.),建议用小环装饰结合chromatin-associated速度免费的其他PRC2核心蛋白质。

击倒的皮科导致减少H3K27me3协会,速度和EZH2CCND2基因启动子

因为皮科与速度发生在染色质水平,我们测试了这种交互能否改变PRC2-mediated H3K27me3水平PRC2目标基因。 使用ChIP-qPCR,我们的水平相比三甲基H3K27选择目标基因在染色质溶解产物的控制与PICOT-deficient Jurkat T细胞。

我们最初测试皮科两个细胞系的表达水平,发现PICOT-deficient Jurkat T细胞(Jurkat.1A)表达~ 5倍相比,低水平的皮科控制Jurkat细胞(无花果。4)。

图4:击倒的皮科导致减少H3K27me3协会,速度,和EZH2CCND2基因启动子。
figure4

Jurkat和PICOT-deficient Jurkat.1A细胞在裂解缓冲resuspended冰(30分钟)和离心机。 核自由浮在表面的收集,煮,减少条件下进行sds - page凝胶10%(12.5µg /车道)。 蛋白质被electroblotted到硝化纤维膜和顺序与鼠标anti-PICOT免疫印迹(一个)和鼠标anti-β-actin马伯(b)其次是immunoperoxidase发射极耦合逻辑检测系统和放射自显影法。 用小环装饰的条形图显示了相对表达式两个细胞系(c)。 ChIP-qPCR化验,Jurkat Jurkat.1A细胞(20×106 /集团)是固定用1%甲醛在室温下(10分钟),在寒冷的PBS洗两次,然后再悬浮细胞溶解的裂解缓冲10分钟在冰上。 核颗粒,通过离心(5分钟,5000 rpm) resuspended核裂解缓冲,用近,离心机,事先批准蛋白质G-sepharose珠子。 孵化了染色质溶解产物protein-G琼脂糖bead-immobilized兔子anti-H3K27me3马伯(d),兔子anti-EZH2马伯(e),兔子anti-EED多克隆Abs (09 - 774) (f),或者兔子anti-IgG Abs作为控制。 隔夜孵化后旋转,珠子和低盐缓冲洗顺序,高盐缓冲,缓冲和氯化锂tris-EDTA缓冲区。 沉淀DNA筛选了免疫复合物和并行DNA从原油用筛选了染色质溶解产物。 孤立的DNA检测多个目标基因的存在使用适当的组在rt - pcr引物。 蛋白质的相对水平浓缩后免疫沉淀反应与特定的Abs和同形像控制(免疫球蛋白)在不同基因位点Jurkat与Jurkat.1A决心占总输入信号。 条形图代表平均值±标准偏差的计算值(d- - - - - -f)。 芯片分析生物重复两次,qPCR分析在一式三份。cdc 6α-satellite被用作非目标基因和芯片使用免疫球蛋白作为负控制免疫沉淀反应。 使用GraphPad棱镜7双向方差分析计算软件,以确定两个细胞系之间意义的水平

接下来,我们执行ChIP-qPCR使用H3K27me3和免疫球蛋白同形像(控制)和分析H3K27me3浓缩在选定的基因组区域,包括三个PRC2目标基因:细胞周期蛋白d2 (CCND2),同源框A2(HOXA2),激活转录因子3(ATF3),以及细胞分裂周期6(cdc 6),non-PRC2目标基因作为消极的控制。 我们发现重大H3K27me3浓缩(~ 3.5倍p< 0.0001)的启动子CCND2在Jurkat T细胞相比PICOT-deficient细胞(图。4 d)。 相比之下,没有观察到H3K27me3浓缩HOXA2ATF3,或者在PRC2非目标基因,cdc 6(无花果。4 d)。

DNA浓缩是不一般,观察到选定的基因(CCND2)并不令人感到意外,因为desilence PRC2选择目标基因已经被击倒后报道各种PRC2-associated蛋白质的基因20.

此外,当ChIP-qPCR优化PRC2组件,EZH2和速度,PRC2目标基因的百分比输入值明显高于当使用anti-EED(无花果。2某人)或anti-EZH2 Abs(图。2 sc),而同形像控制。

输入值的百分比PRC2非目标基因,α-satellite,要么anti-EED(图时相似。2某人)或anti-EZH2 Abs(图。2 sc同形像控制相比)。

自trimethylation H3K27由EZH2催化20.,21并进一步帮助传播的速度22,23,我们进一步测试了皮科降价是否会影响EZH2和速度出席PRC2目标基因。

用ChIP-qPCR anti-EZH2 Abs,我们揭示了~ 2.5倍降低EZH2的浓缩CCND2皮科缺乏细胞启动子(无花果。4 e)。

此外,ChIP-qPCR anti-EED Abs显示低~三倍浓缩的速度CCND2子皮科有缺陷的细胞,而控制Jurkat细胞(无花果。4 f)。 芯片EZH2和速度分析,没有观察到浓缩HOXA2α-satellite用小环装饰缺乏细胞(图。4 e, f)。

因此,用小环装饰协会与速度和促进trimethylation H3K27的CCND2子,因此可能影响的表达CCND2

测试用小环装饰是否直接与CCND2相关启动子区域我们执行ChIP-qPCR使用anti-PICOT马伯,从Jurkat细胞染色质免疫沉淀反应内生皮科蛋白溶解产物,或ChIP-grade anti-HA Abs immunoprecipitatie瞬变表示HA-PICOT从COS-7细胞染色质溶解产物。 结果表明,输入值百分比CCND2使用anti-PICOT马伯(无花果。3公司)或anti-HA Abs(图。3某人)没有明显不同的珠子只有对照组,表明用小环装饰不是direclty CCND2启动子。

击倒的皮科表达Jurkat T细胞细胞周期蛋白增加D2 mRNA和蛋白表达水平

自PRC2-mediated trimethyation H3K27的特定基因位点可以负调节基因的transcripiton,我们测试是否较低水平的速度,EZH2和H3K27me3CCND2启动子在PICOT-deficient细胞也会反映在基因转录和翻译水平。

使用中存在,我们的表达水平进行测试CCND2在控制和PICOT-deficient细胞。 两个PICOT-deficient不同等级,Jurkat.1A Jurkat.2G表现出显著的表达水平更高CCND2信使rna水平相比在控制Jurkat T细胞,或在Jurkat.5A亚系,表达了控制炒sc-PICOT DNA(图。5)。

图5:用小环装饰表达Jurkat T细胞负相关CCND2信使rna和蛋白质表达。
figure5

一个。 从Jurkat细胞RNA提取,PICOT-deficientsh-PICOT表达Jurkat不同等级(1和2 g)和控制,sc-PICOT表达Jurkat亚系(5)。 每个样本的总RNA(1µg /样本)被孤立和互补DNA作为模板使用Bio-RT(互补)准备TM第一个链cDNA合成装备(生物实验室)+六聚体随机引物。 互补脱氧核糖核酸在逆转录生成作为模板在随后进行的存在CCND2SDHAgene-specific引物置入双链DNA荧光染料,SYBR®绿色。 相对折叠的变化CCND2信使rna是决定的ΔΔCt方法和相对于计算SDHA信使rna。 结果作为一个条形图,平均值±标准误差表示。 实时PCR分析生物和一式三份井在每个实验重复三次。 单向方差分析测试使用GraphPad棱镜7计算软件来确定重要性水平。b- - - - - -d。 免疫印迹分析,Jurkat Jurkat-derived积累(5×106细胞/组)在裂解缓冲resuspended冰(30分钟),离心机和核收集上层的自由。 细胞溶解产物(2.5µg / lane)煮,减少条件下进行sds - page凝胶10%。 蛋白质被electroblotted到硝化纤维膜,与兔子anti-Cyclin D2马伯免疫印迹(b)随后immunoperoxidase发射极耦合逻辑检测系统和放射自显影法。 平行膜与小鼠免疫印迹anti-PICOT马伯(c)和鼠标anti-β-actin马伯(d)。 特定的蛋白质乐队的位置由箭头表示。 结果是代表三个独立的实验

增加CCND2PICOT-deficient mRNA水平细胞不是因为改变rna聚合酶II (Pol II)水平CCND2轨迹,因为rna聚合酶II芯片数据揭示相似水平的rna聚合酶II CCND2上游启动子区域的野生型和PICOT-deficient Jurkat T细胞(没有显示)。

此外,确定的水平CCND2编码蛋白质,细胞周期蛋白D2, PICOT-deficient细胞显示高水平的蛋白表达在PICOT-deficient细胞,Jurkat.1A和Jurkat.2G,而细胞周期蛋白D2 Jurkat蛋白表达水平和Jurkat.5A几乎检测不到(无花果。5 b)。

免疫印迹重新研究了低水平的皮科蛋白质Jurkat.1A Jurkat.2G细胞(图5度),而相同加载的溶解产物/巷验证了使用anti-β-actin马伯(无花果。5 d)。

用小环装饰表达水平负相关CCND2表达水平在人类癌症

目前的研究结果表明,用小环装饰缺乏Jurkat T细胞与hypomethylation H3K27的CCND2子,这导致upregulationCCND2基因转录和翻译,说明用小环装饰可能有负监管影响细胞周期蛋白的合成D2。 分析这种相关性是否存在于人类癌症,我们下载数据用小环装饰CCND2信使rna表达水平在32类型的人类癌症的癌症基因组图谱(TCGA)数据集。 使用皮尔逊相关系数,我们检查的程度之间的相关性用小环装饰CCND2在每个癌症,经过剪裁顶部和底部等分的每个测量,以避免异常值的影响(图。6)。 一般的表达水平之间的负相关的趋势用小环装饰CCND2可以观察到mRNA水平(表)。

图6:的表达水平用小环装饰信使rna在五种不同类型的人类癌症的负相关CCND2基因mRNA表达水平。
figure6

用小环装饰(Glrx3),CCND2信使rna表达水平在五种不同类型的人类癌症组织从TCGA下载使用ISB癌症基因组学云。 离群样本被剪裁十分位数顶部和底部的表达分布。 之间的相关性用小环装饰CCND2信使rna表达了散点图,每个点代表一个癌症组织样本。 对于每个类型的癌症,患者的总数(N),皮尔森的相关值(天哪),和p值表示

然而,消极的和显著的相关性用小环装饰CCND2mRNA水平只是观察8的32肿瘤类型。 其中,最强的相关性观察前列腺腺癌(马),肺腺癌(LUAD)和胰腺腺癌(PAAD),较低的,但重要的价值观在多形性胶质母细胞瘤(GBM),乳腺浸润性癌(BRCA),胃腺癌(STAD),食管(光电子能谱)和卵巢癌癌(OV)。 5日进行后续分析癌症类型。

之间的相关性用小环装饰CCND2可能是特定于癌症,反映转化细胞的调节异常,或可能是普遍和反映基本细胞控制机制。 区分这两个假设,我们试图测试PICOT-CCND2相关邻近正常组织肿瘤(邻近正常组织; NAT),它们与肿瘤的结果进行比较。 然而,信息用小环装饰CCND2信使rna表达水平在NAT样本更丰富,使统计分析只有在BRCA (n= 96)和LUAD (n= 54)。 我们发现,在结果中观察到的BRCA相比,用小环装饰CCND2mRNA水平表现出弱但显著负相关(软木=−0.0971,p= 0.001),一个相反的观察和与相关BRCA NAT(软木= + 0.03684,p= 0.721)。 之间的负相关用小环装饰CCND2信使rna表达水平在LUAD重复观察LUAD NAT(图。4 s)。

分析之间是否存在一种相反的关联用小环装饰CCND2LUAD mRNA水平与LUAD NAT和测试这种现象的普遍性,我们TCGA再次使用的数据,比较用小环装饰CCND2LUAD mRNA表达水平与LUAD NAT。结果(图。5 s)展示了一个高度显著增加用小环装饰信使rna表达LUAD LUAD NAT相比,和一个高度显著减少CCND2信使rna表达LUAD相比LUAD NAT建议增加用小环装饰和减少CCND2mRNA水平可以作为肿瘤标志物在LUAD。

从GSE62156 t数据上执行一个独立的分析,表明相关性−0.3 (p= 0.016,N= 64;t以及用小环装饰之间的皮尔逊积矩相关系数)和CCND2表达式。

相对较高的表达CCND2的皮科和低表达与病人生存在五种不同类型的人类癌症

先前的研究表明,高表达水平的皮科与增长促进正常11和癌症11,12,24细胞,而细胞周期蛋白的表达增加D2消极地影响前列腺癌细胞的生长25。 因为我们的之间的数据表现出负相关用小环装饰细胞周期蛋白D2信使rna表达水平在选定类型的人类癌症,我们进一步分析了这种相关性对整体的影响患者的生存。 使用TCGA公开数据集时,基因表达数据和病人的临床结果得到五种癌症疾病,即肺腺癌(LUAD),乳腺浸润性癌(BRCA),胰腺腺癌(PAAD)多形性胶质母细胞瘤(GBM),和食管癌(光电子能谱)。 患者分为两组基因表达水平的基础上,在顶部和底部tertiles,基因表达而言,被视为“高表达者”和“低表达者”,分别。

kaplan meier生存情节基因表达与生存概率和log-rankp值,以及每种类型的肿瘤的风险比,比较(图7)。 结果显示一个重大log-rankp用小环装饰在PAAD LUAD BRCA,光电子能谱(图。7A1 -4)。 类似的趋势观察日志等级p“绿带运动”的价值(无花果。7 a5),尽管相关用小环装饰表达和生存概率(0.11)在统计学上并不显著。 此外,风险比高(> 1)的关系用小环装饰表达式是所有肿瘤患者中观察到。 当日志级别p值了细胞周期蛋白D2低和高表达者,这是统计学意义在LUAD PAAD, BRCA,“绿带运动”(无花果。7B1 -4),但不是在光电子能谱(无花果。7 b5)和低风险比(< 1)在所有肿瘤类型。 没有临床数据的所有病人不允许分析之间的联系用小环装饰表达和病人生存在这个队列。

图7:一个相对高的表达用小环装饰和低表达的CCND2与病人生存在五种不同类型的人类癌症。
figure7

用小环装饰(Glrx3),CCND2信使rna表达和癌症患者的临床资料来源于TCGA数据库。 患者分为高(蓝色)或低表达组(橙色),使用最大限度地选择排名统计R包中实现“survminer”。 生存的病人可视化使用kaplan meier估计量。 的log-rankp值(用于估算的意义差异)和团体之间的风险比(人力资源)每个小组的插图所示

因此,我们的研究结果表明,过度的用小环装饰的差别,对这些CCND2与贫穷的整体分析在大多数肿瘤病人的存活率。

讨论

用小环装饰,缺乏导致胚胎杀伤力4,5其中牵扯到的皮科对胚胎发生至关重要的细胞功能。 此外,皮科降价导致的增长率Jurkat T细胞(图。6 s)和受损的小鼠成纤维细胞细胞周期进程和乘法和海拉细胞4。 此外,更高的皮科被观察到在T淋巴细胞表达水平11和心脏肌肉细胞8,26后刺激。 然而,皮科的分子机制影响细胞生长和调节细胞周期进展尚不清晰。

在先前的研究中,我们表明,皮科与速度,可以将蛋白质可以在细胞的细胞核部分colocalize13。 此外,用小环装饰结合速度有一个积极的影响H3K27甲基化在MYT1 PRC2目标基因13。 基于这些结果,我们建议用小环装饰结合速度可能影响装配或协调PRC2蛋白质亚基,调整EED-dependent EZH2-mediated组蛋白H3赖氨酸27 trimethylation,并有助于整体表观遗传调节染色质沉默和重构。

在目前的工作,我们发现第一次用小环装饰功能和细胞周期调控之间的联系,证明用小环装饰结合速度调节PRC2目标基因的转录调控,CCND2,一个细胞cycle-regulating D2基因编码产生的细胞周期蛋白的蛋白质。

我们表明,皮科同事chromatin-residing速度,用小环装饰降低导致减少H3K27me3马克和速度和EZH2下降CCND2基因启动子。 这些事件都是伴随着显著上升CCND2信使rna和蛋白质表达。 我们假设增加的细胞周期蛋白D2水平可能会改变其目标基因的活性,如CDK627,调节细胞周期的进程28,促进核机制导致早期胚胎细胞周期阻滞29

用小环装饰击倒并没有改变全球水平的H3K27me3(未显示),证明了其他PRC2辅助蛋白质,如Jumonji和at富集作用域包含2 (JARID2)30.。 不同效果的皮科击倒两个PRC2目标基因,CCND2HOXA2并不奇怪,因为击倒其他PRC2相关的蛋白质,如Polycomb-like蛋白质(PCL),也只发现desilence PRC2选择目标基因20.

速度是一个PRC2的核心组成部分17,其主要的生物活性与PRC2 complex-mediated组蛋白甲基转移酶活性,促进表观遗传基因沉默。 胚胎发育速度的关键作用是在敲除老鼠死在天~ 12.5后植入31,32,33

随着速度,PRC2复杂拥有三个额外的核心组件,即zeste同族体1或2 (EZH1/2),抑制的zeste12 (SUZ12)和视网膜母细胞瘤蛋白相关蛋白(RbAp46/48) 46/48。 EZH1和EZH2同源蛋白质作为调解的PRC2催化亚基甲基转移酶的活动。 而蛋白质促进转录沉默,他们通过不同的机制维护专制染色质34,35。 Jurkat T细胞表达只有少量的EZH1驻留在细胞质中,可以与ZAP70交互36。 相比之下,EZH2驻留在细胞核,是主要的同种型Jurkat T细胞37,38和它的表达与细胞增殖有关34

EZH2需要速度和SUZ12为了保持PRC2复杂的完整性和组蛋白甲基转移酶的活动23,39。 速度绑定EZH2 EED-WD40介导的域37与H3K27me3,互动,速度新兵PRC2复合物H3K27me3建立和实施维护专制的表观遗传标记17

哺乳动物的速度包括四个不同的亚型由四个不同的替代利用率,在坐标系翻译网站的开始速度信使核糖核酸21,40。 使用速度亚型的规范发展,表明不同的速度isoform-containing PRC2复合物可能有不同的组蛋白甲基转移酶活性和/或目标选择性21。 微分用小环装饰协会选择速度亚型可能有着截然不同的影响的活动和特异性PRC2-mediated trimethylation H3K27。

组装,PRC2复合物的组成和生物活性似乎非常复杂,由于潜在的4个核心组件的交互PRC2与几个额外的辅助蛋白41,42。 最近的一项研究表明,PRC2可以与两种组蛋白,即PALI1 / PCL1-3或AEBP2 / JARID2,定义两个互斥的敌对PRC2亚型,分别称为PRC2.1和PRC2.243。 这两个配合物表现出不同H3K27-methylation活动和调节镇压polycomb目标基因的不同43。 这是有可能的,因此,皮科PRC2.1-associated或PRC2.2-associated微分交互速度可能有不同的影响细胞表观遗传机制,改变不同的特异性基因表达特征。 虽然速度亚型的性质与每个PRC2亚型尚未确定,存在四个不同速度亚型可能增加这种表观遗传机制的复杂性和异质性。

Downregulation的CCND2信使rna被报道为显著特征的几个人类肿瘤,包括肺44、乳腺癌45,46和胰腺47肿瘤组织。 这种影响反映在甲基化CCND2基因启动子区域在NAT很少观察到的样本44,45,46,47。 同意这些发现,我们观察甲基化在增加CCND2启动子和减少细胞周期蛋白D2表达野生型Jurkat细胞,而PICOT-deficient Jurkat细胞表现出减少甲基化和细胞周期蛋白的表达增加D2。

目标的CCND2在非小细胞肺癌细胞微mir - 146 - 5 - p、抑制细胞周期进程和细胞增殖48和其他CCND2针对大鹏展翅抑制其他类型的癌细胞的扩散49,50,51。 CCND2的差别似乎,因此,对这些需要某些细胞类型的细胞周期进程和复制,而过度的用小环装饰CCND2的差别会导致过度对这些基因的表达,这可能促进细胞生长在几种类型的人类癌症。

用小环装饰蛋白的表达增加多种癌症,包括霍奇金淋巴瘤11和乳房7、结肠癌12、肺癌12鼓励我们测试是否用小环装饰和CCND2表达之间的负相关,在Jurkat观察T细胞,也存在于人类癌症。 信息获得癌症基因组图谱(TCGA)数据库验证之间的负相关用小环装饰CCND2在八个不同的人类癌症类型。

更重要的是,高表达的用小环装饰和低表达的CCND2与贫穷在五种不同类型的人类癌症病人的存活率,即肺和胰腺腺癌、恶性胶质瘤、乳腺癌和食道癌。 类似的研究结果中观察到一个独立的验证数据集,使用Kaplan-Meir绘图仪,web工具,生存在一个独立的纲要报告差异表达谱从癌症患者(没有显示)。 有趣的是,异常值的存在在不同癌症类型(图。6)表明,额外的机制,除了PICOT-induced trimethylation H3K27的改变CCND2基因启动子,可能会影响这些细胞的细胞周期和增长率。

上面的信息可能意味着高表达的皮科和低表达CCND2有利于转化细胞的生长在选定的组织,而其他或其他因素影响转化细胞的生长在其他组织。

材料和方法

试剂和抗体

鼠单克隆抗体(mab)特定的皮科来自圣克鲁斯生物技术,Inc .(圣克鲁斯,CA)。 鼠标anti-β-actin马伯和正常小鼠免疫球蛋白来自默克密理博(达姆施塔特,德国)。 鼠标anti-Histone H3马伯,anti-Flag马伯和兔anti-hemagglutinin (HA)和anti-RNA聚合酶II (Pol II; Ab26721)多克隆Abs来自Abcam生物科技公司(英国剑桥)。 鼠标anti-Flag马伯Sigma-Aldrich(克隆M2),以色列。 兔子anti-EED多克隆Abs (Ab4469),用于免疫印迹分析,和兔子anti-EED Abs(09 - 774),这是用于ChIP-qPCR化验(09 - 774)来自Abcam和默克密理博,分别。 兔子马伯anti-EZH2、anti-SUZ12 anti-trimethyl组蛋白H3 (H3K27me3赖氨酸27日),anti-cyclin D2和正常兔免疫球蛋白来自细胞信号技术有限公司(丹弗斯,MA)。 辣根过氧化物酶(合)共轭山羊anti-mouse anti-rabbit免疫球蛋白Abs来自Abcam生物技术。 蛋白质G-Sepharose®、快速流(P3296)来自Sigma-Aldrich,以色列。 青蓝3 (Cy3)共轭山羊anti-mouse免疫球蛋白和青蓝5 (Cy5)共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白Abs来自杰克逊ImmunoResearch实验室有限公司。 (西树林、PA)和来自科克加德和佩里实验室(KPL),分别。 DAPI来自Biotium, Inc .(海沃德CA)。 的长篇用小环装饰互补脱氧核糖核酸与人类流感病毒血凝素(在pEF哺乳动物表达载体)标签(HA-PICOT)已经被先前描述1。 的速度2 - 441互补脱氧核糖核酸引入pFLAG-CMV2真核表达载体(FLAG-EED)和模拟质粒(FLAG-CMV迪特尔•亚当博士)的礼物(德国基尔大学)19

制备PICOT-deficient Jurkat T细胞不同等级

用小环装饰shRNA质粒被SuperArray设计和合成生物科学(马里兰州弗雷德里克)和引入一个表达载体(pGeneClip)指导小发夹rna的合成(成分)在哺乳动物细胞聚合酶III启动子的控制下,并含有新霉素抗性基因的选择稳定转染细胞。 我们使用一组四股21个核苷酸序列的人类意识用小环装饰(CCAACATACCCTCAGCTGTAT; CTACCCAGCGCTAATGAACAT; GTGGAAATTCTTCACAAACAT; ACTCCCTCAAGTTTC ATTTGT),加上一个控制炒序列。 有义链是紧随其后的是10-nucleotide垫片(CTTCCTGTCA)和反补的21个核苷酸序列相同。 克隆这些短序列后下游U1启动子的质粒,结果pGeneClip -用小环装饰shrna质粒转染到Jurkat E.6细胞电穿孔使用BioRad基因脉冲发生器。 G418抗性稳定转染子被分离和克隆,他们用小环装饰表达水平是由免疫印迹和存在。

细胞系和文化条件

人类T细胞系(Jurkat克隆E6.1; 写明ATCC®矿- 152TM),PICOT-deficient Jurkat-derived T细胞系(Jurkat.1A Jurkat.2G),一个控制Jurkat细胞系表达混乱用小环装饰质粒(Jurkat.5A),人类急性单核细胞的细胞系(写明ATCC THP1®矿- 202TM),人类T淋巴母细胞细胞系(写明ATCC MOLT-4®crl - 1582TM),u - 937组织细胞的淋巴瘤细胞株(写明ATCC®crl - 1593.2TM)和k - 562人类骨髓性白血病细胞株(写明ATCC®ccl - 243TM)保持在对数生长期完全RPMI (RPMI - 1640补充heat-inactivated 10%胎牛血清(FCS), 2毫米谷酰胺,50个单位/毫升青霉素、50μg /毫升链霉素(所有从生物产业、拜特Haemek以色列),和0.5μMβ-mercaptoethanol(σ))。 COS-7肾脏上皮细胞,来源于一个非洲绿猴和表达猿猴空泡病毒40 (SV40)标签(写明ATCC®crl - 1651TM),一个人类肺癌细胞系(写明ATCC - 549®ccl - 185TM),MDA-MB人类乳腺转移癌细胞系(写明ATCC 453®htb - 131TM),MCF-7人类乳房腺癌细胞系(写明ATCC®HTB-22TM)和hek - 293 t人类胚胎肾细胞,表达SV40的标签,在完成杜尔贝科的修改维护鹰介质(DMEM; 补充10% heat-inactivated FCS 2毫米谷酰胺,50个单位/毫升青霉素、50μg /毫升链霉素和0.5μMβ-mercaptoethanol)。

瞬态细胞转染

COS-7保持在对数生长期细胞都收集的胰岛素治疗,在比起不服药物洗DMEM, resuspended在2×106细胞在5毫升DMEM /毫升10% FCS,培养我们®组织培养瓶(690170年他一一Bio-One)。 电镀后24小时内,贴壁细胞转染与表示DNA(5µg /组)使用表面(裴Polysciences Inc .)的比例3:1(裴:总DNA)和另外两天后在文化分析。

制备的细胞溶解产物

细胞被resuspended裂解缓冲(25毫米Tris-HCl, pH值7.5,150毫米氯化钠,EDTA 5毫米,1毫米Na3.签证官450 mM氟化钠10µg /毫升每个亮抑酶肽和抑肽酶,2毫米AEBSF和1% Triton x - 100)其次是30分钟在冰上孵化,在13000转离心30分钟在4°C。 相同体积的2×十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲被添加到完整的细胞溶解产物(水控制法)其次是涡流,煮5分钟,样例分馏,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(页面)。

电泳和免疫印迹

样本包含完整的细胞溶解产物、染色质溶解产物或Ab免疫沉淀反应是通过在10 - 12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳来解决使用Bio-Rad Mini-PROTEAN II细胞。 在硝化纤维膜凝胶蛋白质是electroblotted (Schleicher和Schuell)在100 V 1 h,使用BioRad迷你Trans-Blot转移细胞。 1 h后膜阻止3% BSA在TBS 37°C,表示主要的膜被孵化Abs其次是广泛的TBS洗液和孵化HRP-conjugated山羊anti-mouse或山羊anti-rabbit免疫球蛋白Abs。免疫反应性的蛋白质乐队可视化使用增强化学发光(ECL)检测系统自动射线照相术紧随其后。

染色质免疫沉淀反应和实时qPCR

染色质免疫沉淀反应(芯片)是根据出版协议执行52,很少有修改。 细胞用1%甲醛交联(Sigma-Aldrich,以色列)10分钟在室温下,在寒冷的PBS洗两次,然后再悬浮的细胞溶解1毫升裂解缓冲(20毫米Tris-HCl, pH值8.0,85毫米氯化钾,蛋白酶抑制剂鸡尾酒NP-40 0.5%和1%)10分钟在冰上。 核离心获得的颗粒(5分钟5000转4°C)在200年resuspendedμl细胞核裂解缓冲(50 mM Tris-HCl, pH值8.0,10毫米EDTA, 1% SDS和1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒)10分钟在冰上,和样品剪30年代的5轮6周期/ 30年代在大功率场合的Bioruptor超声发生器(Diagenode),产生输入DNA纯度片段大小的200 - 1000个基点。

染色质片段的尺寸确定经验通过琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色。 样本纺(20分钟13000转4°C)和可溶性染色质分数收集,稀释(1:5)稀释缓冲(Triton x - 100年0.01% SDS, 1.1%, 1.1毫米EDTA, 20毫米Tris-HCl, pH值8.0,和167毫米氯化钠)和孵化蛋白质G-sepharose珠子的事先批准的步骤。 事先批准溶解产物与bead-mobilized特定Ab或特异性的同形像孵化控制Ab和保存在一个旋转在4°C。 第二天,珠子按顺序用buffer-1洗净,与buffer-4 buffer-2, buffer-3,两次。

缓冲区使用列出如下:

SDS Buffer-1: 0.1%, 1% Triton x - 100, 2毫米EDTA, 20毫米Tris-Cl, pH值8.0,150毫米在ddH氯化钠2O

SDS Buffer-2: 0.1%, 1% Triton x - 100, 2毫米EDTA, 20毫米Tris-Cl, pH值8.0,500毫米在ddH氯化钠2O

NP40 Buffer-3: 0.25氯化锂,1%,1%脱氧胆酸盐,1毫米EDTA, 20毫米Tris-Cl,在ddH pH值8.02O

8.0 Tris-HCl Buffer-4: 10毫米,1毫米EDTA

沉淀蛋白质的DNA片段被筛选了G琼脂糖珠使用NaHCO洗脱缓冲(1% SDS, 50毫米3.140毫米氯化钠10毫米Tris-HCl, pH值8.0,1毫米EDTA)。 随后,筛选了DNA处理核糖核酸酶(0.2µg /µl) 37°C 1 h,其次是孵化与蛋白酶K在65°C 5 h。 DNA使用PCR清理工具包(Macherey被净化-内格尔装备实时qPCR(40)和放大周期(循环阶段:15 95°C / 60年代60°C; 融化曲线阶段:15 95°C / 60年代60°C / 30 95°C / 60年代60°C))与引物具体表示目标基因。 正向和反向引物序列中使用rt - pcr实验如下:

CCND2ChIP-qPCR正向引物:TAGGATCCGTTTTGAAGAAGCC,扭转CATTCTGTAGGTGTAGCACGCC53;HOXA2ChIP-qPCR正向引物:AGGAAAGATTTTGGTTGGGAAG,扭转AAAAAGAGGGAAAGGGACAGAC54,ATF3ChIP-qPCR正向引物:CTACAGTCACCTTGCGGTGC,扭转GAGGCTGGGAAGGGTAATGG55;cdc 6ChIP-qPCR正向引物:GATTCCCTCCCCCGTTCA,反向引物:CAATGAGAGAGCCCCAAGTCTT53; GAPDH ChIP-qPCR正向引物:TACTAGCGGTTTTACGGG CG,扭转TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA。 商业的引物α-Satellite从细胞信号(# 4486)。

芯片qPCR量化进行了输入染色质的百分比。 计算相对浓缩获得的DNA数量除以使用特定的Ab,通过获得的DNA量使用同形像控制,有针对性的引物54

%ofInput=100×2(adjustedinputCt(IP)); 调整输入=原始输入Ct−log2稀释系数。

平均结果从两个独立的芯片实验,分析了由三个独立的pcr (N= 6井)。

蛋白质染色质免疫沉淀反应

蛋白质芯片是根据协议进行发表56。 细胞染色质溶解产物和交联准备中描述“染色质免疫沉淀反应和实时qPCR”部分。 溶性染色质分数被稀释(1:5)稀释缓冲(0.01% SDS,特里同X 100 1.1%, 1.1毫米EDTA, 20毫米Tris-HCl, pH值8,167毫米氯化钠)和孵化蛋白质G-sepharose珠子的事先批准的步骤。 事先批准溶解产物与bead-mobilized特定或非特异性同形像孵化控制Ab和保存在一个旋转在4°C。 第二天,珠子是洗一次使用buffer-1 buffer-2, buffer-3 buffer-4,两次。 最后洗后,180µl样品缓冲被添加到颗粒和样本保持在30分钟95°C。 样本然后离心机和上层清液(20µl)被免疫印迹通过sds - page和分析来解决。

细胞染色和共焦显微镜

细胞(1.5×106)被播种在poly-L-lysine-coated 8日µ-slide (ibidi有限公司)和沉积在幻灯片在1200转离心5分钟。 细胞被固定在4%多聚甲醛/ PBS在室温下15分钟,permeabilized与PBS / 0.2% Triton x - 100 5分钟和孵化鼠标anti-PICOT马伯,兔多克隆Abs anti-EED阻断缓冲区(PBS包含1% BSA)在室温下1 h。 在PBS三洗后,这些细胞被孵化与Cy3-conjugated山羊anti-mouse Ig Abs (1:50 0), Cy5-conjugated山羊anti-rabbit Ig Abs(1:50 0)和DAPI(1µg /毫升)在PBS 1 h在黑暗中在室温下。 共焦显微镜分析使用奥林巴斯FluoView®FV1000激光扫描共焦显微镜。

RNA提取和定量PCR

定量PCR分析,RNA提取Jurkat Jurkat-derived不同等级使用RNA隔离设备(YRB100, RBC生物科学公司)根据制造商的指示。 互补脱氧核糖核酸的合成,1µg RNA与Bio-RT反向转录(RT)合成第一链cDNA工具包使用六聚体随机引物(生物实验室)。 反应进行了60分钟在37°C和终止孵化在75°C,持续15分钟。 实时(RT) pcr进行7500年ABI棱镜™(应用生物系统公司™,促进城市,CA),使用绝对qPCR SYBR绿色装备(ABgene Inc .,朴茨茅斯,NH)根据制造商的指示。 rt - pcr反应包含50 ng的互补产品和500海里的每个引物。 每个基因引物设计与研究重叠外显子边界,使用ncbi blast软件,和来自Sigma-Aldrich,以色列。 所有的引物设计< 150个基点,以确保放大效率高。 正向和反向引物序列用于rt - pcr扩增如下:CCND2正向引物:GGACATCCAACCCTACATGC,反向CGCACTTCTGTTCCTCACAG;SDHA正向引物:ACAACTGGAGGTGGCATTTCTA,扭转TAATTTTCTAGCTCGACCACGG。

所有实验进行了一式三份,以确保再现性。 循环条件包括聚合酶激活步骤10分钟在95°C,紧随其后的是40 95°C的周期为60年代15秒和60°C。 PCR扩增后,证实了PCR的特异性PCR产物的熔点测定。 扩增效率都验证了连续稀释标准曲线拟合。 相对量化是决定的ΔΔCt方法57标准化对琥珀酸脱氢酶(SDHA),作为参考基因和表达为褶皱的变化。

肿瘤组织和邻近正常组织的数据集合

癌症患者的临床结果和RNA表达数据从邻近肿瘤组织和正常组织被下载从癌症基因组图谱(TCGA)数据门户在印度商学院癌症基因组学云(https://isb-cgc.appspot.com/data)582018年7月15日。 对基因表达数据中,我们选择了三级RNA-Seq-V0数据(Illumina公司GA或HiSeq测序平台)。 RNA-Seq表达水平read-counts规范化,使用FPKM值(每千碱基片段的记录每百万映射读取),提供的下载文件。 额外的信息关于数据和分析方法在处理TCGA的数据可以发现https://docs.gdc.cancer.gov/Data/Bioinformatics_Pipelines/Expression_mRNA_Pipeline

患者的生存分析

对于每一个基因进行了分析,根据高或低表达患者分类的基因。 分类是由计算平均减少点使用MaxStat函数(这是基于最大限度地选择等级统计)59可用的R包survminer (https://cran.rstudio.com/web/packages/survminer/index.html)。 策划生存的低和高表达患者团体kaplan meier估计量60是使用。

PICOT-CCND2相关分析

用小环装饰CCND2信使rna表达水平相比,固体人类癌症TCGA使用数据集和皮尔逊相关性。 离群值样本总数被确定使用分位数,和上下0.1样本分位数被从实际的分析。 分析对所有潜在的皮科和CCND2表达之间的相关性,我们搜查了基因表达综合(GEO)存储库和寻找所有数据系列。 所选择的数据集(GSE62156)有64个样本,这是下载并使用R脚本处理受GEO2R选项。 探头设置207506 _at用于皮科和207506 _s_at用于CCND2。

统计评估

统计评估样本的比较进行了使用Prism5软件(美国拉霍亚/ CA GraphPad)。 统计测试各自的图所示使用传说。

TCGA统计评估数据集进行了使用R,版本3.4.1 (http://www.r-project.org)。 患者的临床结果数据进行了分析使用生存包装和策划作为kaplan meier生存曲线。

除非特别说明,p值小于0.05被认为是重要的。 一个精确的p值计算适用的地方。


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