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白细胞介素-10和转化生长因子-β对人固有淋巴细胞亚群的差异调控

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发表时间:2019-10-08 13:31作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

白细胞介素-10和转化生长因子-β对人固有淋巴细胞亚群的差异调控

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摘要

应用多参数流式细胞术可以检测到人固有淋巴细胞(ILC)在循环中相对较低的频率。尽管循环中的ILCs频率很低,体外实验表明,这些ILCs在激活后每细胞释放大量的标志性ILC细胞因子。为了确定活化的ILC细胞因子的产生是如何调节的,在免疫调节细胞因子IL-10和TGF-β存在或不存在的情况下,ILC亚群被激活。外周血白细胞介素-10受体(IL-10Rα)的表达及IL-10Rα和TGF-βR1在所有ILC细胞中的表达。TGF-β可抑制IFN-β的产生,而不能抑制IL-10的产生.有趣的是,IL-10刺激的ILC2s能显著降低IL-5和IL-13的细胞因子生成,而TGF-β对IL-2细胞因子的产生无明显影响。体外活化的ILC 1和IL 2亚群也是免疫调节细胞因子IL-10的来源,增加了ILC介导的免疫细胞调节的潜力。这些发现证明了免疫调节细胞因子IL-10和TGF-β对活化的IL 1和IL 2细胞的不同作用。体外.

导言

在健康人的组织和外周血中都可以发现先天淋巴样细胞(ILCs),但其频率和组成的变化与多种人类疾病有关。1..人类ILC群体包括细胞毒性ILCs(NK细胞)、辅助ILCs和新近发现的调节性ILCs(ILCreg)。辅助性ILCs由3个典型的不同亚群组成:ILC1s(LIN-CD 45+CD 127+cKit-NKp 44−)、ILC2s(LIN-CD 45+CD 127+CRTH 2+)和ILC 3(LIN-CD 45+CD 127+cKit+NKp 44−/+),每组细胞通过产生IFN-γ(ILC1s)、IL-5和IL-13(ILC2s)和IL-17A或IL-22(ILC3s)对细胞因子活化反应。人ILCreg表现为肠组织中的Lin-CD 45+CD 127+IL-10+细胞,表达一种独特的细胞因子基因,包括IL-10和TGF-β1。2.

虽然辅助性白细胞介素C亚型存在于可变频率,但由于它们产生了特定的细胞因子,即干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-13和白细胞介素-17A,因此参与了某些免疫应答。ILC2s被认为是寄生虫清除的媒介。3,4通过白细胞介素-5和白细胞介素-13的产生,以及在过敏性疾病范围内白细胞介素2的扩增,有助于解释组织嗜酸性粒细胞增多的原因。5,粘液产量增加6和气道高反应性7..产生IL-22的ILC 3在促进肠道组织修复和重塑的同时发挥抗菌作用。8,9..这些白细胞介素3在银屑病和类风湿关节炎的发病机制中起着重要作用。10..ILC1s在克罗恩病患者的肠道组织中有很大的扩展11并已证明通过产生干扰素-γ而导致肥胖相关的病理改变,如小鼠胰岛素抵抗。12..然而,由于其它产生γ的细胞占优势,ILC1s在疾病病理中的作用还没有得到很好的界定。13,14,15.

免疫应答的调节是一个多因素的过程,通过细胞受体介导免疫检查点调节器的信号传递。16例如程序细胞死亡配体1(pd-l1)17,18、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)以及白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β(TGF-)受体。白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β的释放是调节性T细胞的标志。19,B细胞20,髓系细胞21和固有淋巴样细胞2..虽然调节网络对于控制先天细胞和适应性细胞引起的炎症是至关重要的,但对ILCs的免疫调节却知之甚少。一种已知的调节器pd-1,在所有小鼠ILC亚群上都有表达。22,是调节小鼠KLRG 1+ILC2s的关键,也是调节人ILC2s(表达pd-1的人ILC的唯一子集)的关键。23)。诱导Tregs通过icos/icos配体的相互作用以及IL-10和TGF-β的作用,调节人白细胞介素2(IL-10)在人源化小鼠模型中的效应功能。24..然而,细胞因子的产生如何在人类白细胞介素中被调控还没有完全阐明。

本研究首先试图了解循环中ILCs的组成,并对活化的人ILC的细胞因子谱进行表征。体外并了解调节ILC效应功能的机制。首次采用全血流式细胞术检测ILC细胞在稳态状态下的频率和组成,并对其进行微扰。采用同样的流式细胞术方法对不同的ILC亚群进行分类,并检查它们对ILC子集特异性激活因子的反应。一旦证实ILC1s(ILC2s和ILC3s的数目较少)对人全血成分有很大的富集作用,并且这些亚组(ILC1s和ILC2s)可以被激活产生“标志性”细胞因子,我们就能够证明ILC1s和ILC2s对细胞因子的产生有不同程度的调节作用,并由此揭示了一种新的细胞调节机制。

材料和方法

健康成人志愿者

我们从美国国立卫生研究院临床中心输血医学部采集了89名健康成人志愿者的全血样本。已为58/89名成年志愿人员提供了身份不明的捐助方信息,并在表中提供。1..在全血CD 45+细胞频率为0.09%的情况下,根据5%的期望CV值,对每10,000份细胞中含有>1份ILC的全血样本进行数据分析。

表1健康成人志愿者ILC亚群全血分析的人口学特征。

道德声明

本研究使用的血液产品(全血、布菲大衣和洗脱淋巴细胞)是根据美国国立卫生研究院(NIH;IRB99-CC-0168)输血医学部的机构审查委员会(IRB)批准的协议从健康的成年志愿者中收集的。所有志愿者都给予了知情的书面同意。此外,本研究中包括的所有方法都是按照相关准则和条例进行的。

流式细胞术

全血(2-5mL)稀释在RPMI 1640(热Fisher)中,加入2%L-谷氨酰胺和0.1uM的Bregeldin A/monensin(MilliporeSigma)在37°C下孵育4小时,全血进行全血表型鉴定,稀释后的全血用CD 45(HI30)、CD 117(104 D2)、CD 127(EBioRDR 5)、CRTH2(BM 16)和谱系鸡尾酒(LIN)在室温下染色30 min(见表)。2以LIN−CD 45+CD 127+,ILC1s为CD 117−CRTH 2−,ILC2s为CRTH 2+CD 117−/+,ILC 3为CRTH 2−CD 117+。用NKP 44(44.189)抗体检测全血中的ILC 3亚型,确定其为CRTH 2−CD 117+NKp 44−,IL C3b为CRTH 2−CD 117+NKp 44+。采用全血染色,检测IL-10 Rα(3F9;BioLegend)和IL-20 Rα(173714;R&D系统)在白细胞介素-14+(61D3)单核细胞表面的表达。用LSRFortessa™流式细胞仪(BD生物科学)采集数据,用Flow Jo10.4.0软件(TreeStar)进行分析。

表2流式细胞术ILC染色板。

体外先天性淋巴样细胞刺激

体外实验使用从布菲外套中分离出来的细胞或20-57岁男性和女性的淋洗淋巴细胞,中间年龄为41岁。首先用淋巴细胞分离培养基(LSM;MP生物制剂)分离中性粒细胞,然后根据需要使用ACK裂解缓冲液(热Fisher)用标准协议进行红细胞裂解。25..应用流式细胞术对上述表型的总ILCs、ILC1s、ILC2s和ILC3s进行流式细胞术染色和分类,并使用FACSAria™Ⅱ细胞分类器(BD生物科学)进行分类。ILC 1的典型纯度>95%,ILC 2>95%,ILC 3>85%。分拣后存活率始终>95%。ILC总子集或单个子集(2×10)3)在96孔圆形底板中,加入含1%热灭活人AB血清、10U/mL IL-2或Problin(PeproTech或Prometheus实验室)和50 ng/mL rl-7(PeproTech)的X-Vivo™15培养基(LONZA)中培养。ILC subsets were stimulated with ILC activating cytokines:50 ng/mL of IL-12(R&Dsystems)and IL-15(PeproTech)for ILC1 activation,50 ng/mL of IL-25(PeproTech)and IL-33(PeproTech)for ILC2 activation,50 ng/mL of IL-1βand IL-23(R&Dsystems)for ILC3 activation,or with 125/1,250 pg/uL of PMA/ionomycin(MilliporeSigma)at 37°C.For defining any immunoregulatory roles,ILCs were stimulated in the presence or absence of 50 ng/mL of IL-10 or TGF-β(PeproTech).

细胞因子测定

在第2、4和/或5天收集培养上清液,并使用MILLIPLEX进行评估。地图人Th17磁珠面板(MilliporterSigma)定制10-分析:IL-4,−5,−6,−9,−10,−13,−17A,−22,IFN-γ和肿瘤坏死因子-α)。化验是按照制造商的指示进行的。使用Luminex仪器Bio-Plex MAGPIX多重阅读器(Bio-RAD)进行样本检测,然后使用以下软件进行数据采集和管理:xPONENT4.2系统、Bio-Plex Manager™MP和Bio-Plex Manager™6.1。

RNA提取与qPCR

用RNeaseMini试剂盒(CHIAN)将从健康成人志愿者中分离出来的9例和7例分离的ILCs保存在−80°C的RLT缓冲液中。用QScriptcDNA重排(Quantabio)技术(Quantabio)提取RNA(<2μg)。然后,根据制造商的指示,使用Taqman快速高级主混合芯片与TaqMan的IL-10Rα、TGF-βRI、IL-20Rα和内源性对照18s或GAPDH进行复合。采用VIIa™7系统(应用生物系统)进行热循环。每个基因和内源性对照的阈值(CT)测定相对转录本水平(1/ΔCT),其中ΔCT是靶基因的CT与每个供体对应的内源性对照之间的差异。

统计分析

所有统计分析均采用GraphPad Prism(v.7.0c)进行。除非另有说明,几何平均(GM)被用来衡量中心趋势。用Mann Whitney检验对各组进行比较,用Wilcosin检验对配对样本进行分析。

结果

健康志愿者外周血ILC亚群的频率和分布

为了解白细胞介素C(ILC)在正常人中的分布和频率,从健康成人志愿者(n=89)中抽取全血,用表面标记染色法对外周血中的ILC亚群进行定量分析。1A..首先对ILC总细胞(CD 45+LIN-CD 127+)进行门控,将其分为ILC1s(CD 45+LIN−CD 127+cKt-NKp 44−)、ILC2s(CD 45+LIN-CD 127+CRTH 2+)和ILC 3(CD 45+LIN−CD 127+cKit+NKp 44−/+)。供体ILC定量显示96%(85/89供体)ILC数可检出。循环中发现的CD 45+细胞总数为246.7(范围1~14,599;图1)。1B)一个数字,它的几何平均(GM)频率为0.09%(范围0到1.46%),总CD 45+细胞(如图所示。1C)。在有数据可查的捐献者分组(n=58)中,也对性别、种族和年龄等供体变量的影响进行了研究。外周血中每百万CD 45+细胞总数或ILC亚群的频率在很大程度上不受供者的性别、种族或年龄的影响(图)沙一)。然而,供体年龄与循环中ILC2s的频率呈负相关(图)S1C)。因此,ILCs在健康的成年志愿者的循环中被检测到,尽管频率很低。

图1
figure1

健康志愿者外周血ILC亚群的频率和分布。(A总ILCs(CD 45+LIN-CD 127+)、ILC1s(CD 45+LIN-CD 127+cKit-NKp 44-)、ILC2s(CD 45+LIN-CD 127+CRTH 2+)和ILC 3(CD 45+LIN-CD 127+cKit+NKp 44−/+)的门控策略。面板代表多个独立实验(n=89)。(B)每百万CD 45+细胞中ILCs总数的频率和(C)每百万CD 45+细胞中ILCs总数所占的百分比。每个点代表单个捐献者(n=89),水平线是GM。使用ILC表面标记来量化(D)每百万个CD 45+细胞的ILC 1(蓝点)、ILC 2(橙色点)和ILC 3(灰度点)的频率。E)69例供者ILC亚群占ILC细胞总数的百分比。(FIL C3a(CD 45+LIN-CD 127+cKit+NKp 44-)和IL C3b(CD 45+LIN-CD 127+cKit+NKp 44+)。(G)按个体捐献者划分的单个ILC子集(n=69)。

鉴于国际化学品在流通中的稀缺性,在分析过程中至少使用了每10 000人中的10人,以建立更大的信心。69/89例(77.5%)供者每10,000个获得细胞中有10例以上,其余供者被排除在ILC子集分析之外。在69个可评估的供者中,循环中每百万CD 45+细胞的ILC亚群的GM为141,ILC2s为23,ILC 3为6(图)。1D)。ILC1s、ILC2s和ILC3s的GM频率分别为79.6%、15.0%和5.4%。1E)。在供体的一个亚组(n=31)中还分析了ILC 3亚群。用NKp 44的表达来表达ILC3a(NKp 44-)和ILC3b(NKp 44+)。循环中的ILC3s主要是ILC3s,而不是ILC3b(图1)。1F)。总的来说,ILC在健康成人志愿者中的分布变化很大(图1)。1g然而,这些数据表明,虽然在血液中检测到所有ILC组,但ILC1s是循环中最丰富的ILC组。

ILC 1和ILC2s在激活时会产生大量的标志性细胞因子。体外,而ILC 3在激活时会产生非标志性的细胞因子。

从健康成年献血者的血液中分离出ILCs和ILC总亚群,并对其进行刺激。体外测定不同细胞类型在不同条件下的细胞因子电位。IL-12/IL-15、IL-25/IL-33、IL-1β/IL-23、IL-2/IL-2、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17 A、IL-22、IFN-γ和TNF-α。除IL-13外,单独培养的ILCs(含IL-2和IL-7)培养2天和4天后,产生的细胞因子几乎不分泌细胞因子(如图)。S2)。在刺激细胞因子后,细胞因子水平在第4天略高于2天后(表)3)。然而,在不同的ILC激活条件下,ILC标记的细胞因子水平并没有显著增加。pma/ionomycin刺激的ILCs总数使干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-17A的含量增加了2倍以上(见表)。3)。总之,这些发现表明,在不同的ILC激活条件下刺激的总ILCs不能产生与激活的ILCs相关的健壮的和子集特异性的细胞因子反应。

表3体外刺激总ILCs。

与国际法委员会总数形成对比的是,体外对分类的ILC亚群的分析显示,在不同的ILC激活条件下,ILC的特征性细胞因子水平较高。体外IL-12/IL-15刺激ILC1s可使IFN-γ的产量增加223倍,与不受刺激的ILC1s相比,TNF-α的产量增加6倍(图1)。2A)。IL-25/IL-33刺激的IL-2与不受刺激培养的IL-2相比,IL-5和IL-13分别增加了200倍和46倍。此外,刺激白细胞介素2还可使肿瘤坏死因子-α增加4倍。IL-1β/IL-23刺激ILC 3后,IL-3特异性细胞因子IL-17A或IL-22的表达无统计学意义(P>0.0 5),但这两种细胞因子与不受刺激的IL C 3相比,分别增加了7倍和2倍。有趣的是,与不受刺激的ILC 3相比,刺激ILC 3可使IL C 1标志细胞因子IFN-γ(311倍)、TNF-α(23倍)和IL 2标志细胞因子IL-13(94倍)显著增加(图1)。2A、C)。综合来看,这些发现表明体外ILC1s和ILC2s的刺激主要导致其标志性细胞因子的产生,而ILC3s只产生少量的标志性细胞因子,但IFN-γ、TNF-α和IL-13的含量显著增加。

图2
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ILC 1和ILC2s在激活时会产生大量的标志性细胞因子。体外,而ILC 3在激活时会产生非标志性的细胞因子。A.IL-γ、TNF-α、IL-5、IL-13、IL-17A和IL-22在ILC 1条件(IL-12/IL-15)(上排)、IL-15/IL-33(中间行)、IL-3条件(下排)或未受刺激(介质-封闭)培养下产生的水平。数据来源于多个实验,ILC 1为15例,ILC 2为19例,ILC 3组为8例。*p<0.001.0 1,*p<0.0 1,*p<0.0 5;将A组供者(分别为10、14和4例ILC1s、ILC2s和ILC3s)中的ILC亚群分类,分别在培养基、ILC激活细胞因子或PMA/离子霉素中培养5天。检测IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17 A、IL-22、IFN-γ和TNF-α的产生.(B板)未受刺激分类的ILC 1(黑条)、ILC 2(白条)和ILC 3(灰条)的几何平均细胞因子生成(PG/ml)。经ILC-子集特异性ILC激活细胞因子(C)激活后,分化的ILC 1(左面板)、ILC 3(右面板)和PMA/离子霉素刺激(D)后,细胞因子产生的GM增加一倍。

对未受刺激培养的ILC细胞因子谱的进一步分析显示,ILC在培养过程中产生的细胞因子很少或没有可测量的细胞因子。IL-13的产生(GM=2,230 pg/mL)是培养5d后检测到的唯一细胞因子。2B)。刺激ILC亚群及其各自激活的细胞因子,导致大量标志性细胞因子的增加,但以非标志性细胞因子为主的ILC 3除外(图1)。2C)。对单个供者的分析显示,受细胞因子刺激的ILC亚群在供者之间几乎没有变化(图)S3A)或PMA/离聚物霉素(图)S3B)。此外,用PMA/离聚物霉素刺激ILC细胞亚群,产生广泛的细胞因子活化谱,并对ILC特异性细胞因子进行了富集(图一)。二维空间).

ILC 1和ILC2s在激活时是免疫调节细胞因子IL-10的来源。体外

细胞因子活化后的ILC亚群分析显示,受刺激的ILC1s和ILC2s上清液中的免疫调节细胞因子IL-10的产生明显增加(如图1所示)。3)。与不受刺激培养的ILC亚群相比,刺激可使ILC1s产生IL-10的量增加13倍(p<0.001.0 1),ILC2s的产量增加约6倍(p<0.0 5)。ILC 3也有类似但不显著的6倍增加。此外,与未受刺激的细胞相比,刺激白细胞介素-10(IL-10)的产量也有类似的增加。培养4天后,IL-25/IL-33或IL-1β/IL-23刺激的IL-10细胞因子水平增加2倍或更高。3)。这些发现表明,所有ILC亚群都是刺激后产生IL-10的潜在来源.

图3
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ILC 1和ILC2s在激活时是免疫调节细胞因子IL-10的来源。体外..在50 ng/mL ILC激活细胞因子(IL-12/IL-15、IL 2/25/IL-33和IL-3亚群IL-1β/IL-23)的作用下,对2,000例已分类的ILC细胞进行刺激。培养上清液分别在培养基中单独或在刺激后从ILC亚群中提取,作为多重Luminex分析的一部分,检测免疫调节细胞因子IL-10。数据代表多项实验,IL 1为15例,ILC 2为19例,IL 3组为8例。用Wilcoxon检验进行配对比较,显着性水平分别为:*p<0.001,*p<0.0 5,ns,无显着性差异(P>0.0 5)。

IL-10对活化的ILC2s细胞因子的产生有不同的调节作用,尽管所有ILC亚群都表达了IL-10R。

为了确定ILCs受外源性IL-10调节的能力,首先用qPCR方法检测IL-10R的表达。分类后的ILC亚群和PBMC中IL-10 Rα的表达均为阳性(图1)。4A)。ILC的所有亚群也表达IL-10Rα蛋白(图1)。4B)流式细胞仪检测。而IL-10 Rα表面表达阳性细胞的GM百分比约为20%,明显低于CD 14+单核细胞的阳性率(图1)。4B)。IL-10Rα表面表达阳性细胞百分比以ILC2s最高,而ILC1s和ILC3s阳性率相近。尽管IL-10 Rα阳性率不同,单核细胞和IL-10 Rα表达的GM荧光强度分别为6 5 4和6 2 9。4C).

图4
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IL-10差异调节活化的ILC2s细胞因子的产生,尽管所有ILC亚群都表达IL-10R。(A)从健康志愿者中分离出ILC(n=9)和PBMC(n=7),用qPCR方法检测IL-10RmRNA的表达。数据显示为三个独立实验的组合。(B、C用流式细胞仪检测10例健康志愿者全血中白细胞介素-10R(IL-10R)在循环单核细胞及白细胞介素C(ILC)亚群中的表达。B)表面表达和(C)每个细胞的强度用几何平均荧光强度(几何MFI)来评估。(D、EIL-1(n=13)和IL 2(n=10-11)分别从健康供体中分离,在2,000细胞/孔中用激活细胞因子(IL-12/IL-15,IL-1和IL-25/IL-33)刺激5d。培养上清液经鉴定为:D)国际法委员会1和(E)IL 2标记的细胞因子。用Wilcoxon检验对刺激和刺激+IL-10条件进行配对比较,结果表明:*p<0.0001.0 5,*p<0.0 5,ns,无显着性差异(P>0.0 5)。

IL-1和IL 2细胞在IL-10存在或不存在的情况下,分别用各自激活的细胞因子刺激ILC 1和IL 2,以确定免疫调节细胞因子对ILC激活的影响。IL-10的加入对IL-1特异性细胞因子IFN-γ和TNF-α的产生无明显影响(图1)。4D)。但IL-10激活后,IL-2标记细胞因子IL-5(p<0.0001.0 5)和IL-13(p<0.0 5)的产生受到明显抑制。4E)。这些数据表明,虽然所有ILC亚群都表达IL-10Rα,但IL-10选择性地调节IL 2细胞因子的产生,对IL 1细胞因子的产生没有影响。

对额外免疫调节家族成员的检查扩大到包括IL-20细胞因子家族,这些细胞因子家族也是IL-10超家族的成员。采用qPCR和流式细胞术检测多个IL-20家族成员共有的IL-20R受体α在所有ILC亚群中的表达。IL-20Rα基因表达(图)S4A)在白细胞介素-20细胞亚群中检测不到,与外周血单个核细胞相比,循环中IL-20 Rα阳性细胞数明显减少(图)。S4B)。IL-20 Rα的几何mfi在白细胞上也显著低于pbc(图1)。S4C).

hcl 1和IL 2的活性也受到tf-β的不同调节。

除IL-10外,还观察了TGF-β对IL 1和IL 2活化的调节作用。采用实时定量聚合酶链反应(PCR)方法检测正常人外周血单个核细胞和ILC细胞中TGF-βR1mRNA的表达。所有ILC细胞均表达转化生长因子-βR1mRNA,表达水平与外周血单个核细胞相似(图1)。5A). 体外在转化生长因子-β存在下刺激ILC1s可使ILC 1特异性细胞因子IFN-γ明显减少,但对TNF-α无明显影响。5B)。而TGF-β刺激ILC 2对ILC 2标志性细胞因子的产生无明显影响(图二)。5C)。这些数据表明,与IL-10的结果形成鲜明对比的是,TGF-β调节了IL-1细胞因子的产生,但未调控IL-2的产生。体外激活(图1.5C).

图5
figure5

TGF-β对IL 1和IL 2的活性也有不同程度的调节。(A)从健康志愿者中分离出ILC亚群(n=9)和PBMC(n=7),用qPCR方法检测TGF-βRI的表达。活化IL 1(n=10)和活化IL 2(n=7)在50 ng/mL的转化生长因子-β存在或不存在时,在2,000细胞/孔中刺激5d。培养上清液分析ILC标记细胞因子的产生。BIFN-γ和TNF-α用于ILC1s和(CILC-2的IL-5和IL-13。用Wilcoxon检验对刺激和刺激+TGF-β条件进行配对比较,结果表明:*p<0.001,ns无显着性差异。

讨论

对健康的北美成人志愿者循环ILC人群的频率和分布进行的分析证实,在较大的一组患者中,ILC的频率极低,平均每百万白细胞中有344个ILC(按CD 45阳性率定义)。ILC在外周血中的分布显示ILC1s丰富,ILC2s和ILC3s所占比例较小。体外刺激外周血中已分类的ILC亚群,产生典型反应:活化ILC1s产生IFN-γ和TNF-α,活化IL-2产生IL-5和IL-13。令人惊讶的是,体外ILC 3的刺激导致非标志性细胞因子的大量产生。本研究还发现循环中ILC表达IL-10和TGF-β受体.体外在TGF-β存在下刺激ILC1s对IFN-γ有抑制作用,而IL-10对IFN-γ无抑制作用。相反,体外IL-10的存在显著抑制了IL-5和IL-13的产生,但不能抑制IL-13的产生。这些发现表明,ILCs被激活的细胞因子刺激时,在健康志愿者的循环中被发现。体外产生大量的细胞因子,这些细胞因子可以被免疫调节细胞因子IL-10和转化生长因子-β差异调节。

对正常人循环中ILC亚群的频率和组成的表征显示,在循环中发现的ILC总数和ILC亚群的数目都存在供体变异,但也显示了ILC亚群的分布情况。虽然严重的联合免疫缺陷(SCID)患者中已经描述了人白细胞介素-1(ILCs)的缺乏。26在我们的研究队列中,有一小部分健康人没有可检测到的白细胞。有趣的是,捐献者变量,如性别、年龄和种族,在很大程度上不影响被检查的ILC总数或单个ILC亚群的频率。尽管如此,KLRg1-ILC2s在育龄小鼠中的性别偏见已经被证明,在这些细胞中,雌性小鼠中有更多的细胞,但在雄性小鼠中几乎没有。27,这似乎不是人类的情况。本研究证实了ILC 3在健康成人循环中的分布。先前对外周血中ILC3a和ILC3b人群的分析显示,健康人中没有ILC3b;然而,在银屑病患者的循环中检测到了ILC3b。28以及异基因造血干细胞移植后29..在检查ILC群体时,必须考虑到两种ILC子集的定量都会受到ILC组织特异性的影响,从而导致不同的表面标记表达。30以及宿主的炎症状态,导致ILC迁移或居住的变化。31,32,33.

体外对单个ILC亚群的刺激使人们更好地理解了从外周血中分离出来的人ILC的功能能力。当分选ILCs与IL-2和IL-7共同培养以促进存活和增殖时,ILCs总数和单个ILC亚群产生的细胞因子最少。缺乏自发细胞因子的产生表明,ILC在外周血中是相当安静的性质。在不同的ILC激活条件下或用广泛的激活剂(如PMA/离子霉素)刺激ILCs的结果表明,从外周血中分离出的ILCs能够对特定的刺激反应,也能对PMA/离子霉素的激活产生反应。然而,在激活ILC激活细胞因子后释放的标志性细胞因子的数量相当小(表)。3)。在适当的刺激下,总ILCs产生一些但不是全部的标志性细胞因子的能力表明,ILC的组成或额外的细胞因子的产生,特别是那些具有调节作用的细胞因子的产生,可能会对ILC的累积细胞因子产生很大的影响。

对ILC总制剂的检查突出了检查单个分类ILC种群的细胞因子能力的重要性。体外对ILC1s和ILC2s的刺激确实产生了大量的标志性细胞因子,正如先前观察到的那样。34..一种细胞因子检测的多分析方法不仅用于检测标志性细胞因子,而且还用于鉴定激活后ILCs分泌的其他细胞因子。通过对扁桃体组织中单个细胞CD 127+ILCs的转录分析,揭示了人ILC中存在的异质性。35..本研究表明,ILC1s和ILC2s分别与其激活的细胞因子共同激活,产生大量的标志性细胞因子。PMA/离子霉素对ILC1s和ILC2s的刺激显示出更广泛的分泌细胞因子,显示了单个ILC亚群产生多种细胞因子的能力。此外,PMA/离子霉素刺激后,细胞因子的分泌量比单纯细胞因子激活时的分泌量更大(见图)。2C,D).

活化后培养上清液中IL-10的检测表明IL-1-和IL 2-衍生的IL-10可能进一步减弱ILC的激活。ILCs产生的IL-10以前曾在淋巴结中发现的ILC1s中,在天真的小鼠的周围组织中被描述过。36在最近的研究中,描述了小鼠和人类组织中的ILCreg。2..虽然本研究未评估白细胞介素-β的产生,但人白细胞介素-10和转化生长因子-β均有望产生。2..结合在一起,不同的人ILC亚群可能作为IL-10的来源,它可能以旁分泌或自分泌的方式工作(对于ILC2s),以不同的方式调节ILC 2标志细胞因子的产生。除ILCreg外,活化的ILC1s和ILC2s也可作为IL-10的来源。

令人惊讶的是,未观察到活化的ILC3s产生标志性细胞因子IL-17A和IL-22。由于循环中ILC3s的表型分析显示ILC3as占优势,而不是ILC3b,培养上清液中IL-22(一种典型的ILC3b细胞因子)的缺失并不令人惊讶。本研究表明,虽然循环表型中发现的cKit+CRTH 2-ILC群与ILC 3亚群,特别是ILC 3相似,但这些细胞可能尚未获得外周组织所表现出的特异性,从而产生大量的细胞因子,即IL-17A或IL-22。与未受刺激的ILC 3相比,IL-1β/IL-23激活的ILC 3产生了大量的IFN-γ、TNF-α、IL-13和少量IL-17A。PMA/离子霉素刺激ILC3s时,细胞因子谱相似。这些结果表明,在循环中发现的ILC 3可能在功能上是幼稚的,需要额外的组织特异性信号,或者代表一群多功能的人ILC指定的ILC前体(Ilcp),它们有可能分化为不同的ILC亚群。37..从外周血中分离出的ilcp不能在刺激时产生IL 3标志的细胞因子,但长期暴露于IL-1β/IL-23后,ilcp又可分化为多个ilc亚群。37..虽然染色和门控策略的不同使本研究所描述的cKit+群体与iLCP之间很难进行直接的比较,但它们之间确实存在许多相似之处,包括它们产生非签名细胞因子的能力,以及无法在激活后产生大量的ILC 3标志性细胞因子。

为探讨ILC活化的可能机制,对循环中IL-10和TGF-β受体的表达进行了检测。IL-10 Rα和TGF-βR1的基因和蛋白表达均表现为ILC在动态平衡过程中的表达。而IL-20Rα作为IL-10超家族成员IL-19和IL-24的一种常见信号元件,其mRNA和蛋白水平在稳态条件下不容易在循环中检测到。

体外对IL-10和TGF-β暴露后细胞因子产生的分析,由于频率较低,仅以较丰富的亚群(ILC1s和ILC2s)而非ILC3s为限。TGF-β同时激活ILC1s后,IL-1标志细胞因子的产生明显降低,但在IL-10存在时未观察到这种作用。相反,IL-10能抑制IL-2的活化和细胞因子的产生,而TGF-β的作用不明显。IL-10Rα表达强度和阳性细胞数虽无显著差异,但IL-10对IL-1s和IL-2调节细胞因子生成的能力有显著差异。最近的研究表明,小鼠ILCreg选择性地抑制肠道ILC1s和ILC3s的激活,而不抑制ILC2s的表达,而ILC2s不表达。Il10rb2..ILCreg衍生IL-10的差异效应表明IL-10受体表达在ILC亚群上的变化取决于组织特异性或激活后的变化。还应进行其他研究,以确定各种免疫调节受体的表达是否在ILC激活时发生变化。

这些数据表明,外周血中发现的ILC1s和ILC2s在很大程度上能够对适当的刺激作出反应,即ILC激活细胞因子,导致标志性细胞因子的分泌以及IL-10的产生。考虑到所有人类ILC子集的异质性30,35与细胞因子刺激后相比,PMA/离子霉素刺激显示的所有ILC亚群的细胞因子谱比以前观察到的更广泛,这也就不足为奇了。从外周血中分离出的IL C 3在活化时表现出较低的分化状态,导致ILC 1和IL 2相关的细胞因子产生异常。了解循环中人白细胞介素C亚群的频率和功能能力对于了解这些细胞在稳态和各种炎症状态下的功能是至关重要的。此外,这些发现提供了一个完整的了解如何调节白细胞介素-10和转化生长因子-β独立发挥作用的程度。这些发现可能对人类疾病有重要的临床意义,在这些疾病中,ILCs不受控制地产生细胞因子可能是有害的。



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